- Trang Chủ
- Công nghệ - Môi trường
- Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây keo lai phân lập được ở Xuân Mai, Chương Mỹ - Hà Nội
Xem mẫu
- TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP
.................oo0oo...................
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
T ỂN ỌN NG N Ứ T Ố ỦNG Ạ N
Ả N NG N ẤT NG N ỐNG NẤ G ỆN
TRÊN CÂY KEO N Ậ ĐƢ Ở XUÂN MAI
ƢƠNG Ỹ - HÀ N I
NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ : 7420201
Giáo viên hướng dẫn : Th.s Nguyễn Thị Minh Hằng
Sinh viên thực hiện : Bùi Văn Tuấn
Mã sinh viên : 1453071774
Lớp : K59B – CNSH
Khóa học : 2014 - 2018
Hà Nội, 2018
- LỜI CẢ ƠN
Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận đƣợc rất
nhiều sự động viên, khích lệ cũng với sự hƣớng dẫn nhiệt tình và chu đáo của
các cô, chú, anh chị và cán bộ phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh
Hóa sinh, thuộc Viện Công nghệ sinh học m nghiệp Trƣờng Đại học Lâm
nghiệp Việt Nam.
Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn s u sắc tới Th.s. Nguyễn Thị
Minh Hằng – GV Viện Công nghệ sinh họcLâm nghiệp Trƣờng Đại học Lâm
nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ bảo hƣớng dẫn giúp đỡ tôi hoàn thành báo
cáo Luận văn tốt nghiệp.
Nhóm tôi cũng ch n thành cảm ơn tập thể cán bộ, công nhân viên Viện
Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam đã
quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành báo cáo một cách
tốt nhất.
Cuối cùng cả nhóm xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã tạo
điều kiện động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện.
Hà Nội, ngày 03 tháng 05 năm 2018
Sinh viên thực hiện
ùi ăn Tuấn
- MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
NH MỤ HIỆU H VI T TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................ 1
HƢỢNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1. Tổng quan về cây keo............................................................................................. 3
1.1.1 Tình hình trồng keo lai tại Việt Nam .................................................................. 3
1.1.2. Các bệnh do nấm hại gây ra trên cây keo lai..................................................... 3
1.2. Giới thiệu về xạ khuẩn ........................................................................................ 5
1.2.1. Vị trí phân loại và sự phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên ............................... 5
1.2.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn .................................................................... 7
1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ............................................................................10
1.3. Phƣơng pháp ph n loại xạ khuẩn ........................................................................11
1.3.1. Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống.......................................................11
1.3.2. Phân loại theo phƣơng pháp hiện đại...............................................................13
1.4. Đại cƣơng về chất kháng sinh..............................................................................13
1.4.1. Chất kháng sinh (Antibiotic) ...........................................................................13
1.4.2. Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh ...............................................................14
1.4.3. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn.....................................................15
1.4.4. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn.............................................16
1.5. Ứng dụng của chất kháng sinh ............................................................................17
1.5.1. Ứng dụng trong y học .......................................................................................17
1.5.2. Ứng dụng trong bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y ......................................18
1.6. Khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật........................................................20
1.6.1. Ƣu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzyme ............................................20
1.6.2. Tuyển chọn các chủng sinh enzyme cao từ tự nhiên ....................................21
1.6.3. Một số enzyme phổ biến có nguồn gốc từ vi sinh vật ..................................22
- hƣơng 2 NGUYÊN IỆU - MỤC TIÊU – NỘI UNG PHƢƠNG PH P
NGHIÊN CỨU.............................................................................................................23
2.1. Nguyên liệu ...........................................................................................................23
2.1.1. Mấu đất ...............................................................................................................23
2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................................23
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất ............................................................................23
2.2. Mục tiêu nghiên cứu .............................................................................................24
2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................24
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .....................................................................................25
2.4.1. Phƣơng pháp ph n lập nấm bệnh .....................................................................25
2.4.2. Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn từ đất ...........................................................25
2.4.3. Phƣơng pháp thuần khiết và bảo quản giống ..................................................27
