1. Trang Chủ
  2. Ngư nghiệp
  3. Khảo sát tính kháng khuẩn của cao chiết quế (Cinnamomum verum) và gừng (Zingiber officinale rose) tách chiết bằng ethanol đối với các chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae phân lập trên cá rô phi giống (Oreochromis spp.)

Khảo sát tính kháng khuẩn của cao chiết quế (Cinnamomum verum) và gừng (Zingiber officinale rose) tách chiết bằng ethanol đối với các chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae phân lập trên cá rô phi giống (Oreochromis spp.)

Vi khuẩn Streptococcus agalactiae được biết đến như là tác nhân gây bệnh và gây chết nghiêm trọng trên nhiều loài cá nước ngọt và nước mặn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát hiệu quả kháng khuẩn đối với hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae được phân lập từ cá rô phi bị bệnh lồi mắt, xuất huyết thu tại thành phố Hồ Chí Minh bởi cao chiết quế và gừng, được tách chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol ở 3 nồng độ riêng rẻ (96%, 72%, 48%) và liên tục (96% tiếp đến 72% và

Thể loại Tài liệu miễn phí Ngư nghiệp

Số trang 12

Ngày tạo 12/29/2020 11:30:47 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 1.02 M

Tên tệp

Tải Khảo sát tính kháng khuẩn của cao chiết quế (Cinna... (.pdf)

Xem mẫu

  1. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT QUẾ (Cinnamomum verum) VÀ GỪNG (Zingiber officinale Rose) TÁCH CHIẾT BẰNG ETHANOL ĐỐI VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN Streptococcus agalactiae PHÂN LẬP TRÊN CÁ RÔ PHI GIỐNG (Oreochromis spp.) Đoàn Văn Cường 1*, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh 1, Mã Tú Lan1, Nguyễn Thành Nhân1 TÓM TẮT Vi khuẩn Streptococcus agalactiae được biết đến như là tác nhân gây bệnh và gây chết nghiêm trọng trên nhiều loài cá nước ngọt và nước mặn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát hiệu quả kháng khuẩn đối với hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae được phân lập từ cá rô phi bị bệnh lồi mắt, xuất huyết thu tại thành phố Hồ Chí Minh bởi cao chiết quế và gừng, được tách chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol ở 3 nồng độ riêng rẻ (96%, 72%, 48%) và liên tục (96% tiếp đến 72% và 48%). Kết quả cho thấy cao chiết quế trong dung môi ethanol 96% cho đường kính vòng kháng khuẩn 29-34 mm, giá trị MIC = 2 mg/ml, MBC = 8 mg/ml; cao chiết gừng trong dung môi ethanol 96% cho đường kính vòng kháng khuẩn 14-17 mm, giá trị MIC = 1 mg/ml, MBC = 2 mg/ml. Cao chiết quế và gừng trong ethanol 96% là hai loại cao thảo dược tiềm năng có khả năng ứng dụng để phòng trị bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi. Từ khóa: cá rô phi, cao chiết gừng, cao chiết quế, phương pháp ngấm kiệt, Streptococcus agalactiae. I. ĐẶT VẤN ĐỀ một trong hai loài vi khuẩn chính ảnh hưởng đến Trên cá rô phi, bệnh lồi mắt, xuất huyết việc sản xuất cá rô phi trên thế giới, loài còn lại thường xuất hiện vào mùa mưa và các tháng là S. iniae (Evans và ctv., 2006). Nghiên cứu của giao mùa ở Đồng bằng sông Cửu Long và Brian cho thấy, bệnh do vi khuẩn Streptococcus Đông Nam Bộ, với tỷ lệ chết cao (gần như gây ra trên cá rô phi ở các nước Châu Á như: 100% từ khi phát hiện bệnh), gây thiệt hại Trung Quốc, Việt Nam, Indonesia, Philippines, kinh tế nghiêm trọng cho người nuôi, bệnh Thái Lan là S. agalactiae type 2 (Brian Sheehan này được xác định do vi khuẩn Streptococcus và ctv., 2009). Chủng vi khuẩn S. agalactiae agalactiae gây ra (Đặng Thị Hoàng Oanh và type 2 cũng được phân lập từ các mẫu cá rô phi ctv., 2012). Vi khuẩn Streptococcus agalactiae đỏ có dấu hiệu xuất huyết và phù mắt tại Việt được biết đến như là tác nhân gây bệnh và gây Nam (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2012). chết nghiêm trọng trên nhiều loài cá nước ngọt Hiện nay, giải pháp phổ biến để phòng trị và nước mặn như: cá hồi vân (Oncorhynchus bệnh nhiễm khuẩn trên cá là sử dụng kháng sinh mykiss), cá rô phi (Oreochromis sp.), cá cam hay hóa chất. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng (Seriola quinquerodiata), cá phèn (Upeneus sinh, hóa chất vẫn còn bộc lộ nhiều bất cập, moluccensis), cá chim (Stromateoides). Tháng gây nên hiện tượng kháng kháng sinh ở các 7-9/2009, dịch bệnh xảy ra gây chết với tỷ lệ cao loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản, 86,5-100% tại Hà Nội, Hưng Yên, Hải Dương, và truyền các gene kháng kháng sinh cho các Hải Phòng, Quảng Ninh, Bắc Ninh và Hà Giang loài vi khuẩn trong môi trường và vi khuẩn gây (Viện NCNT Thuỷ sản I, 2017). S. agalactiae là bệnh trên người. Ngoài ra, việc tích lũy kháng 1 Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản II * Email: vancuongdisaqua@gmail.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019 3
