1. Trang Chủ
  2. Ngư nghiệp
  3. Khảo sát, phân lập và lựa chọn chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực mạnh và mới nhất

Khảo sát, phân lập và lựa chọn chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực mạnh và mới nhất

Trong khuôn khổ của nghiên cứu này hành khảo sát, phân lập và lựa chọn chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực mạnh và mới nhất, với mục tiêu là tìm ra những chủng E. ictaluri có độc lực cao làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn như sản xuất vắc-xin hay nghiên cứu chọn giống cá tra kháng bệnh gan thận mủ. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 KHẢO SÁT, PHÂN LẬP VÀ LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri CÓ ĐỘC LỰC MẠNH VÀ MỚI NHẤT. Lê Hồng Phước1*, Nguyễn Thị Hiền1, Nguyễn Hồng Lộ

Thể loại Tài liệu miễn phí Ngư nghiệp

Số trang 10

Ngày tạo 12/29/2020 11:31:09 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 0.46 M

Tên tệp

Tải Khảo sát, phân lập và lựa chọn chủng vi khuẩn Edwa... (.pdf)

Xem mẫu

  1. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 KHẢO SÁT, PHÂN LẬP VÀ LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri CÓ ĐỘC LỰC MẠNH VÀ MỚI NHẤT. Lê Hồng Phước1*, Nguyễn Thị Hiền1, Nguyễn Hồng Lộc1, Võ Hồng Phượng1, Trịnh Quốc Trọng2 TÓM TẮT Từ 50 mẫu cá có biểu hiện bệnh gan thận mủ thu được ở các tỉnh ĐBSCL từ tháng 03/2010 đến tháng 05/2013, nhóm nghiên cứu đã phân lập được bốn chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri I, II, III, IV có khả năng gây bệnh thực nghiệm trên cá tra. Qua khảo sát độc lực của bốn chủng vi khuẩn, chủng Edwardsiella ictaluri I và IV có độc lực cao gấp đôi so với 2 chủng còn lại với LD50 khoảng 2x104 CFU/0,2 ml/cá. Với liều tiêm 106 CFU/cá, cá bắt đầu chết sau 2 ngày tiêm, chủng E. ictaluri I gây chết sớm nhất và cho tỉ lệ chết cao nhất (99%) so với các chủng vi khuẩn còn lại. Chủng III có tỉ lệ chết thấp nhất. Ở liều tiêm 105 CFU/cá, cá chết bắt đầu từ ngày thứ 3 sau khi tiêm và tập trung nhiều nhất vào các ngày 3, 4 & 5 sau khi tiêm. So với các chủng vi khuẩn khác thì chủng I cho tỷ lệ chết cao nhất (85%) và sớm nhất. Ở liều tiêm thấp nhất 104 CFU/cá, cá bắt đầu chết vào ngày thứ 4 và chết tập trung từ ngày 4-6 sau khi tiêm. Trong số các chủng vi khuẩn thử nghiệm có chủng IV cho tỷ lệ chết cao nhất (50%) và chủng I gây chết sớm hơn so với các chủng còn lại. Kết quả này cho thấy, vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ trên cá tra gồm nhiều chủng có độc lực cao thấp khác nhau tuy nhiên sự khác biệt này là không đáng kể. Từ khóa: vi khuẩn, gây nhiễm, tiêm. I. ĐẶT VẤN ĐỀ tình hình nuôi cá tra vẫn gặp nhiều khó khăn do Trong những năm gần đây, ngoài việc mở các vấn đề về dịch bệnh cũng như về giá cả và rộng diện tích nuôi trồng thủy sản thì việc đa thị trường tiêu thụ. Nghiên cứu cho thấy, ở cá dạng hóa các đối tượng nuôi cũng được quan tra thường xuất hiện các loại bệnh như gan thận tâm đáng kể. Nhiều đối tượng nuôi thích ứng với mủ, xuất huyết, phù đầu, trắng gan, trắng mang các vùng địa lý khác nhau đã được nghiên cứu và ký sinh trùng. Trong đó, bệnh gan thận mủ và phát triển. Trong đó, cá tra (Pangasianodon được xem là một trong những bệnh thường xuất hypophthalmus) được xem là đối tượng nuôi hiện và nguy hiểm nhất. Theo báo cáo của Cục chủ lực của cả nước và tập trung phát triển nuôi Thú Y, trong năm 2013 các loại dịch bệnh trên chủ yếu ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long. cá tra đã xảy ra tại 71 xã thuộc 21 huyện của Với điều kiện thích hợp, một số tỉnh đã và đang 6 tỉnh nuôi cá tra tập trung ở ĐBSCL với tổng có diện tích và sản lượng cá tra khá lớn như diện tích ao cá có cá nhiễm bệnh là 732,1 ha Đồng Tháp, Tiền Giang, Bến Tre, An Giang, trong đó bệnh gan thận mủ chiếm tỷ lệ cao nhất Cần Thơ, Vĩnh Long và Hậu Giang. Tuy nhiên, (48%). Bệnh gan thận mủ trên cá tra đã được 1 Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. * Email: lehongphuoc@yahoo.com 2 Trung tâm Quốc gia giống thủy sản nước ngọt khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 87
  2. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 xác định là do tác nhân vi khuẩn E. ictaluri 2.1.2 Cá tra thí nghiệm (Crumlish và ctv., 2002) gây ra. Loài vi khuẩn Cá tra thí nghiệm có trọng lượng từ 20 đến này thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacte- 25 g/con. Cá thí nghiệm khỏe mạnh, không bị riaceae. E. Ictaluri, phần lớn được biết đến như nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. Cá được chuyển về là tác nhân gây bệnh xuất huyết nội tạng (En- phòng thí nghiệm ướt thuần dưỡng trong 2-3 teric septicaemia of catfish- ESC) trên cá nheo tuần. Sau đó, cá được chuyển vào bể kính từ (Ictalurus punctatus) ở Mỹ (OIE, 2006). Cho 7-10 ngày, kiểm tra sự hiện diện của E. ictaluri đến nay, các nghiên cứu liên quan đến tác nhân ở gan, thận, lách cá trên môi trường thạch máu này trên cá tra này rất được quan tâm như các trước khi tiến hành thí nghiệm. nghiên cứu về đặc tính sinh hóa, di truyền, dịch 2.1.3 Môi trường nuôi cấy, phân lập vi tễ và độc lực. Trong khuôn khổ của nghiên cứu khuẩn này, chúng tôi tiến hành khảo sát, phân lập và lựa chọn chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Môi trường dùng để phân lập vi khuẩn là có độc lực mạnh và mới nhất, với mục tiêu là môi trường thạch máu cơ bản có bổ sung 5% tìm ra những chủng E. ictaluri có độc lực cao máu cừu. Các môi trường khác dùng để tăng làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn như sản sinh vi khuẩn bao gồm môi trường Brain Heart xuất vắc-xin hay nghiên cứu chọn giống cá tra Infusion Broth (BHIB) hoặc Nutrient Broth kháng bệnh gan thận mủ. (NB). Môi trường thạch được chuẩn bị bằng cách dùng môi trường lỏng thêm vào 15 g Agar II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP cho mỗi lít môi trường. NGHIÊN CỨU 2.1.4 Hóa chất khác 2.1. Vật liệu Cồn 70%, cồn 90%, dung dịch đệm pH 7, 2.1.1 Mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập nước muối 0,85% NaCl, thuốc tím, Chlorine, E. ictaluri dung dịch Formaline (Merck) để bất hoạt vi khuẩn, thuốc gây mê cho cá EGME - C2H10O2 Mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập vi khuẩn (Merck, Đức),… là gan, thận cá tra bệnh gan thận mủ, cá bệnh được thu làm nhiều đợt từ tháng 03/2010 đến 2.1.5 Dụng cụ thí nghiệm 05/2013 (Bảng 1) Máy trộn mẫu, máy quang phổ đo OD, tủ Bảng 1. Thông tin mẫu bệnh phẩm dùng để ấm, tủ cấy vi sinh, tủ lắc ổn nhiệt, tủ mát 40C, tủ phân lập E. ictaluri lạnh âm 20oC, âm 70oC, máy ly tâm lạnh, cân điện tử, kim tiêm 1ml, kim tiêm tự động, ống Đợt Số lượng Địa nghiệm, eppendorf, đĩa petri, bể composite 1m3, Thời gian Cỡ cá thu mẫu điểm bể kính (80 lít). 14 20-25 g An Đợt 1 03/2010 2.2. Phương pháp nghiên cứu 16 >40 g Giang 2.2.1 Phương pháp thu mẫu Bến Đợt 2 05/2012 6 20-25 g Thu mẫu cá tra có biểu hiện bệnh tích điển Tre Tiền hình của bệnh gan thận mủ (đốm trắng mủ trên Đợt 3 01/2013 10 20-25 g gan - thận). Tiến hành thu mẫu cá bệnh khi dịch Giang Tiền bệnh bùng phát và thu tối thiểu 3-5 mẫu/ao, thu Đợt 4 05/2013 4 25-30 g Giang cá bệnh nặng sắp chết hoặc cá sống nhưng có 88 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