2.4.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng sinh ...................................................27
2.4.5. Phƣơng pháp lên men thu sinh khối tế bào xạ khuẩn.....................................28
2.4.6. Xác định hoạt tính enzyme của xạ khuẩn bằng phƣơng pháp khuếch tán trên
đĩa thạch ........................................................................................................................29
2.4.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................................29
hƣơng 3 T QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................30
3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn ...................................................................................30
3.1.1. Phân lập xạ khuẩn ..............................................................................................30
3.1.2. Phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu ............................................................31
3.1.3. thuần khiết và lƣu trữ giống XK phân lập đƣợc .............................................33
3.2. Phân lập, thuần khiết và lƣu trữ giống nấm gây bệnh trên cây keo lai ............33
3.2.1. Phân lập nấm gây bệnh .....................................................................................33
3.2.2. Thuần khiết và bảo quản chủng giống.............................................................34
3.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh ................................35
3.3.1. Tuyển chọn sơ bộ ban đầu bằng phƣơng pháp thỏi thạch .............................35
3.3.2. Tuyển chọn các chủng XK có HTKS cao .......................................................37
3.5. Thử nghiệm hoạt tính enzyme ngoại bào của 2 chủng XK tuyển chọn ..........41
3.5.1. Xác định hoạt tính của các loại enzyme ngoại bào ........................................41
- 3.6. Nghiên cứu đặc điểm hình thái 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính
enzyme cao ................................................................................................................42
3.6.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của 2 chủng XK tuyển chọn ...........................42
3.6.2. Quan sát đặc điểm hình thái và cuống sinh bào tử của một số chủng xạ
khuẩn dƣới k nh hiển vi ...............................................................................................43
K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ....................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
- N Ụ Ệ Ữ T TẮT
CFU Colony Forming Unit
BVTT Bảo vệ thực vật
GI Môi trƣờng Gause I
VSV Đ Vi sinh vật kiểm định
HSKS Hệ sợi kh sinh
HSCC Hệ sợi cơ chất
TB Tế bào
VSV Vi sinh vật
CMC Cacborxyl Methy cellulose
CKS hất háng sinh
HTKS Hoạt t nh kháng sinh
XK Xạ khuẩn
HTSH Hoạt t nh sinh học
VK Vi khuẩn
G Gram
G(+) Gram dƣơng
G(-) Gram âm
- DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. háng sinh đƣợc phát hiện qua các năm [6] ............................................14
Bảng 3.1. Sự phân bố của xạ khuẩn từ các mẫu đất khác nhau ...............................30
Bảng 3.2. Số lƣợng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu...........................31
Bảng 3.3 HTKS của 27 chủng XK với 3 chủng nấm LPT1, LPT2 và LPT3 ........35
Bảng 3.4. HTKS của 27 chủng xạ khuẩn theo nhóm màu .......................................36
Bảng 3.5. HTKS của 2 chủng XK tuyển chọn bằng phƣơng pháp thỏi thạch ......37
Bảng 3.6 HTKS của 2 chủng X đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng GI lỏng ở các
khoảng thời gian khác nhau ........................................................................................38
Bảng 3.7. Hoạt tính enzyme của 2 chủng XK ...........................................................41
Bảng 3.8. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 2 chủng XK tuyển chọn ...................43
Bảng 3.9: Kết quả quan sát cuống sinh bảo tử và hình dạng bào tử của 2 chủng
XK tuyển chọn (dƣới HV trƣờng ở vật kính X40) ................................................44
- DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Khuẩn lạc xạ khuẩn [44]............................................................................... 7
Hình 1.2. Hình dạng cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng Streptomyces
cinereoruber subp [6] ..................................................................................................10
Hình 3.1. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu ......................................32
Hình 3.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của một số chủng XK theo nhóm màu 32
Hinh3.3 Một số chủng X đƣợc thuần khiết ...........................................................33
Hình 3.4: Nấm bệnh ph n lập trên môi trƣờng P ................................................34
Hình 3.5: ác chủng nấm bệnh đã đƣợc thuần khiết ................................................34
Hình 3.6 HTKS của chủng xạ khuẩn X ĐV12 lên 3 chủng nấm gây bệnh..........39
Hình 3.7 HTKS của chủng xạ khuẩn X Đ 9 lên 3 chủng nấm gây bệnh............39
Hình 3.8. HTKS của 2 chủng XK kháng nấm hại cấy keo lai ................................40
Hình 3.9. Hoạt tính enzym của dịch lên men 2 chủng X đã tuyển chọn .............42
- ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một nƣớc nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa ẩm lƣợng
mƣa lớn, nền nhiệt độ và độ ẩm không khi cao là điều kiện hết sức thuận lợi
cho vi sinh vật phát triển trong đó có rất nhiều các loại vi sịnh vật có hại gây
ảnh hƣởng tới đời sống con ngƣời và đặc biệt là với quá trình sản xuất nông
nghiệp. Có rất nhiều vi sinh vật gây bệnh cho động vật, thực vật và theo ghi
nhận hàng năm g y thiệt hại lớn cho ngành sản xuất nông – lâm – ngƣ nghiệp.