  2. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II sinh trong động vật thủy sản có thể gây hại cho sp. trên cá rô phi (Oreochromis spp.) (Abutbul môi trường và cho người tiêu thụ. Vì vậy, các và ctv., 2004). Nghiên cứu thực hiện trên cá rô nhà khoa học đang tìm kiếm các giải pháp thay phi lai (O. niloticus x O. aureus) trong 4 tuần thế (vaccine, probiotic…) trong việc kiểm soát với khẩu phần ăn có 0,5% tỏi (Allium sativum) bệnh nhiễm khuẩn trong nuôi trồng thủy sản. cho thấy có tác dụng nâng cao miễn dịch và Trong thời gian gần đây, việc sử dụng thảo dược tính đề kháng bệnh của cá (Ndong và ctv., trong phòng trị bệnh nhiễm khuẩn đang ngày 2007). Dịch chiết bằng nước của lá chùm ngây càng trở nên phổ biến do những ưu điểm: dễ tìm (Moringa oleifera) có tác dụng kháng vi khuẩn kiếm, giá thành thấp, hoạt tính kháng khuẩn cao, S. agalactiae type 2 mạnh nhất, theo sau là chiết có khả năng kích thích hệ miễn dịch tự nhiên xuất bằng dung môi Chloroform của lá sầu đâu của vật chủ, thân thiện với môi trường, không (Azadirachta indica) (Kamble và ctv., 2014). gây nên hiện tượng đề kháng thuốc và đặc biệt Dịch chiết vỏ quế (Cinnamomum verum), củ đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm đối với con tỏi (Allium sativum), hoa đinh hương (Eugenia người (Rattanachaikunsopon và ctv., 2009). caryphyllus), cỏ xạ hương (Thymus vulgaris) Một số nghiên cứu đã chứng minh hoạt tính cũng có tác dụng kháng S. agalactiae (Alsaid và kháng khuẩn của các loại thảo dược: cây xương ctv., 2010). Tác dụng kháng S. agalactiae của cá (Stella aquatic), hoa móc tay (Impatiens 6 loại dịch chiết thảo dược muồng trâu (Cassia biflora), cây anh thảo (Oenothera biennis), cây alata L), măng cụt (Garcinia mangostana), ngải cứu (Artemisia vulgaris) và cây kim ngân xuyên tâm liên (Andrographis paniculata), ổi (Lonicera japonica) giúp kháng lại các bệnh do (P. guajava), duối nhám (S.asper), tỏi (Allium vi khuẩn và virus ở cá (Shangliang, 1990). Dịch sativum) trong 3 dung môi khác nhau (nước, chiết của cây ổi (Psidium guajava) có thể kiểm 95% ethanol, methanol) trên cá rô phi, kết quả soát bệnh xuất huyết do Aeromonas hydrophila cho thấy dịch chiết bởi dung môi nước của gây ra trên cá nước ngọt (Pachanawan và ctv., xuyên tâm liên (Andrographis paniculata) có 2008). Các nghiên cứu về cây dược liệu cũng tác dụng kháng S. agalactiae mạnh nhất trong cho thấy rằng, củ hành tím (Allium ascalonicum) số 6 loại thảo dược, với đường kính vòng vô có tác dụng kháng viêm và tiêu diệt các vi khuẩn đạt 27,5 mm và giá trị MIC đạt 31,25 khuẩn lây nhiễm (bao gồm cả vi khuẩn E.coli và µg/ml. Bên cạnh đó, dịch chiết bởi ethanol của Salmonella), giúp tăng cường miễn dịch và được ổi (P. guajava) và dịch chiết bởi nước của cây xem như là loại thảo dược chứa các chất kháng duối nhám (S. asper) cũng có tác dụng kháng sinh tự nhiên cực kỳ an toàn và hiệu quả. Đối S. agalactiae mạnh. Kết quả thí nghiệm in vivo với nhóm vi khuẩn Streptococcus, đã có nhiều cho thấy khi cá rô phi ăn thức ăn có bổ sung nghiên cứu tìm ra một số loại thảo dược có tác bột lá xuyên tâm liên tách chiết bằng dung môi dụng kháng Streptococcus cũng như xác định nước, đã giúp làm giảm tỉ lệ chết của cá khi gây được loại dung môi tạo dịch chiết đạt hiệu quả nhiễm với S. agalactiae (Rattanachaikunsopon kháng Streptococcus mạnh nhất. Dịch ép của cỏ và ctv., 2009). lào (Eupatorium odoratum) đã được đánh giá Trước đây nhóm đã khảo sát trên mười loại là có khả năng kháng khuẩn đối với vi khuẩn dược liệu bằng phương pháp ngâm trong dung Streptococcus sp. gây bệnh trên cá rô phi vằn. môi nước, ethanol 96% và methanol 96%, trong Dịch chiết lá hẹ (Allium tuberosum) có khả năng đó quế và gừng ngâm trong ethanol và methanol kháng vi khuẩn Streptococcus sp. cao, trong đó có tác dụng kháng Streptococcus agalactiae nước, ethanol và methanol là các loại dung môi cao nhất. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếp cho dịch chiết có tác dụng kháng S.agalactiae tục khảo sát tính kháng khuẩn của 2 loại cao cao (Trương Thị Mỹ Hạnh, 2008). Dịch chiết chiết thảo dược (gừng và quế) tách chiết bằng lá cây hương thảo (Rosmarinus officinalis) có phương pháp ngấm kiệt trong dung môi ethanol hiệu quả trị bệnh nhiễm khuẩn do Streptococcus với các nồng độ khác nhau nhằm tìm ra nồng độ 4 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019
