1. Trang Chủ
  2. Ngư nghiệp
  3. Kết quả phân lập Schizochytrium mangrove giàu lipid phục vụ cho nuôi trồng thủy sản

Kết quả phân lập Schizochytrium mangrove giàu lipid phục vụ cho nuôi trồng thủy sản

Bài viết tiến hành phân lập và sàng lọc một số loài tảo biển dị dưỡng từ lá cây Đước và cây Mắm ở huyện Cần Giờ và Năm Căn có tích lũy lipid cao và đồng thời khảo sát môi trường dinh dưỡng, điều kiện môi trường nuôi cấy. Kết quả phân lập được loài Schizochytrium mangrove ĐCM có khả năng tích lũy lipid tổng số 26,65%. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP Schizochytrium MANGROVE GIÀU LIPID PHỤC VỤ CHO NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Võ Minh Sơn1*, Vương Thị Hồng Hạnh1 TÓM TẮT Acid béo

Thể loại Tài liệu miễn phí Ngư nghiệp

Số trang 15

Ngày tạo 12/29/2020 11:31:36 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 0.62 M

Tên tệp

Tải Kết quả phân lập Schizochytrium mangrove giàu lipi... (.pdf)

Xem mẫu

  1. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP Schizochytrium MANGROVE GIÀU LIPID PHỤC VỤ CHO NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Võ Minh Sơn1*, Vương Thị Hồng Hạnh1 TÓM TẮT Acid béo không no cao phân tử (PUFA) là nguồn dưỡng chất thiết yếu cho động vật thủy sản, giúp tăng trưởng, tăng tỉ lệ sống và sinh sản, cải thiện hệ số thức ăn. Do những hạn chế cung cấp PUFA từ động vật và thực vật, nhiều nghiên cứu tìm kiếm nguồn nguyên liệu cung cấp PUFA từ vi sinh vật và vi tảo. Trong đó vi tảo biển dị dưỡng (hay nấm biển) là nguồn nguyên liệu cung cấp acid béo không no đầy tiềm năng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân lập và sàng lọc một số loài tảo biển dị dưỡng từ lá cây Đước và cây Mắm ở huyện Cần Giờ và Năm Căn có tích lũy lipid cao và đồng thời khảo sát môi trường dinh dưỡng, điều kiện môi trường nuôi cấy. Kết quả phân lập được loài Schizochytrium mangrove ĐCM có khả năng tích lũy lipid tổng số 26,65%. Tảo S. mangrovei ĐCM phát triển thích hợp ở pH 5-6, nồng độ muối 25-30‰, nồng độ đường 50-60 g.l-1, nguồn nitơ thích hợp bao gồm peptone, cao nấm men và monosodium glutamate. Từ khoá: PUFA, Schizochytrium, tảo dị dưỡng. I. MỞ ĐẦU môi trường ô nhiễm, mùi và vị khó chịu. Ngoài Acid béo không no cao phân tử (PUFA) ra dầu cá còn chứa hỗn hợp các loại acid béo, do đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc màng tế đó việc tách DHA hay EPA cho giá thành rất cao bào, phát triển hệ thần kinh cho trẻ sơ sinh và (Sijtsma và Swaaf, 2004). phòng ngừa một số bệnh về tim mạch (Sijtsma Để đáp ứng nhu cầu sử dụng PUFA ngày và Swaaf, 2004). Đối với động vật thủy sản, càng cao, nhiều nghiên cứu tìm những nguồn PUFA giúp phát triển tuyến sinh dục, tăng chất cung cấp PUFA cao từ vi sinh vật thay thế cho lượng trứng và cá bột, tăng tỉ lệ sống và tăng dầu cá và thực vật. Dầu vi sinh vật (microbial trưởng (Kanazawa và ctv., 1979; Watanabe, oil) hay dầu đơn bào (single-cell oil – SCO) là 1993; Watanabe và Vassallo-Agius, 2003). bao gồm các vi sinh vật như vi khuẩn, vi tảo Nguồn cung cấp PUFA như docosahexaenoic quang dưỡng và dị dưỡng có khả năng tổng acid (DHA) và eicosapentaenoic acid (EPA), hợp PUFA khi được nuôi cấy trong hệ thống chủ yếu từ các loài cá biển như cá trích, cá thu, lên men (Sijtsma và Swaaf, 2004). PUFA được cá mòi, cá hồi (Gunstone, 1996). Dầu cá được tổng hợp từ Vibrio sp. nước mặn và nước ngọt ứng dụng phổ biến trong thực phẩm và dược đạt 10,7% (Ando và ctv., 1992; Ringø và ctv., phẩm, tuy nhiên dầu cá có nhiều khuyết điểm 1992), Bacterium đạt 16% (Akimoto và ctv., như chất lượng phụ thuộc vào từng loài cá, mùa 1990); vi nấm Mortierella alpina S-4 đạt 23,6% vụ, vi trí đánh bắt, sự nhiễm tạp của dầu cá do (Shinmen và ctv., 1992), Saprolegnia parasitica 1 Phòng Sinh Học Thực Nghiệm – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2. * Email: vominhson@yahoo.com 38 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
  2. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 đạt 3,9% (Kendrick và Ratledge, 1992); từ vi tảo hàm lượng sterol cao cần thiết cho sự phát triển biển quang dưỡng như Isochrysis galbana đạt của tôm, tích lũy HUFA (ω-3 và ω-6), protein, 6,7% (Alonso và ctv., 1992), Nannochloropsis carbonhydrate, sắc tố và vitamin. Các yếu tố oculata đạt 12,9% (Chini Zittelli và ctv., 1999); dinh dưỡng này giúp cho ấu trùng tôm phát và nhóm vi tảo biển dị dưỡng (Thraustochytrid triển nhanh, tỉ lệ sống cao, tôm post khỏe mạnh và labyrinthulid) có khả năng tích lũy HUFA (Barclay, 2006). Tảo Schizochytrium sp. còn cao như tảo Crypthecodinium cohnii đạt 30% được sử dụng làm giàu luân trùng và Artemia (Kyle và Gladue, 1991), tảo Schizochitryum giúp cho ấu trùng cá biển phát triển tốt và bổ sp. đạt 35-40% (Yokochi và ctv., 1998) và sung EPA và DHA cho cá bố mẹ giúp tăng Thraustochytrium aureum ATCC 34304 đạt cường chất lượng trứng và tinh trùng (Castillo khoảng 50% (Bajpai và ctv., 1991). Hiện nay, và ctv., 2009; Harel và ctv., 2002). các nhà khoa học đặc biệt quan tâm tới nhóm vi sinh vật thuộc nhóm tảo biển hay nấm biển II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP dị dưỡng, bởi chúng có khả năng sinh trưởng NGHIÊN CỨU nhanh, sinh khối cao, tích lũy acid béo mạch dài 2.1 Vật liệu đa nối đôi cao (Barclay, 1992). Mẫu lá Đước (Rhizophora apiculata Thraustochytrid là sinh vật đơn bào nước Blume, thuộc họ Đước Rhizophoraceae) và lá mặn (marine protist) hay vi sinh vật giống Mắm (Avicennia sp. Vierrh, thuộc họ Cỏ roi nấm (fungi-like microbe), hay còn gọi là tảo ngựa Verbenaceae) đang trong giai đoạn phân biển dị dưỡng (marine heterotrophic) được hủy tại các rừng ngập mặn thuộc xã Tam Hiệp, xếp vào lớp Labryinthulomycetes, ngành huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chi Minh và Heterokontophyta, giới Chromista, bao gồm huyện Năm Căn, tỉnh Cà Mau. các giống Thraustochytrium, Aplanochytrium, Môi trường phân lập đã được cải tiến có Japonochytrium, Ulkenia, và Schizochytrium. kí hiệu GPYc (Hồng và ctv., 2008) bao gồm: Thraustochytrid thường gặp ở vùng cửa glucose (20 g/l), cao nấm men (4 g/l), agar (16 sông, vùng rừng ngập mặn, kiểu dinh dưỡng g/l) và nước biển có độ mặn 25‰. Môi trường hoại sinh, phân hủy các hợp chất hữu cơ và sau khi hấp tiệt