Để giảm thiểu sự nguy hại của vi sinh vật gây bệnh chúng ta đã sử dụng 1
lƣợng lớn chất bảo vệ thực vật hóa học tuy đem lại hiệu quả nhanh và tức
thời xong hệ lụy của nó để lại không hề nhỏ. Các chất độc hóa học khó tan,
lắng đọng, gây ô nhiễm nguồn nƣớc không kh đất... ảnh hƣởng xấu tới cuộc
sống con ngƣời và sinh vật.
Chính vì vậy tại Hội nghị tƣ vấn khu vực h u Thái Bình ƣơng của
F O năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của trƣơng trình
IPM (Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lƣợc là sử dụng tác nhân sinh học
để hạn chế sự phá hoại của vi sinh vật gây bệnh. Một trong những hƣớng giải
quyết tối ƣu đƣa ra là sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng sinh chất
kháng sinh, chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Xạ khuẩn là một trong các
chủng vi sinh vật sinh kháng sinh đƣợc quan t m hàng đầu, bởi khả năng sinh
chất kháng sinh với hàm lƣợng lớn đa dạng và hoạt tính cao. Trong tổng số
các chất kháng sinh đƣợc ghi nhận sinh ra từ vi sinh vật thì có tới 80% là do
xạ khuẩn, trong số đó có những kháng sinh có khả năng kháng nấm gây bệnh
Keo lai là tên gọi viết tắt của giống lai tự nhiên giữa hai loài keo tai
tƣợng (Acacia mangium) và keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Giống lai
này đƣợc Messrs Hepbum và Shim phát hiện năm 1972 trong những hàng cây
trồng ven đƣờng. Năm 1978 khi xem xét các mẫu tiêu bản tại phòng tiêu bản
thực vật ở Queensland ( ustralia) Pedkey đã xác nhận đó là giống lai tự nhiên
giữa keo tai tƣợng và keo lá tràm. Trong tự nhiên keo lai cũng đƣợc phát hiện
ở Papu NewGuinea (Turn bull,1986; Grinfin, 1988)[27], eo lai đã đƣợc
1
- nghiên cứu nhân giống thành công bằng hom (Griffin, 1991). Năm 1996 diện
tích trồng cây Keo lai khoảng 15.000ha thì đến hết năm 2004 diện tích trồng
c y eo lai đã hơn 127.000ha đến nay ƣớc tính diện tích trồng Keo lai
khoảng 200.000ha. Nhƣng bên cạnh đó hàng năm nấm g y bệnh trên c y keo
lai g y hậu quả rất nặng nề ảnh hƣởng lớn tới năng suất cũng nhƣ chất lƣợng
sản phẩm c y giống, việc sử dụng thuốc hóa học BVTT gây ảnh hƣởng xấu
tới sức khỏe con ngƣời, vật nuôi và môi trƣờng sống. Vì vậy việc sử dụng
các chế phẩm sinh học từ VSV là rất cần thiết và việc tìm kiếm các chủng xạ
khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm g y bệnh thực vật có tầm
quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật x y dựng một nền
nông nghiệp an toàn và bền vững.
Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên theo xu hƣớng của công nghệ
sinh học thế giới hiện nay cũng nhƣ để góp phần khai thác nguồn lợi VSV
phong phú của khu vực Xuân Mai tôi tiến hành thực hiện đề tài : “Tu n
họn v n hiên u ts h n hu n h năn sinh hất hán
sinh h n nấ ệnh trên o i ph n p ư Xuân Mai -
Chươn Mỹ - Hà N i"
2
- Ƣ NG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây keo
1.1.1 Tình hình trồng keo lai t i Việt Nam
Keo lai là tên gọi viết tắt của giống lai tự nhiên giữa hai loài keo tai
tƣợng (Acacia mangium) và keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Giống lai
này đƣợc Messrs Hepbum và Shim phát hiện năm 1972 trong những hàng cây
trồng ven đƣờng. Năm 1978 khi xem xét các mẫu tiêu bản tại phòng tiêu bản
thực vật ở Queensland ( ustralia) Pedkey đã xác nhận đó là giống lai tự nhiên
giữa keo tai tƣợng và keo lá tràm. Trong tự nhiên keo lai cũng đƣợc phát hiện
ở Papu NewGuinea (Turn bull,1986; Grinfin, 1988) [27]
Hiện nay keo lai đƣợc trồng rất nhiều quốc gia trên thế giới : Australia,
Papua new Guinea va Indonexia , Malaixia, Philippin phù hợp với nhiều ñiều
kiện sinh thái, cây phát triển nhanh, trồng dễ sống, trong một chu kỳ cho một
sinh khối lớn hơn các loài keo khác và chất lƣợng gỗ cũng đẹp.
Sinh trƣởng và sản lƣợng: Qua các số liệu khảo nghiệm và trồng rừng
thực tế thì sinh trƣởng c y keo lai sinh trƣởng rất nhanh và cho sinh khối lớn
hơn rất nhiều so với các loài cây keo bố mẹ và các giống keo lai khác.
Những giống đã qua chọn lọc và khảo nghiệm có thể đạt năng suất 18 -
25 m3/ha/năm ở các tỉnh miền Bắc, 30 - 40m3/ha/năm ở các tỉnh Đông Nam
Bộ [27]. Keo lai có khả năng cố định đạm và khả năng cải tạo đất cao
hơn eo tai tƣợng và Keo lá tràm, phù hợp với điều kiện đất trống đồi núi
trọc ở nƣớc ta, gỗ keo lai có thể làm nguyên liệu giấy ván dăm sử dụng trong
xây dựng đóng đồ mộc… tăng thu nhập đáng kể cho ngƣời trồng rừng. Vì
thế eo lai đang là nhóm cây có diện tích trồng rừng lớn nhất ở nƣớc ta
những năm gần đ y.
Năm 1996 diện tích trồng cây Keo lai khoảng 15.000ha thì đến hết
năm 2004 diện tích trồng c y eo lai đã hơn 127.000ha đến nay ƣớc tính
diện tích trồng Keo lai khoảng 200.000ha.
1.1.2. Các bệnh do nấm h i gây ra trên cây keo lai
3
- Các bệnh do nấm hại gây ra trên cây keo lai gồm 4 loại bệnh tiêu biểu
ệnh phấn trắng lá keo
o nấm Oidium sp g y ra. Nấm bệnh mọc trên bề mặt lá non chồi non
để hút dinh dƣỡng làm cho lá xoăn lại màu n u vàng khô chết nhƣng lá
không rụng.
Bệnh bắt đầu phát sinh vào tháng 11 nặng nhất là tháng 3 - 4. Trong
điều kiện th ch nghi và thời tiết m u bệnh rất dễ l y lan thành dịch.
Sợi nấm có thể qua đông trên đốm vàng của lá già để năm sau x m
nhiễm lá mới.
ệnh thán thƣ (đốm than)
o nấm Colletotrichum gloeosporioi g y ra. Bệnh phát sinh g y hại
trên lá chủ yếu ở đầu ngọn lá và mép lá.
úc đầu lá mất màu rồi lan rộng dần vào phiến lá vết bệnh có thể làm
khô đến nửa lá. Vết bệnh màu n u xám hoặc n u đen trên bề mặt vết bệnh có
các đốm chấm đen nhỏ lúc trời ẩm có thể thấy nhiều bộ màu hồng.
Trên cành non vết bệnh lõm xuống chung quanh có viền đen và giữa
vết bệnh có các chấm đen nhỏ.
Bệnh g y hại c y keo ở vƣờn ƣơm và rừng trồng làm c y sinh trƣởng
chậm. Bệnh phát triển mạnh vào tháng 3 - 5 tháng 6 giảm dần.