  3. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II tối ưu cho tách chiết đối với hai chủng vi khuẩn chế, thái lát mỏng và sấy lạnh ở 40oC (Tủ sấy Streptococcus agalactiae CC-2.1 và Q9-8.1 thu lạnh, sản xuất ở Việt Nam) cho đến khi đạt độ từ cá rô phi có biểu hiện xuất huyết, lồi mắt ở ẩm < 12%, được xay mảnh nhỏ bằng máy xay thành phố Hồ Chí Minh. khô (Xinganbangle-880Y) và làm ẩm bằng loại II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP dung môi ngấm kiệt, sau đó cho vào bình NGHIÊN CỨU ngấm kiệt ngâm 24 giờ, sau 24 giờ sử dụng 30 lít ethanol (Công ty CP dược phẩm OPC) cho 2.1. Phương pháp thu mẫu, phân lập và ngấm kiệt 1kg thảo dược khô, tốc độ rút dịch định danh vi khuẩn chiết 5 ml/phút. Hai phương pháp thu dịch chiết Thu mẫu gan, thận, lách trên cá rô phi giống khác nhau được thực hiện. đang bị bệnh lồi mắt, xuất huyết nuôi ao ở Trung + Mỗi loại thảo dược được ngấm kiệt với tâm Giống thủy sản và cây trồng tại xã Tân An ethanol 96%, dịch chiết thu được để riêng ra, Hội, huyện Củ Chi và bè nuôi tại phường Long bã thảo dược tiếp tục ngấm kiệt với ethanol Trường, quận 9, Tp. Hồ Chí Minh. Thu những 72% rồi ethanol 48%. Cô quay dịch chiết của con cá còn sống, có các triệu chứng bệnh tích: từng phân đoạn và tổng của 3 phân đoạn, thu lồi mắt, xuất huyết (hậu môn, thân, đầu, nắp được 4 loại cao chiết khác nhau đối với mỗi mang,…), mổ cá và ghi nhận các dấu hiệu bệnh loại thảo dược. lý bên trong cơ thể cá. Dùng que cấy để lấy mẫu bệnh phẩm trên các nội tạng gan, thận, lách. Mẫu + Mỗi loại thảo dược được ngấm kiệt riêng bệnh phẩm được cấy trên đĩa môi trường Brain- rẽ với ethanol 96%, ethanol 72%, và ethanol Heart Infusion Agar (110493, Merck) để phân 48% ("Assessment report on Hypericum lập vi khuẩn và Blood Agar (110886, Merck) để perforatum L., herba," 2018). Cô quay dịch xác định các dạng tan huyết, trong đó tan huyết chiết thu được từ mỗi nồng độ ethanol và tổng dạng β là tan huyết hoàn toàn xung quanh khuẩn của 3 phân đoạn, thu được 4 loại cao chiết khác lạc, tan huyết dạng α là chỉ tan huyết một phần nhau đối với mỗi loại thảo dược. và có màu xanh hoặc nâu xung quanh khuẩn Các cao chiết được cô bằng máy cô quay lạc (Buxton, 2005). Đĩa cấy được ủ ở nhiệt độ (Haake Phoenix II - C25P - Thermo) ở nhiệt 35°C trong tủ ấm (Memmert-UFB 400) trong độ 60oC các dịch chiết tương ứng cho đến khi 24-48 giờ. Hình dạng, kích thước của các khuẩn 99% dung môi được loại bỏ. Các cao chiết dạng lạc phân lập từ mẫu bệnh được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram (11885, Merck). Sử dụng test kit API 32 Strep (BioMerieux, Pháp) để test sinh hóa và xác định kết quả bằng phần mềm APIweb (bio Mérieux SA, France). Bên cạnh đó, vi khuẩn được gửi đến Công ty TNHH Thương mại & Dịch vụ Nam Khoa, quận 7, Tp. Hồ Chí Minh định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA và so sánh với trình tự trên ngân hàng gen NCBI. 2.2. Phương pháp chiết xuất dược liệu Sử dụng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol để chiết xuất dược liệu (Nguyễn Thượng Dong và ctv., 2008). Hai loại thảo dược: Vỏ quế (mua ở Viện Y Học Dân Tộc Tp. Hồ Chí Minh) và củ gừng (mua ở chợ Bà Chiểu, quận Bình Thạnh, Tp. Hồ Chí Minh), được sơ Hình 1: Hệ thống ngấm kiệt TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019 5
  4. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II sệt được bảo quản lạnh ở -200C để sử dụng cho có hiệu quả kháng khuẩn mạnh bằng phương các thí nghiệm thử khả năng kháng khuẩn bằng pháp đĩa giấy khuếch tán. Các cao chiết thảo phương pháp đĩa giấy khuếch tán, cũng như xác dược được pha loãng với dung môi tương ứng định nồng độ ức chế tối thiểu (Yasuko Sekita và theo dãy 08 nồng độ bao gồm 32.000, 16.000, ctv.,) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC). 