trùng, đợi nguội, bổ sung thêm trầm tích (Kamlangdee và Fan, 2003). Nhóm kháng sinh, bao gồm Streptomiceine 50000 IU/ Thraustochytrid có khả năng sử dụng đa dạng ml (0,1%), Peniciline 50000 IU/ml (0,1%) và các nguồn carbon và nitrogen (Goldstein, 1963), Ampiciline 50000 IU/ml (0,1%). tiết ra enzyme ngoại bào cellulase, amylase (Raghu-kumar, 2002) và ngoài ra còn tích lũy Môi trường lỏng sau khi phân lập (Hồng và carotenoid (Carmona và ctv., 2003). ctv., 2008), vi tảo được nuôi cấy trên môi trường cơ bản M1 cải tiến, có thành phần glucose (30 Sinh khối tảo Schizochytrium sp. khô hay g/l), cao nấm men (10 g/l) và nước biển có độ tươi được sử dụng dùng làm thức ăn trực tiếp cho ấu trùng tôm hay làm giàu thông qua luân mặn 25‰. Hấp tiệt trùng 121oC, 1 atm, trong 15 trùng và Artemia. Tảo Schizochytrium sp. có phút trước khi sử dụng. nhiều ưu điểm thích hợp cho việc ương nuôi ấu Hóa chất Nile Red/DMSO (Sigma) dùng trùng tôm như kích thước nhỏ hơn 50μm, chứa nhuộm lipid. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 39
  3. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.3 Định lượng lipid tổng số 2.2.1 Phương pháp phân lập Sau khi định tính lipid, tiến hành nuôi cấy Vi tảo Schizochytrium được phân lập theo các chủng trong erlen 500 ml có chứa 250 ml phương pháp của Yokochi và ctv., (1998). Các môi trường M1 trong 4 ngày ở 28oC và lắc 200 mẫu lá Đước và lá Mắm được rửa bằng nước rpm. Sau 4 ngày nuôi cấy, sinh khối được thu biển đã khử trùng, sau đó đặt lá vào đĩa petri bằng cách ly tâm dịch tế bào 6.000 rpm ở 4oC vô trùng có chứa nước biển 25‰, dùng tăm trong 10 phút. Bỏ dịch, cặn được cấp đông bông cạo nhẹ trên mặt lá. Sau đó dịch của lá qua đêm trong tủ -80ºC. Sau đó, tiến hành được ly tâm 2000rpm, 4ºC trong 10 phút. Loại đông khô nhằm thu sinh khối khô. Đo lipid bỏ dịch treo, phần còn lại được pha loãng bậc tổng bằng phương pháp Folch, tại phòng Phân 10 trong nước biển. Mỗi nồng độ pha loãng trải tích chất lượng thực phẩm và dinh dưỡng thủy trên 3 đĩa thạch GPYc. Các đĩa này ủ ở nhiệt sản thuộc Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch độ 28ºC, trong tối, khoảng 3-5 ngày tiến hành – Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II. quan sát trên kính hiển vi. Các tế bào tảo Schi- Sau khi định lượng được sinh khối khô của zochytrium có dạng hình tròn, có nhiều tế bào chủng nào có hàm lượng lipid cao nhất, chọn trong 1 nang, hay có các bào tử di động. Chọn chủng đó để tiến hành định danh hình thái và khuẩn lạc tảo Schizochytrium và cấy chuyền làm đối tượng nghiên cứu cho những khảo nhiều lần qua đĩa thạch có chứa môi trường sát tiếp theo. GPYc có bổ sung kháng sinh cho đến khi thu 2.2.4 Định danh tảo bằng hình thái được khuẩn lạc thuần. Quan sát hình thái tế bào tảo theo mô tả của 2.2.2 Định tính lipid bằng phương pháp Raghu-Kumar (1988) để định danh chủng tảo nhuộm với Nile Red phân lập. Khuẩn lạc tảo thuần được cấy trên môi trường M1 lỏng và và quan sát liên tục hình thái Bằng phương pháp nhuộm lipid với Nile tế bào qua các giai đoạn phát triển bằng kính Red để tìm ra được những chủng vi tảo có chứa hiển vi