ệnh đen thân
o nấm Macrophomina phaseolina Tassi g y ra. Ban đầu gốc biến
thành màu n u lá mất màu xanh bệnh phát triển dần lên ngọn làm lá khô héo
rũ xuống phần vỏ th n co ngót tầng trong vỏ thối đen xốp hoặc dạng bột.
Trong đó mọc nhiều hạch nấm màu đen. Nấm bệnh có thể x m nhiễm
vào phần gỗ phần tủy gỗ biến thành màu n u đen và lan dần đến phần rễ c y
nhổ c y lên chỉ còn lại phần gỗ.
Trong mùa nắng nóng nhiệt độ mặt đất lên cao phần gốc c y bị tổn
thƣơng tạo điều kiện cho bệnh x m nhập g y hại.
Ở những khu vực t ch tụ nhiều nƣớc tỷ lệ c y bệnh càng tăng lên rõ rệt.
4
- Sau thời tiết mƣa phùn 10 - 15 ngày bệnh bắt đầu phát sinh.
Về sau tăng dần đến tháng 10. Nặng nhất là các tháng 6 7 8.
ệnh nấm hồng
o nấm Corticium salmonicolor Berk & Br g y ra ở những vùng có
lƣợng mƣa cao.
Bệnh thƣờng xuất hiện vào đầu mùa mƣa dấu hiệu đầu tiên bằng mắt
thƣờng cũng dễ dàng nhận thấy có những đám màu trắng xuất hiện trên bề
mặt vỏ th n c y hay cành c y ở ph a bị che bóng thƣờng ở vị tr từ 1/5 đến 1/4
chiều cao của c y t nh từ ngọn.
Đến cuối mùa mƣa lớp màu hồng da cam này nhạt dần màu trở nên
màu trắng bẩn vỏ c y bị nứt ra để lộ một phần gỗ sợi nấm x m nhiễm vào
th n cành c y cũng nhƣ toàn bộ lá của của c y từ chỗ bị nấm x m nhiễm lên
đến ngọn bị héo chết có màu n u và không rụng ngay.
Đỉnh ngọn c y bị chết đổ gẫy từ chỗ gốc c y mọc chồi mới. Trƣờng
hợp nặng toàn bộ c y bị chết.
1.2. Giới thiệu về xạ khuẩn
1.2.1. Vị trí phân lo i và sự phân b x khu n trong tự nhiên
Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc Tenericutes (gồm vi
khuẩn gram dƣơng và xạ khuần, thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu
giới nh n sơ (prokaryota) [35].
Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ
Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ 110 chi và 1000 loài trong đó
có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại đƣợc
xếp vào nhóm XK hiếm [12,43]. Streptomyces đặc biệt nhiều trong đất nơi
chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều các hợp chất hữu cơ bằng các enzyme
ngoại bào. Một phần rất lớn các chất kháng sinh đƣợc sử dụng hiệu quả trong
điều trị có nguồn gốc từ các loài Streptomyces, trong đó đƣợc biết đến nhất là
streptomycin, erythromycin, tetracyclin [41].
Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất đa dạng trong đó đa số sinh
5
- trƣởng hiếu khí và tạo khuẩn ty ph n nhánh tƣơng tự nhƣ nấm. Tên xạ khuẩn
– actinomycete – bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và “mykes” (nấm) và
ban đầu xạ khuẩn đƣợc coi là vi nấm vì chúng sinh trƣởng giống với nấm.
Mạng lƣới phân nhánh của thể sợi thƣờng phát triển ở cả bề mặt cơ chất rắn
(tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong (tạo thành hệ sợi cơ chất) [28]. Đ y
là một trong những đặc điểm để phân loại xạ khuẩn.
Xạ khuẩn là VK G(+) có tỷ lệ G+ cao (>55%) trong N . Đa số xạ
khuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất nƣớc và xác thực
vật. Xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng về mặt sinh thái trong vòng tuần hoàn
tự nhiên. Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó ph n hủy nhƣ
humic acid trong đất [43]. Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng hòa tan lignhin
bằng cách sinh các enzyme thủy phân cellulose, hemicellulose và các
peoxidase ngoại bào [34]. Các chủng xạ khuẩn xuất hiện trong môi trƣờng
giàu chất hữu cơ nhƣ các compost ở cả hai pha ôn hòa (mesophilic) và chịu
nhiệt (thermophilic) [40], và ở cống rãnh nƣớc thải nơi mà các xạ khuẩn chứa
mycolic acid kết hợp với việc tạo thành các bọt khí và váng bọt ổn định đặc
trƣng [38].