8.000, 4.000, 2.000, 1.000, 500 và 250 µg/ml, 2.3. Phương pháp đánh giá khả năng mỗi nồng độ lập lại trong 4 giếng. Dịch khuẩn kháng khuẩn của các cao chiết thảo dược S. agalactiae được pha trong ống nghiệm chứa 2.3.1. Phương pháp đĩa giấy khuếch tán nước muối sinh lý 0,85% để đạt mật độ 108 (Ahn và ctv., 1994) CFU/ml (tương ứng với Mc Farland 0,5), sau đó được pha loãng trong nước muối sinh lý để Tẩm 20 µl cao chiết thảo dược (0,33 g/ml) đạt mật độ cuối cùng là 104 CFU/ml, sau khi vào các đĩa giấy vô trùng có đường kính 6 mm, pha loãng sẽ trải đĩa BHI agar (110886, Merck) ở nghiệm thức đối chứng âm tẩm ethanol 96%, để kiểm tra nồng độ vi khuẩn thực tế. Cho vào 72% và 48%, mỗi loại được tẩm vào 6 đĩa giấy, các giếng 100 µl dịch khuẩn + 100 µl thảo dược đặt các đĩa giấy này vào tủ vô trùng trong 15 phút cho cao chiết khuếch tán vào đĩa giấy. Ở để đạt nồng độ cuối cùng theo dãy nêu trên, mật nghiệm thức đối chứng dương, các đĩa giấy được độ vi khuẩn cuối cùng trong mỗi giếng là 5 x tẩm ba loại kháng sinh thương mại là amoxillin 103 CFU/ml. Các giếng đối chứng âm chỉ chứa (10 µg), doxycycline (30 µg) và florfenicol (30 200µl môi trường BHI Broth (110493, Merck). µg) (Nam Khoa). Chủng S. agalactiae được Các giếng đối chứng dương chứa 100 µl BHI + nuôi cấy trong môi trường Brain Heart Infusion 100 µl dịch khuẩn S. agalactiae. Ủ các đĩa 96 Broth (110493, Merck) trong 24 giờ, sau đó so giếng này ở 300C, sau 48 giờ cho 20 µl thuốc với ống Mc Farland để được mật độ 108 CFU/ thử resazurine (0,01%) (RM125-1G, Himedia) ml (tương ứng ống 0,5), tiếp tục pha loãng 100 vào mỗi giếng. Thuốc thử resazurine có màu lần với nước muối sinh lý để đạt mật độ 106 xanh trong dung dịch, các giếng có vi khuẩn CFU/ml. Hút 1000 µl dịch khuẩn 106 CFU/ml, phát triển sẽ chuyển màu thuốc thử từ xanh tráng đều bằng que thủy tinh tam giác trên mặt sang hồng (Faikoh và ctv., 2014). Giá trị MIC thạch BHI agar (110886, Merck) trong 30 giây là nồng độ thấp nhất của thảo dược tại đó thuốc cho vi khuẩn thấm đều vào mặt thạch. Sau đó thử resazurine không chuyển màu. Để xác định dùng micropipet hút bỏ lượng dung dịch còn giá trị MBC, lấy 100 µl mẫu ở các giếng thuộc dư. Lật úp các đĩa thạch và để trong tủ cấy vô 4 dãy nồng độ liên tiếp, bao gồm dãy nồng độ trùng trong 5 phút cho khô. Đặt các đĩa thạch tại đó xác định giá trị MIC và 3 dãy nồng độ vào tủ mát ở 4oC trong 15 phút để cao chiết có cao hơn liền kề, và trải trên đĩa BHIA. Giá trị thời gian khuếch tán ra đĩa thạch. Sau đó chuyển MBC là nồng độ thấp nhất của thảo dược tại tất cả các đĩa thạch vào ủ trong tủ ấm ở 30oC, đó không có sự phát triển của vi khuẩn trên đo đường kính vòng vô khuẩn tạo thành xung môi trường BHIA sau khi trải đĩa. Các loại cao quanh các đĩa giấy sau 24 giờ (nếu có). Vi khuẩn chiết có giá trị MBC/MIC ≥ 4 được cho là có mẫn cảm với dịch chiết nếu vòng vô khuẩn ≥ 7 khả năng kìm khuẩn, MBC/MIC < 4 được cho mm, vi khuẩn kháng với dịch chiết nếu vòng vô là có khả năng diệt khuẩn. khuẩn
  5. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II III. KẾT QUẢ (Hình 2, 3), được thu thận cho phân lập và định 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn gây bệnh danh vi khuẩn bằng test sinh hóa và giải trình trên cá rô phi tự gen 16S rRNA. Kết quả kiểm tra bằng test API 32 strep (Bảng 1) và xác định kết quả bằng Nghiên cứu đã thực hiện thu 5 mẫu cá rô phần mềm APIweb (bio Mérieux SA, France) phi giống (cá rô phi vằn) nuôi ao tại Trung tâm tất cả 16 mẫu cá bệnh đều bị nhiễm vi khuẩn giống và cây trồng, xã Tân An Hội, huyện Củ Streptococcus agalactiae (Hình 3). Trên môi Chi vào tháng 04/2019 và 11 cá rô phi giống trường thạch BA, khuẩn lạc Streptococcus (cá rô phi vằn) nuôi bè tại phường Long Bình, agalactiae có hình tròn, lồi, màu kem, kích quận 9 vào tháng 05/2019. Các cá thể này đều thước khoảng 1mm, dung huyết dạng β (Hình thể hiện các dấu hiệu bệnh tích điển hình như 5, 6), vi khuẩn nhuộm gram bắt màu xanh tím lồi mắt và xuất huyết ở vây hậu môn, vây lưng (Gram dương), hình tròn, liên kết với nhau tạo Bảng 1: Kết quả phân lập mẫu cá bệnh STT Nơi thu mẫu Số mẫu Số mẫu nhiễm Streptococcus agalactiae 1 Củ Chi 5 5 2 Quận 9 11 11 Hình 2: Cá thu ở Củ chi bị lồi mắt, xuất huyết Hình 3: Cá thu ở quận 9 bị lồi mắt, xuất huyết thành chuỗi dạng liên cầu khuẩn xen kẽ với Quyên và ctv., 2019). những tế bào đơn lẻ. Chúng tôi chọn hai Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục chủng vi khuẩn CC-2.1 (phân lập từ cá 25gr khảo sát khả năng kháng khuẩn của hai loại cao nuôi ao ở Củ Chi) và Q9-8.1 (phân lập từ cá chiết quế và gừng, tách chiết bằng phương pháp 20gr nuôi bè ở Quận 9) để thực