  3. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 dấu hiệu lâm sàng điển hình. Thu các mẫu cơ lệ sống chết trong mỗi nồng độ pha loãng rồi tính quan nội tạng cá, cho vào eppendorf trong điều liều LD50 theo Reed-Muench (1938). kiện vô trùng và bảo quản lạnh (4oC). Mẫu thu chuyển đến phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt 2.2.5 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm để tiến hành phân lập và định danh. Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn E.ictaluri được 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và lấy từ ống giữ giống (âm 70°C) và cấy trên môi định danh vi khuẩn trường thạch máu (BA) ủ ở nhiệt độ 28°C trong thời gian 24 giờ sau đó tiếp tục đưa vi khuẩn này Dùng các môi trường: Blood agar, Brain- vào môi trường BHIB (pH 7, nhiệt độ 28°C nuôi Heart Infusion Agar để phân lập vi khuẩn. Sử lắc 200 vòng/phút) với mật độ 103 CFU/ml tăng dụng test kit API 20E để test sinh hóa và định sinh trong thời gian 24 giờ và sau đó đo mật độ danh vi khuẩn theo khóa phân loại Bergey OD550nm xác định mật độ tế bào trước khi công (1996). Ngoài ra còn xác định E. ictaluri bằng vào cá tra với liều 0,2 ml dịch vi khuẩn/cá. phương pháp PCR. Sử dụng cặp mồi EiFd-1 (5’- GTAGCAGGGAGAAAGCTTGC-3’), EiRs-1 Gây bệnh thực nghiệm bằng phương (5’- GAACGCTATTAACGCTCACACC-3’) pháp tiêm: Gây mê cá thí nghiệm bằng EGME để khuếch đại đoạn trình tự dài 407 bp thuộc (Ethylene Glycol Monophenyl Ether, Merck) gen 16S rRNA, đặc hiệu cho loài vi khuẩn E. 0,2 ppt (1 ml EGME trong 5 lít nước) trong 3-5 ictaluri (Panangala và ctv., 2007). phút. Sử dụng kim tiêm bán tự động (Socorex) với chiều dài mũi kim tiêm 4 mm được dùng cho 2.2.3 Phương pháp tách nucleic acid của cá 10-40 g để đảm bảo an toàn cho cá thí nghiệm. vi khuẩn Mũi kim tiêm đi vào xoang bụng cá ở vị trí giữa Lấy khuẩn lạc vi khuẩn cho vào 1ml nước hai vây bụng cá tra và chếch một góc 45°. cất vô trùng, hòa đều, ly tâm 10 phút với tốc độ 2.2.6 Phương pháp xác định mật độ vi 13.000 g, bỏ dịch nổi. Cặn được huyền phù với khuẩn 500 µl dịch đệm ly trích DNA (50 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA, pH 8; 500 mM NaCl; 1% SDS Tại các thời điểm thu mẫu kiểm tra OD550nm, và 10 µg/ml Proteinase K), ủ ở 100°C trong 10 canh khuẩn cũng được pha loãng theo hệ số 10 và phút, để nguội sau đó ly tâm 13.000 g trong 5 tiến hành cấy trên đĩa thạch để xác định mật độ phút. Tủa dịch nổi bằng 2 thể tích cồn tuyệt vi khuẩn. Sau khi pha loãng dùng micropipette đối, ly tâm ở 13.000 g trong 10 phút thu tủa hút 0,1 ml cho vào đĩa thạch NA. Tương ứng với DNA. Loại bỏ dịch nổi và để tủa DNA khô tự mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa. Dùng que cấy chang nhiên, hòa tan tủa DNA bằng nước cất vô trùng đều canh khuẩn trên mặt thạch sau đó cho vào và giữ ở -20°C. tủ ấm 28ºC và tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc sau 36h nuôi cấy, tính mật độ vi khuẩn theo 2.2.4 Phương pháp xác định LD50 công thức: Xác định mật độ vi khuẩn tương đối của canh A (tế bào/ml) = (a + b)/2 x 10 x D trùng gốc thông qua giá trị OD550nm và đếm khuẩn Trong đó: A là mật độ vi khuẩn (tế bào/ml) lạc trên đĩa thạch. Tiến hành pha loãng canh trùng gốc này để được dãy mật độ vi khuẩn sao cho khi a, b là số khuẩn lạc mọc trên đĩa 1 và đĩa 2 tiêm vào cá với các liều 104, 105, 106 CFU/0,2 ứng với độ pha loãng đã được xác định. ml/cá. Mỗi nồng độ tiêm cho 20 cá. Theo dõi tỷ D = độ pha loãng TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 89