Nhìn chung, nhiệt độ ôn hòa 25 - 30º và pH trung t nh là điều kiện
tối ƣu cho xạ khuẩn phát triển. Mặc dầu vậy, nhiều loài đã đƣợc phân lập ở
các môi trƣờng khắc nghiệt ví dụ nhƣ Arthrobacter ardleyensis ƣa lạnh đƣợc
phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 0ºC [28] và
Nocardiopis alkaliphila đƣợc phân lập từ đất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở
pH 9,5 - 10 [31].
6
- 1.2.2. Đặ i m sinh học c a x khu n
1.2.2.1. Đặ i m hình thái
* Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh
mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống sinh bào tử khi hình thành bào
tử). Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn nấm mốc với đƣờng k nh thay đổi trong
khoảng 0,2 - 1 µm đến 2 - 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [11,13].
ch thƣớc và khối lƣợng hệ sợi thƣờng không ổn định và phụ thuộc
vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Đ y là một trong những đặc điểm phân biệt
khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có
đƣờng kính rất lớn thay đổi từ 5 - 50 µm, dễ quan sát bằng mắt thƣờng.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thƣờng chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi,
dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc rất đa
dạng: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện
ngoại cảnh.
ch thƣớc và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và tùy
vào điều kiện nuôi cấy nhƣ thành phần môi trƣờng, nhiệt độ độ ẩm… Đƣờng
kính của mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 - 2 mm nhƣng cũng có khuẩn lạc đạt tới
đƣờng kính 1cm hoặc lớn hơn.
Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tƣơng
đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.
Hình 1.1. Khuẩn lạc xạ khuẩn [12]
7
- Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản
phẩm trong quá trình trao đổi chất nhƣ: S độc tố, enzyme, vitamin, axit
hữu cơ… có thể đƣợc t ch lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay đƣợc
tiết ra môi trƣờng.
* Khuẩn ty
Trên môi trƣờng cơ chất đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2
loại: một loại cắm sâu vào trong môi trƣờng gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ
chất - substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dƣỡng. Một loại
phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial
mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản.
Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhƣng cũng có loại (nhƣ chi
Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi kh sinh. hi đó HS S vừa làm nhiệm vụ sinh
sản vừa làm nhiệm vụ dinh dƣỡng [8].
1.2.2.2. Cấu t o tế bào x khu n
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tƣơng tự VK G(+), toàn bộ cơ thể chỉ là một tế
bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh
chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lƣới, dày 10 – 20 nm có cấu
tạo tƣơng tự thành tế bào của VK G(+), thành phần chủ yếu là peptidoglucan
tạo nên một lớp vách tế bào tƣơng đối vững chắc. Ph n t ch dƣới kính hiển vi
điện tử thành tế bào XK gồm ba lớp: lớp ngoài cùng dày 60Aº, lớp trong và
lớp giữa dày 50 º. ăn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào xạ khuẩn
đƣợc chia thành 4 nhóm chính [5,9]:
Nhóm I: Thành phần ch nh của thành tế bào là axit - 2,6 diaminopimelic
(L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.
Nhóm II: Thành phần ch nh của thành tế bào là axit meso - 2,6
diaminopimelic (meso - ADP) và glyxin. Thuộc nhóm này gồm các chi:
Micromonospora, Actinoplanes, Ampullarriella…
8
- Nhóm III: Thành phần ch nh của thành tế bào là axit meso - 2,6 -
diaminopimelic. Thuộc nhóm này có các chi: Dermatophilus,
Geodermatophilus, Frankia…
Nhóm IV: Thành phần ch nh của thành tế bào là axit meso - 2,6 -
diaminopimelic arabinose và galactose. Thuộc nhóm này gồm các chi:
Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia…
Thành tế bào có kết cấu dạng lƣới có tác dụng duy trì hình dáng của
khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Ngoài ra thành tế bào X có thể cho phép nhiều
chất nhƣ: hất kháng sinh axit amin và nhiều hợp chất khác có k ch thƣớc
tƣơng đối lớn đi qua một cách dễ dàng. ác chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng
cũng thẩm thấu một cách chọn lọc qua thành tế bào.