hiện các thí ngấm kiệt với dung môi ethanol ở 3 nồng độ nghiệm tiếp theo của nghiên cứu. khác nhau (96%, 72% và 48%). Ở thí nghiệm 1, quá trình tách chiết được thực hiện chỉ với 3.2. Kết quả thử khả năng kháng khuẩn ethanol 96% hoặc lần lượt với 2 hoặc 3 nồng của thảo dược bằng đĩa giấy khuếch tán độ khác nhau của ethanol. Qua Bảng 2 cho thấy Kết quả khảo sát trước đây của nhóm về cao chiết của quế với ethanol 96% có tác dụng hiệu quả kháng khuẩn của 10 loại cao chiết kháng khuẩn mạnh nhất đối với cả hai chủng vi thảo dược tách chiết bằng ethanol 96% và khuẩn với đường kính vòng vô khuẩn từ 32-34 methanol 99,8%, cho thấy cao chiết quế và mm, giá trị này là tương đương so với đường gừng tách chiết bằng ethanol 96% cho hiệu kính vòng vô khuẩn tạo ra bởi ba loại kháng sinh quả kháng khuẩn cao nhất đối với vi khuẩn (35,48 mm đối với amoxillin, 22,47 mm đối với Streptococcus agalactiae (Nguyễn Thị Trúc doxycillin và 35,08 mm đối với florfenicol). TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019 7
  6. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 4. Kết quả xác định sinh hóa với API 32 Strep test Hình 5: Dạng khuẩn lạc của chủng CC-2.1, Hình 6: Dạng khuẩn lạc của chủng Q9-8.1, dung huyết dạng β trên môi trường BA. dung huyết dạng β trên môi trường BA. 8 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019
  7. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Kế đến là cao chiết gừng với ethanol 96% cho khuẩn lớn nhất và cao hơn có ý nghĩa thống kê đường kính vòng vô khuẩn 14-15 mm. Ngoài (p < 0,05) so với tách chiết bằng ethanol ở các ra, cả hai loại cao chiết quế và gừng tách chiết nồng độ thấp hơn và so với cao tổng. bằng ethanol 96% đều cho đường kính vòng vô Bảng 2. Đường kính vòng vô khuẩn (mm) tạo thành xung quanh các đĩa giấy tẩm cao chiết thảo dược, lần lượt tách chiết với ethanol ở các nồng độ khác nhau và sau 24 giờ tiếp xúc với vi khuẩn S. agalactiae, chủng CC-2.1 và Q9-8.1. Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Dung môi S. agalactiae CC-2.1 S. agalactiae Q9-8.1 Gừng Quế Gừng Quế Ethanol 96% 15,12 ± 0,9c 34,23 ± 1,9b 14,88 ± 1,3b 32,67 ± 2,3b Ethanol 96% và 72% 12,65 ± 1,2b 10,73 ± 1,1a 11,20 ± 0,8a 8,5 ± 0,5a Ethanol 96%, 72% và 48% 9,67 ± 0,84a 7,53 ± 3,72a 10,05 ± 0,8a 9,33 ± 1,3a Cao tổng từ 3 phân đoạn 12,17 ± 0,9b 9,62 ± 1,2a 10,30 ± 1,0a 9,52 ± 0,7a trên (tỉ lệ 1:1:1) Số liệu thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Trong cùng một cột, các nghiệm thức có các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Ở thí nghiệm 2, quá trình tách chiết được kính vòng vô khuẩn 16-17 mm. Ở thí nghiệm thực hiện riêng rẽ với một trong ba nồng độ của này, cả hai loại cao chiết quế và gừng tách chiết ethanol (96%, 72% và 48%). Qua Bảng 3 cho bằng ethanol 96% cũng cho đường kính vòng thấy cao chiết của quế với ethanol 96% có tác vô khuẩn lớn nhất và cao hơn có ý nghĩa thống dụng mạnh nhất đối với cả hai chủng vi khuẩn kê (p < 0,05) so với tách chiết bằng ethanol ở với đường kính vòng vô khuẩn từ 29-34 mm, kế các nồng độ thấp hơn và so với cao tổng. tiếp là cao chiết gừng với ethanol 96% có đường Bảng 3. Đường kính vòng vô khuẩn (mm) tạo thành xung quanh các đĩa giấy tẩm cao chiết thảo dược tách chiết với ethanol ở các nồng độ khác nhau và sau 24 giờ tiếp xúc với vi khuẩn S. agalactiae, chủng CC-2.1 và Q9-8.1. Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Dung môi S. agalactiae CC-2.1 S. agalactiae Q9-8.1 Gừng Quế Gừng Quế Ethanol 96% 16,47 ± 1,3c 33,45 ± 1,8b 16,7 ± 0,9c 29,87 ± 0,3b Ethanol 72% 13,77 ± 0,7ab 9,05 ± 0,6a 13,58 ± 0,6b 9,47 ± 0,3a Ethanol 48% 12,58 ± 1,1a 8,53 ± 0,6a 11,85 ± 0,6a 8,95 ± 1,2a Cao tổng từ 3 phân đoạn trên 14,83 ± 0,6b 8,50 ± 1,0a 15,0 ± 1,1c 10,1 ± 0,4a (tỉ lệ 1:1:1) Số liệu thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Trong cùng một cột, các nghiệm thức có các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019 9
  8. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 7: Vòng vô khuẩn của cao chiết gừng đối Hình 8: Vòng vô khuẩn của cao chiết quế đối với chủng CC-2.1 với chủng Q9-8.1 Hình 9: Vòng vô khuẩn của ba loại kháng sinh đối với chủng Q9-8.1 3.3. Kết quả xác định giá trị MIC và MBC của các cao chiết thảo dược Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn khuẩn mạnh đối với chủng vi khuẩn CC-2.1 và của các cao chiết thảo dược ở điều kiện in vitro, chủng vi khuẩn Q9-8.1, chúng tôi chọn hai loại chúng tôi xác định được cao chiết vỏ quế và cao chiết này để xác định giá trị MIC và MBC. gừng trong ethanol 96% có khả năng kháng Kết quả được thể hiện trong Bảng 4. 10 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019