  4. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 2.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát độc lực Thu mẫu cá chết ở mỗi bể vào các ngày cá chết của vi khuẩn tập trung, thu ngẫu nhiên mỗi cá/bể cho phân Mục đích của thí nghiệm này là để so sánh tích vi khuẩn kiểm tra tác nhân gây bệnh. độc lực của các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân III. KẾT QUẢ lập được . Thí nghiệm được bố trí trên bể kính. 3.1. Kết quả phân lập, định danh vi Mỗi bể kính chứa 20 cá có trọng lượng trung khuẩn từ mẫu cá tra bệnh bình là 20 g. Cá thí nghiệm được tiêm canh Kết quả phân lập E. ictaluri qua 4 đợt thu khuẩn với liều 104, 105 và 106 CFU/0,2 ml/cá. mẫu thu được 04 chủng E. ictaluri I, II, III và IV. Cá đối chứng được tiêm với nước muối sinh lý. Kết quả kiểm tra sinh hóa từ 4 chủng vi khuẩn Mỗi nghiệm thức thí nghiệm được lập lai 3 lần. này được trình bày ở bảng 2. Các chủng E. Sau khi tiêm, cá được bố trí vào các bể kính và ictaluri này đều gây tan huyết trên môi trường cho nhịn đói trong vòng 6 giờ. Sau đó, cá được thạch máu, khuẩn lạc nhìn rõ sau 36-48 giờ cấy cho ăn bình thường. Theo dõi cá chết hàng ngày trên đĩa thạch (Hình 1) và khi nhuộm Gram cho sau khi tiêm và kết thúc thí nghiệm sau 2 tuần. thấy vi khuẩn có dạng trực khuẩn Gram âm. Bảng 2. Kết quả kiểm tra sinh hóa của các chủng vi khuẩn E. ictaluri Chủng vi khuẩn Phản ứng E. ictaluri I E. ictaluri II E. ictaluri III E. ictaluri IV ONPG + + + - ADH - - - - LDC - + + + ODC - - - - CIT + + + d H2S - - - - URE - - - - TDA - - - - VP + + + d GEL + + + - GLU + + + + MAN - d d - INO - - - - SOR - - - - RHA - - - - SAC - d d - MEL + - - - AMY - d d - ARA + d d - NIT + + + - O/F +/+ +/+ +/+ +/+ LAC + + + + NO3 + + + + ESCULIN + + + - Ghi chú: (-): âm tính, (+) dương tính, d: dương tính không rõ. 90 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
  5. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Hình 1. Các chủng vi khuẩn E. ictaluri I, II, II, IV trên môi trường thạch máu Kết quả kiểm tra bằng PCR 16S rRNA của 3.2. Kết quả khảo sát độc lực của các E. ictaluri (Panangala và cvt., 2007) cho thấy cả chủng vi khuẩn E. ictaluri 4 chủng E. ictaluri cho sản phẩm khuếch đại có Ở thí nghiệm này, với liều tiêm 106 CFU/ kích thước 407 bp, tương ứng với chủng chuẩn cá, cá bắt đầu chết sau 2 ngày tiêm. Chủng E. E. ictaluri LMG7860 (Hình 2). ictaluri I cho tỷ lệ chết sớm nhất và cao nhất so với các chủng vi khuẩn còn lại (Đồ thị 1). Chủng E. ictaluri III cho tỉ lệ chết thấp có ý nghĩa thống kê (p
  6. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Đồ thị 2. Tỷ lệ chết cộng đồn trên cá tra sau khi gây nhiễm với 04 chủng Edwardsiella ictaluri liều 105 CFU/cá Ở liều gây nhiễm 104 CFU/cá, cá bắt đầu lệ chết giữa các chủng E. ictaluri cũng không chết vào ngày thứ 4 và chết tập trung từ ngày cho khác biệt có ý nghĩa (p