Màng sinh chất là lớp tế bào nằm ngay sát dƣới thành tế bào dày
khoảng 7 5 - 10 nm chức năng chủ yếu là điều hòa sự hấp thu các chất dinh
dƣỡng vào tế bào tham gia vào quá trình hình thành bào tử. Tế bào chất của
X gồm một số thành phần chủ yếu nhƣ: thể nh n không bào và thể ẩn
nhập.
Nh n của tế bào X không có cấu trúc điển hình chỉ là nhiễm sắc thể
không có màng bao bọc. hi còn non toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc
thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty.
1.2.2.3. Sự hình th nh o tử hu n
Bào tử xạ khuẩn đƣợc hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn
ty khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Đ y là cơ quan sinh sản đặc trƣng cho
xạ khuẩn. Trên mỗi cuống sinh bào tử mang 30 - 100 bào tử đôi khi có thể
mang tới 200 bào tử. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm
quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn.
Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lƣợn sóng (RF),
dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có
hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của
cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thƣờng có hình trụ,
9
- ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành
dạng lông [10].
Bào tử xạ khuẩn đƣợc bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu
protein với độ dày khoảng 300 - 400Aº chia làm 3 lớp. Các lớp này tránh cho
bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh nhƣ nhiệt độ,
pH… Hình dạng k ch thƣớc chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những
tính trạng tƣơng đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại
xạ khuẩn. Tuy nhiên những tính trạng này có thể có những thay đổi nhất định
khi nuôi cấy trên môi trƣờng có nguồn nitơ khác nhau [14].
Hình 1.2. Hình d n u n sinh o tử v ề ặt o tử h n
Streptomyces cinereoruber subp [6]
1.2.3. Đặ i m sinh lý, sinh hóa
XK thuộc nhóm sinh vật dị dƣỡng, chúng sử dụng đƣờng rƣợu, axit hữu cơ ,
lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, muối nitra,
muối amoon ure amino axit pepton để làm nguồn nito. Tuy nhiên khả năng
10
- hấp thụ các chất này không giống nhau ơ các loài hay các chủng khác nhau.
Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu kh ƣa ẩm, một số t ƣa nhiệt, nhiệt độ thích
hợp cho X sinh trƣởng là 25 - 300C. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ƣu cho sinh
tổng hợp S thƣờng chỉ nằm trong khoảng 18 - 280 . Độ ẩm thích hợp đối
với X dao động trong khoảng 40 – 50%, giới hạn pH trong khoảng 6,8 – 7,5
XK không có giới tính [44]. Xạ khuẩn có khả năng hình thành enzym và các
S nên đƣợc ƣớng dụng vào nhiều lĩnh vực của đời sống .
Để phân loại xạ khuẩn đến loài ngƣời ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh
lý sinh hóa khác nhƣ khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nito, nhu cầu
các chất k ch th ch sinh trƣởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ
thống enzym. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ƣu khả năng chịu
muối và các yếu tố khác của môi trƣờng, mỗi quan hệ với chất kìm hãm sinh
trƣởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với CKS,
khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chất đặc trƣng khác cảu
XK[23].
1.3. Phươn pháp ph n o i x khu n
1.3.1. Phân lo i th o phươn pháp tru ền th ng
Trong các đặc điểm hóa phân loại, thành phần hóa học của thành tế bào đƣợc
coi là đặc điểm quan trọng nhất. ác đặc điểm hóa phân loại khác nhƣ thành
phần đƣờng, menaquinone, photpholipit, axit béo của tế bào và tỉ lệ GC trong
ADN của genom cũng mang t nh đặc
trƣng cho loài và có ý nghĩa quan trọng trong phân lạo XK.
ác đặc điểm sinh lý sinh hóa thƣờng đƣợc kết hợp sử dụng trong phân loại
XK là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nito, nhu câu của các chất
k ch th ch sinh trƣởng, khả năng ph n hủy các chất khác nhau nhờ hệ thống
enzym. Bên cạnh đó các chỉ tiêu khác nhu mối quan hệ với pH, nhiệt độ, khả
năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trƣờng, mối quan hệ với chất kìm
hãm sinh trƣởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với
11
- CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chất đặc trƣng khác
của XK cũng đƣợc tiến hành ph n t ch đồng thời [11]
12
nguon tai.lieu . vn