  9. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng 4. Kết quả xác định giá trị MIC và MBC của các cao chiết vỏ quế đối với chủng Streptococcus agalactiae CC-2.1 và Q9-8.1 Loại cao chiết/dung môi Chủng MIC MBC Vi khuẩn (µg/ml) (µg/ml) Vỏ quế, ethanol 96% CC-2.1 2.000 8.000 Q9-8.1 2.000 8.000 Gừng, ethanol 96% CC-2.1 1.000 2.000 Q9-8.1 1.000 2.000 Hình 10: Đĩa 96 giếng xác định giá trị MIC Hình 11: Đĩa 96 giếng xác định giá trị MIC của cao chiết quế (hàng 1-4) và cao chiết gừng của cao chiết quế (hàng 1-4) và cao chiết gừng (hàng 5-8) đối với chủng CC-2.1. (hàng 5-8) đối với chủng Q9-8.1. IV. THẢO LUẬN Lậy – tỉnh Tiền Giang phân lập được vi khuẩn Qua 16 mẫu vi khuẩn thu được từ cá rô phi Streptococcus agalactiae nhưng các chủng vi giống bị bệnh lồi mắt, xuất huyết nuôi tại ao và khuẩn này không gây dung huyết khi nuôi cấy bè tại Tp. Hồ Chí Minh, sau nhuộm gram, test trên môi trường BA. sinh hóa và giải trình tự gen 16S rRNA đều có Trong nghiên cứu này chiết xuất với ethanol kết quả dương tính với vi khuẩn Streptococcus 96%, khả năng kháng khuẩn Streptococcus agalactiae. Khuẩn lạc của vi khuẩn Streptococcus agalactiae (106 CFU/ml) của gừng (330 mg/ agalactiae hình tròn, lồi, màu kem, kích thước ml) cho vòng kháng khuẩn 29-34 mm và quế khoảng 1-2mm, dung huyết dạng β, đây là tan (330 mg/ml) cho vòng kháng khuẩn 14-17 mm, máu hoàn toàn, vòng tan máu trong suốt và có khả năng ức chế và diệt vi khuẩn Streptococcus đường kính gấp 2-4 lần đường kính của khuẩn agalactiae (mật độ 5 x 103 CFU/ml) của gừng lạc. Những Streptococci có khả năng gây tan có giá trị MIC = 1 mg/ml, MBC = 2 mg/ml và máu β phần lớn có khả năng gây bệnh, hầu hết của quế có giá trị MIC = 2 mg/ml, MBC = 8 mg/ các chủng vi khuẩn Streptococci không gây tan ml, giá trị MBC/MIC ≤ 4 chứng tỏ hai loại thảo huyết thu từ cá bệnh đều là vi khuẩn S. difficae dược này có khả năng diệt khuẩn cao. (Alsaid và ctv., 2010; Buller, 2004). Tuy nhiên, Giá trị MIC xác định bởi nghiên cứu này là nghiên cứu của (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., tương đồng với kết quả nghiên cứu của một số 2012) phân lập vi khuẩn gây bệnh lồi mắt, xuất tác giả khác. Nghiên cứu dịch chiết bằng nước huyết trên cá rô phi nuôi năm 2010 ở huyện Cai từ gừng trên 18 chủng vi khuẩn A. hydrophila có TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019 11
  10. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II vòng kháng khuẩn từ 7 - 13,67 mm (10 mg/đĩa), (nồng độ cao chiết 330 mg/ml) cho đường kính MIC = 0,05 – 0,20 mg/ml và MBC = 0,78-50 vòng kháng khuẩn 14-17 mm, khả năng ức chế mg/ml (Snuossi và ctv., 2016). Nghiên cứu dịch và diệt vi khuẩn Streptococcus agalactiae (5 x chiết bằng nước từ gừng trên 6 chủng vi khuẩn 103 CFU/ml) của cao chiết gừng có giá trị MIC Staphilococcus sciuri có vòng kháng khuẩn từ = 1 mg/ml, MBC = 2 mg/ml và của cao chiết quế có giá trị MIC = 2 mg/ml, MBC = 8 mg/ml. 8,67 - 15,33 mm (10 mg/đĩa), MIC = 0,05 – 0,20 mg/ml và MBC = 1,26 - 25 mg/ml (Snuossi và TÀI LIỆU THAM KHẢO ctv., 2016). Nghiên cứu dịch chiết bằng nước Tài liệu tiếng Việt lạnh, nước nóng và ethanol (95%) từ gừng (200 Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, mg/ml) trên chủng vi khuẩn Streptococcus sp có 2012. Phân lập và xác định đặc điểm của vi khuẩn vòng kháng khuẩn lần lượt 14, 11 và 28 mm S. agalactiae từ cá điêu hồng (Oreochromis sp.) (Nader, 2010). Chiết xuất gừng với ethanol bệnh phù mắt và xuất huyết. Tạp chí Khoa học Đại 95% (100 mg/ml) cho vòng kháng khuẩn 15,5 học Cần Thơ, 22C, 203-212. mm với vi khuẩn Streptococcus pneumonia Nguyễn Thượng Dong, Vietnam, Bộ giáo dục và đào (Suleiman AG và ctv., 2019). Chiết suất vỏ quế tạo, Vietnam, Bộ y tế, Viện dược liệu, 2008. Kỹ với nước (1 g/ml) cho vòng kháng khuẩn 21,5 thuật chiết xuất dược liệu. Hà Nội: Nhà xuất bản mm với vi khuẩn Streptococcus iniae (105 CFU/ Khoa học và kỹ thuật. ml), MIC = 0,04 mg/ml (Rattanachaikunsopon Trương Thị Mỹ Hạnh, 2008. Nghiên cứu tính kháng và ctv., 2010). Nghiên cứu chiết xuất bằng khuẩn và kháng nấm của một số loại thảo mộc. ethanol 95% trên tỏi, nguyệt quế, muồng