  7. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Bảng 3. Giá trị LD50 của các chủng E. ictaluri (Waltman và ctv., 1986; Cooper và ctv., 1996). Sự khác biệt về kiểu gene của 20 chủng E. ic- Chủng vi khuẩn LD50 taluri, 19 chủng thu từ cá nheo Mỹ và 1 chủng thu từ cá trê (Clarias batrachus) ở Thái Lan có Edwardsiella ictaluri I 1,9 x104 (CFU/0,2 ml/cá) đặc tính sinh hóa giống nhau, xác định bằng kỹ thuật arbitrary primed PCR (AP-PCR) kết hợp Edwardsiella ictaluri II 3,8 x104 (CFU/0,2 ml/cá) với mồi phát hiện vùng bảo tồn nằm trong vùng Edwardsiella ictaluri III 3,4 x104 (CFU/0,2 ml/cá) lặp lại của vi khuẩn đường ruột (ERIC II) cho thấy vi khuẩn này gồm 4 nhóm dưới loài (Ba- Edwardsiella ictaluri IV 2 x104 (CFU/0,2 ml/cá) der và ctv., 1998). Trong nghiên cứu này, cả bốn chủng mà chúng tôi phân lập đươc đều cho phản Ngoài ra, khi kiểm tra cá chết sau khi gây ứng dương tính với Citrate và VP. Kết quả này bệnh thực nghiệm bằng cách thu ngẫu nhiên tương ứng với nghiên cứu của Thy và ctv., 2008 mỗi bể một con để cấy vi khuẩn từ thận cá lên khi phân lập E. ictaluri từ cá tra Việt Nam ở 5 môi trường BA, kết quả sau 48 giờ cấy ủ ở 30°C tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long chỉ có thuần một loại vi khuẩn E. ictaluri với và Bến Tre nhưng lại khác với mô tả của Hawke kiểu tan huyết đặc trưng trên BA. (1979) (Citrate và VP âm tính với E. ictaluri). IV. THẢO LUẬN Ngoài ra, bốn chủng E. ictaluri phân lập được Theo mô tả của Austin (2007), E. ictaluri cũng cho phản ứng dương tính với Lysine, âm có thể được phân lập từ thận, gan, lách, não và tính với Arginine giống với các đặc tính của E. các vết thương trên da hay cơ của cá trên môi ictaluri mà Hawke (1979) mô tả. Cũng theo trường BHIA, thạch máu hay môi trường chọn Hawke các phản ứng đường hầu hết là âm tính. lọc đối với E. ictaluri (EIM). Sau khi ủ ở 26°C Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, một vài chủng trong 48 giờ, các khuẩn lạc của E. ictaluri có cho dương tính nhẹ với amylase, arabinose và dạng tròn bóng, đường kính khoảng 2 mm, hơi manitol. Sự khác biệt về một vài phản ứng sinh cong, vành đầy đặn và không có sắc tố. Khi hóa này có thể là do sự khác biệt về các chủng kiểm tra các đặc tính sinh hóa thì E. Ictaluri vi khuẩn được phân lập từ các vùng địa lý khác được xác đinh là vi khuẩn Gram âm, hình que, nhau và sự biến chủng của vi khuẩn trong quá lên men và di chuyển bằng lông mao. E. Ictaluri trình gây bệnh. có khả năng sản xuất các enzyme như catala- Ngoài ra, nghiên cứu này đã gây bệnh thành se, P-galactosidase, lysine và ornithine decar- công trên cá tra bằng 04 chủng E. ictaluri I, II, boxylase nhưng không tạo H2S, indole, oxida- III, IV đã phân lập được. Cá được gây bệnh có se hay phenylalanine deaminase (Waltman và biểu hiện bệnh lý giống cá bệnh ngoài tự nhiên ctv., 1986). Qua phân tích 119 chủng E. ictaluri như màu sắc cá nhợt nhạt, mắt lồi, đôi khi xuất thu trong suốt 7 năm ở các bang của Mỹ, cho huyết bên ngoài cơ thể ở các gốc vây, quanh thấy các chủng này có độ tương đồng về đặc mắt, miệng, đuôi, hậu môn. Bên trong cơ thể tính sinh hóa rất cao. Tất cả các chủng đều có có vô số đốm trắng với kích thước khác nhau từ khả năng phân hủy chondroitin sulfate, là thành 1-3 mm xuất hiện đầu tiên trên thận, sau đó đến phần chính của sụn, đây có thể là một yếu tố lách và gan. gây độc quan trọng trong việc hình thành nên Qua khảo sát về độc lực của 4 chủng E. tổn thương lỗ trên đầu đặc trưng của cá bệnh ictaluri phân lập được có thể thấy rằng vi TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 93