Báo cáo đề tài khoa học – Viện Nghiên cứu Nuôi trâu, măng cụt, ổi và cây duối (10 mg/ml) khả trồng thủy sản I, Bắc Ninh. năng kháng khuẩn Streptococcus agalactiae Nguyễn Thị Trúc Quyên, Lê Linh Chi, Đoàn Văn (108 CFU/ml) cho đường kính vòng kháng Cường, Nguyễn Diễm Thư, Mã Tú Lan, Trần khuẩn từ 20-22 mm, khả năng ức chế vi khuẩn Hoàng Bích Ngọc, Nguyễn Thành Nhân, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, 2019. Khả năng đối kháng vi Streptococcus agalactiae (108 CFU/ml) trên khuẩn Streptococcus agalactiae phân lập trên cá muồng trâu, ổi, cây duối có giá trị MIC ≤ 0,125 rô phi (Oreochromis spp.) bởi một số cao chiết mg/ml (Rattanachaikunsopon và ctv., 2009). thảo dược. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy Nghiên cứu của chiết xuất bằng ethanol 95% sản, 3, 124-132. trên lá sầu đâu (100 mg/ml) có khả năng kháng Viện NCNT Thuỷ sản I, 2017. Các bệnh thường gặp khuẩn Streptococcus agalactiae (108 CFU/ml) trên cá rô phi nuôi tại Việt Nam, tình hình nghiên cho đường kính vòng kháng khuẩn 10,5 mm, cứu bệnh do TiLV trên cá rô phi. Báo cáo hội nghị trên lá cây tông dù (100 mg/ml) cho đường kính phòng chống bệnh mới do TiLV trên cá rô phi nuôi vòng kháng khuẩn 10,9 mm, khả năng ức chế tại Việt Nam, 10/2017. vi khuẩn Streptococcus agalactiae (108 CFU/ Tài liệu tiếng Anh ml) của sầu đâu có giá trị MIC = 1,25 mg/ml, Abutbul S., Golan Avi, Barazani Oz, Zilberg Dina, của lá cây tông dù có giá trị MIC = 0,6 mg/ml 2004. Use of Rosmarinus officinalis as a treatment (Kamble và ctv., 2014). against Streptococcus iniae in tilapia (Oreochromis sp.). Aquaculture, 238, 97-105. doi:10.1016/j. V. KẾT LUẬN aquaculture.2004.05.016 Vi khuẩn phân lập được từ cá rô phi giống Ahn Y. J., Kwon J. H., Chae S. H., Park J. H., Yoo J. bị bệnh lồi mắt, xuất huyết thu tại Tp. Hồ Chí Y., 1994. Growth-inhibitory Responses of Human Minh là Streptococcus agalactiae. Khả năng Intestinal Bacteria to Extracts of Oriental Medicinal kháng khuẩn Streptococcus agalactiae của cao Plants. Microbial Ecology in Health and Disease, chiết quế trong ethanol 96% (nồng độ cao chiết 7(5), 257-261. doi:10.3109/08910609409141363 330 mg/ml) cho đường kính vòng kháng khuẩn Alsaid Milud, Mohd Daud Hassan, Bejo Siti, 29-34 mm và cao chiết gừng trong ethanol 96% Abuseliana Ali, 2010. Antimicrobial Activities 12 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019
  11. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II of Some Culinary Spice Extracts against antibiotic-resistant bacteria. Brazilian Journal of Streptococcus agalactiae and Its Prophylactic Microbiology, 31, 247-256. Uses to Prevent Streptococcal Infection in Red Ndong Diegane, Chen Yu-Yuan, Lin Yu-Hung, Hybrid Tilapia (Oreochromis sp.). World Journal Vaseeharan Baskaralingam, Chen Jiann-Chu, of Fish and Marine Sciences, 2. 2007. The immune response of Mozambique Assessment report on Hypericum perforatum L., herb, tilapia Oreochromis mossambicus (Peters) and 2018. Committee on Herbal Medicinal Products its susceptibility to Streptococcus iniae under (HMPC). European Medicines Agency. stress in low and high temperatures. Fish & Brian Sheehan Ph.D. , L. Labrie, DVM , Y.S. Lee, B.S. shellfish immunology, 22, 686-694. doi:10.1016/j. , F.S. Wong, B.S. , J. Chan, B.S. , C., Komar DVM fsi.2006.08.015 , N. Wendover, B.S. and L. Grisez, Ph.D, 2009. Pachanawan A. , Phumkhachorn P. , Streptococcosis in tilapia. Global Aquaculture Rattanachaikunsopon P., 2008. Potential of Advocate. Psidium guajava Supplemented Fish Diets in Buller Nicky B., 2004. Bacteria from Fish and Other Controlling Aeromonas hydrophila Infection Aquatic Animals. A Practical Identification in Tilapia (Oreochromis niloticus). Journal of Manual. bioscience and bioengineering, 106(5), 419-424. Buxton Rebecca, 2005. Blood Agar Plates and Rattanachaikunsopon P., Phumkhachorn P., 2009. Hemolysis Protocols. American Society for Prophylactic effect of Andrographis paniculata Microbiology. extracts against Streptococcus agalactiae infection Evans Joyce, Klesius P. H., Shoemaker Craig, 2006. in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Journal An overview of Streptococcus in warmwater fish. of bioscience and bioengineering, 107, 579-582. Aquaculture Health International, 7, 10-14. doi:10.1016/j.jbiosc.2009.01.024 Faikoh E.N., Hong Y.H., Hu S.Y., 2014. Liposome- Rattanachaikunsopon P., Phumkhachorn P., 2010. encapsulated cinnamaldehyde enhances Potential of cinnamon (Cinnamomum verum) oil zebrafish (Danio rerio) immunity and survival to control Streptococcus iniae infection in tilapia when challenged with Vibrio vulnificus and (Oreochromis niloticus). Fisheries Science, 76, Streptococcus agalactiae. Fish & shellfish 287-293. immunology, 38, 15-24. Shangliang T., Hetrick, F. M., Roberson, B. S., and Kamble Manoj, Gallardo Wenresti, Yakupitiyage Baya, A., 1990. The antibacterial and antiviral Amararatne, Chavan Balasaheb, Rusydi activity of herbal extracts for fish pathogens. J. Rachmawati, Rahma Aulia, 2014. Antimicrobial Ocean. Uni. Qingdao, 20, 53-60. Activity of Bioactive Herbal Extracts Against Snuossi Mejdi, Trabelsi Najla, Ben Taleb Sabrine, Streptococcus agalactiae Biotype Dehmeni Ameni, Flamini Guido, De Feo 2. International Journal of Basis and Applied Biology, Vincenzo, 2016. Laurus nobilis, Zingiber 2, 152-155. officinale and Anethum graveolens Essential Nader Mohammed & Kassim, Kais & Ali, Safaa & Oils: Composition, Antioxidant and Antibacterial Azhar, Dalia, 2010. Antibacterial activity of ginger Activities against Bacteria Isolated from Fish and extracts and its essential oil on some of pathogenic Shellfish. Molecules (Basel, Switzerland), 21(10), bacteria. Baghdad Science Journal, 7, 1159-1165. 1414. doi:10.3390/molecules21101414 Nagi A Al-Haj, Khadija Zedan Hassan, Alabed Ali A Suleiman A.G., Hamisu M., Adamu M.D., Rabiu S., Alabed, Abdullah Y Al Mahdi, Rasheed Abdsalam, Abdulrazak M.H., Mujaheed A., Usman A.H., I Albawani. Sami Mohammed, 2018. Antibacterial and Marwan, 2019. In Vitro Antibacterial Activity Assays of Malaysian Medicinal Plant Polygonum and Phytochemical Analysis of Zingiber officinale minus Using Different Extraction Methods** L. Rhizome Extracts. Med Chem (Los Angeles), Nagi A. Al-Haj," Khadija Zedan Hassan,“Alabed 9(4), 056-059. Ali A. Alabed,“Abdullah Y. Al Mahdi. Yasuko Sekita, Keiji Murakami, Hiromichi Yumoto, Nascimento Gislene G. F., Locatelli Juliana, Freitas 2016. Preventive Effects of Houttuynia cordata Paulo C., Silva Giuliana L., 2000. Antibacterial Extract for Oral Infectious Diseases. Department activity of plant extracts and phytochemicals on of Pharmacognosy, Tokushima - Japan, 770-8505. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019 13
  12. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF CINNAMON BARK (Cinnamomum verum) AND GINGER (Zingiber officinale rose) ETHANOL EXTRACT AGAINST Streptococcus agalactiae ISOLATED FROM TILAPIA FINGERLINGS (Oreochromis spp.) Doan Van Cuong 1*, Nguyen Thi Ngoc Tinh1, Ma Tu Lan1, Nguyen Thanh Nhan1 ABSTRACT Streptococcus agalactiae is known as an important pathogen that causes high mortality in many freshwater and marine fish species. In this study, Streptococcus agalactiae was isolated from tilapia with haemorrhage and eye-protrusion symptoms colected in Ho Chi Minh city. Extraction of two herbs namely cinnamon bark (Cinnamon verum), ginger (Zingiber officinale Rose) by exhaustion method with ethanol solvent at three separate concentrations (96%, 72%, and 48%) or three consecutive concentrations (96%, then 72% and 48%, respectively). The results showed that cinnamon extract in 96% ethanol demonstrated a highest antibacterial activity, with the diameter of inhibition zone ranging from 29-34 mm, MIC value = 2 mg/ml, and MBC value = 8 mg/ml; while Ginger extract in 96% ethanol showed the diameter of inhibiton zone ranging from 14-17 mm, MIC value = 1 mg/ml, and MBC value = 2 mg/ml. In sum, cinnamon and ginger extract in 96% ethanol are considered two potential herbal extracts that can be applied to prevent and to treat diseases caused by Streptococcus agalactiae in tilapia. Keywords: Cinnamon bark extract, ginger extract, Streptococcus agalactiae, tilapia. Người phản biện: TS. Nguyễn Ngọc Du Người phản biện: TS. Ngô Huỳnh Phương Thảo Ngày nhận bài: 18/10/2019 Ngày nhận bài: 18/10/2019 Ngày thông qua phản biện: 02/11/2019 Ngày thông qua phản biện: 10/11/2019 Ngày duyệt đăng: 25/12/2019 Ngày duyệt đăng: 25/12/2019 1 Research Institute for Aquaculture II * Email: vancuongdisaqua@gmail.com 14 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019
nguon tai.lieu . vn
Nông nghiệp Ngư nghiệp Lâm nghiệp Sinh học Hoá học Ngôn ngữ học Ngân hàng - Tín dụng