  8. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 khuẩn gây bệnh gan thận mủ trên cá tra gồm 104-105 CFU/cá. Nguyễn Hữu Thịnh và ctv., nhiều chủng có độc lực cao thấp khác nhau, tuy (2009) nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm bằng nhiên sự khác biệt này là không đáng kể. Nếu phương pháp tiêm với liều tiêm từ dãy nồng độ xét về thời gian thì chủng E. ictaluri I gây chết 5,5 x103 đến 5,5 x 106 (mỗi nồng độ pha loãng cá sớm hơn các chủng còn lại (cá bắt đầu chết 10 lần) cho tỷ lệ chết từ 93-99,3% và đối với từ ngày thứ 2 sau khi tiêm vi khuẩn) và nếu gây bệnh bằng phương pháp ngâm cho tỷ lệ xét về LD50 thì chủng này cũng có giá trị thấp chết 66% ở liều 5,5 x 106 CFU/ml. nhất mặc dù sự khác biệt với các chủng khác V. KẾT LUẬN không có ý nghĩa thống kê (1,9 x104 CFU/0,2 ml/cá). Theo giá trị LD50, hai chủng E. ictaluri Trong năm 2012 và 2013 nhóm nghiên cứu I và IV có độc lực tương đương nhau khoảng đã cập nhật được 04 chủng vi khuẩn E. ictaluri 2x104 CFU/0.2 ml/cá và cao hơn gần hai lần so I, II, III, IV từ cá tra bệnh gan thận mủ thu tại với hai chủng E. ictaluri còn lại. Kết quả này các tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu long. Các khá tương đồng với các nghiên cứu khác ở Việt chủng vi khuẩn này có khả năng gây bệnh trên Nam. Như nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng cá tra với biểu hiện bệnh lý giống cá bệnh ngoài Oanh và ctv., (2009) khi kiểm tra độc lực của tự nhiên. Đồng thời, nhóm cũng đã xác định 9 chủng vi khuẩn E. ictaluri cũng cho thấy các được độc lực của các chủng E. ictaluri này. chủng có độc lực cao thấp khác nhau. Kết quả Trong đó, chủng E. ictaluri I và IV có độc lực nghiên cứu của Nguyễn Quốc Bình và ctv., cao hơn gần hai lần so với hai chủng E. ictaluri (2010) cho thấy E. iclaturi có LD50 khoảng từ II và III. TÀI LIỆU THAM KHẢO Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thị Mai Thy, 2004. Tài liệu tiếng Việt Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2009. (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí khoa học Độc lực của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân Đại học Cần Thơ 2004, tr. 137 – 142. lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Tài liệu tiếng Anh bệnh mủ gan, Hội thảo nghiên cứu tác nhân gây Austin, B., and Austin, D.A., 2007. Bacterial Fish bệnh gan thận mủ ở cá tra 11/08/2009. Pathogens: Diseases of Farmed and Wild Fish, 4th. Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Trọng Bình, Vũ thị Thanh Springer and Praxis Publishing, Chichester, UK. Hương, Dương Vân Anh, Trần Hạnh Triết, Trần Bader, J.A., Shoemaker, C.A., Klesius, P.H., Connolly, Thị Thanh Xuân, Đinh Thị Cao Khánh, Võ Hy Lan M.A., and Barbaree, J.M., 1998. Genomic Anh, Văn Xuân Thành, Trần Thị Thanh Thanh, subtyping of Edwardsiella ictaluri isolated from 2010. Các hướng nghiên cứu về vaccine phòng diseased channel catfish by arbitrary primed bệnh gan thận mủ cho cá Tra đang được triển khai polymerase chain reaction. Journal of Aquatic tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Animal Health 10, 22-21. Hồ Chí Minh. Hội nghị Công Nghệ Sinh Học toàn quốc, Tp.HCM ngày 02/12/2010. Cooper, R.K., Shotts, E.B. and Nolan, L.K., 1996. Use of a mini-transposon to study chondroitinase Tạp chí Thương Mại Thủy sản, số 131. Tháng 02/2013, activity associated with Edwardsiella ictaluri. ISSN 1859-1175 Journal of Aquatic Animal Health 8:319-324. 94 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
  9. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Crumlish, Dung, M., Turnbull, T.J., Ngoc, N., and Reed, M.J., and Muench, M., 1938. A simple method Ferguson, H., 2002. Identification of E. ictaruli for estimating fifty percent endpoints. American from the diseased freshwater catfish Pangasius Journal of hygiene 27: 493-497. hypophthalmus Sauvage, cultured in the Mekong Thinh, N.H., Kuob, T.Y., Hung, L.T., Loc, T.H., Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases 25: 733- Chen, S.C., Evensen, O., Schuurman, H.J., 736. 2009. Combined immersion and oral vaccination Hawke, J. P., McWhorter, A. C., Steigerwalt, A. G., of Vietnamese catfish (Pangasianodon and Brenner, D. J., 1981. Edwardsiella ictaluri hypophthalmus) confers protection against sp. Nov., the causative agent of enteric septicemia mortality caused by Edwardsiella ictaluri. Fish & of catfish. International Journal of Systematic Shellfish Immunology 27: 773-776. Bacteriology 31 (4): 396-400. Waltman, W.D., Shotts, E.B., and Hsu, T.C., 1986. Panangala, V. S., Craig, A.S., Vicky, L.V., Kevin, Biochemical characteristics of Edwardsiella D., and Phillip, H.K., 2007. Multiplex-PCR ictaluri. Applied and Environmental Microbiology for Simultaneous Detection of 3 Bacterial 51:101-4. Fish Pathogens, Flavobacterium Columnare, Edwardsiella Ictaluri and Aeromonas hydrophila. Diseases of aquatic organisms 74(3):199–208. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 95
  10. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 INVESTIGATION, ISOLATION AND SELECTION OF THE MOST UPDATED AND VIRULENT STRAINS OF Edwardsiella ictaluri Le Hong Phuoc1*, Nguyen Thi Hien1, Nguyen Hong Loc1, Vo Hong Phuong1, Trinh Quoc Trong2 ABSTRACT In this study, 4 strains of bacteria E. ictaluri, namely I, II, III and IV were isolated and characterized from 50 diseased fish samples collected from culture farms in Mekong Delta from March, 2010 to May, 2013. Through the challenge tests using those E. ictaluri strains, the same bacillary necrosis pathology was reproduced in experimental fish. Among 4 strains of E. ictaluri, strain I and II ap- pear to be the most virulent with the LD50 is approximately 2x104 CFU/0.2 ml/fish which is double the LD50 of strain II and III. At the dose of 106 CFU/fish, the experimental fish started to die in the second day post injection with the E. ictaluri I caused more than 99% mortality. In the challenge test with the dose of 105 CFU/fish, majority of the fish died after 3 days post injection. The E. ictaluri I caused 85% mortality. At the lowest dose, 104 CFU/fish, after 4 days post injection, the fish started to die. The E. ictaluri IV induced mortality the most with more than 50% of mortality. Generally, the virulence of E. ictaluri strains causing bacillary necrosis pathology in trafish might vary but not significant. Keywords: bacteria, challenge, injection. Người phản biện: TS. Đinh Thị Thủy Ngày nhận bài: 29/5/2015 Ngày thông qua phản biện: 10/6/2015 Ngày duyệt đăng: 15/6/2015 1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2. * Email: lehongphuoc@yahoo.com 2 National Breeding Center for Southern Freshwater Aquaculture, Research Institute for Aquaculture No.2 96 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
nguon tai.lieu . vn
Nông nghiệp Ngư nghiệp Lâm nghiệp Sinh học Hoá học Ngôn ngữ học Ngân hàng - Tín dụng