Quang học BX51 (Olympus, Nhật Bản) hạt lipid nhiều hay ít. Phương pháp tiến hành có độ phóng đại 100x. theo mô tả của AAT Bioquest®, Inc. (2012) được tóm tắt như sau Dung dịch Nile Red/DMSO và 2.2.5 Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh đệm PBS có nồng độ 200 –1000 nM, bảo quản ở hưởng tới sự tăng trưởng -20ºC và tránh ánh sáng. Thu sinh khối tảo bằng + Khảo sát môi trường cơ bản và đường cách ly tâm 6000 rpm dịch tế bào trong 10 phút cong tăng trưởng ở 4ºC, sao cho mật độ tế bào đạt khoảng 1-5×105 Khảo sát tăng trưởng của tảo trên các môi (cfu.ml-1). Sau ly tâm, thu cặn, bổ sung 500 μl trường cơ bản nhằm chọn ra môi trường thích dung dịch nhuộm và giữ ở nhiệt độ phòng trong hợp cho nhân giống. Các môi trường khảo sát 5-10 phút, tránh ánh sáng. Sau đó loại bỏ dung được chuẩn bị theo mô tả của các nghiên cứu dịch nhuộm bằng cách ly tâm và rửa lại sinh khối trước đó nhưng được cố định nồng độ đường, bằng đệm PBS. Sau khi nhuộm, tiến hành quan nitơ và nồng độ muối. Các môi trường bao gồm sát ngay bằng kính hiển vi huỳnh quang ở bước M1 (Hồng và ctv., 2008), môi trường M2 (Hon- sóng khoảng 552-636 nm. Tại bước sóng này, hạt da và ctv., 1998) và M3 (Wu và ctv., 2005) được lipid trong tế bào được nhuộm sẽ bắt màu vàng mô tả trong Bảng 1. Chuẩn bị mỗi môi trường cam sáng trên nền tế bào màu đen. 50 ml trong erlen 100 ml, mỗi môi trường lặp 40 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
  4. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 lại 3 lần. Các môi trường hấp tiệt trùng 121oC, log. Nuôi cấy lỏng lắc 200 rpm ở 28oC trong 5 1atm trong 15 phút trước khi sử dụng. Riêng ngày. Theo dõi mật độ tế bào hàng ngày bằng đối với môi trường M2, các thành phần vitami- cách đếm tế bào với buồng đếm hồng cầu và cân ne sẽ được bổ sung sau khi hấp và làm nguội. trọng lượng khô tế bào sau khi lọc ở cùng thể Giống được hoạt hóa trong môi trường lỏng M1 tích, sau đó sấy ở 105oC trong 2 giờ. và được cấy vào các bình với cùng mật độ là 5,3 Bảng 1. Thành phần của các môi trường cơ bản Thành phần Môi trường M1 Môi trường M2 Môi trường M3 Glucose (g.l ) -1 20 20 20 Cao nấm men (g.l-1) 4 4 4 NaCl (g.l-1) 25 25 25 Monosodium glutamate (g.l-1) - 2 - KH2PO4 (g.l ) -1 - 0,1 1 (NH4)2SO4 (g.l-1) - 0,2 - MgSO4. 7H2O (g.l-1) - - 5 CaCl2 (g.l-1) - - 0,2 KCl (g.l-1) - - 1 Vitamine B1 - 0,1 µg/L - Vitamine B12 - 0,01 µg/L - Vitamine H - 2 µg/ml - + Khảo sát đường cong tăng trưởng một mật ban đầu là 5,3 log. Nuôi lỏng lắc 200 Chủng tảo đuợc hoạt hóa trong môi trường rpm trong 5 ngày ở 28oC. Theo dõi mật độ tế cơ bản 4 ngày, sau đó cấy chuyền vào môi bào hàng ngày và cân trọng lượng khô. trường cơ bản tối ưu với mật độ ban đầu là 5,3 + Khảo sát sảnh hưởng của nồng độ log. Nuôi lỏng lắc 200 rpm ở 280C trong 14 muối, glucose, nguồn nitrogen lên sự tăng ngày. Theo dõi sự thay đổi của mật độ tế bào trưởng tế bào (MĐTB), trọng lượng khô (TLK) và kích thước Sử dụng môi trường cơ bản thích hợp để tế bào (KTTB) mỗi ngày. làm môi trường cho khảo sát các nồng độ muối 10, 15, 20; 25 và 30‰; nồng độ glucose: 20; + Khảo sát pH 30; 40; 50 và 60 g/l; Khảo sát ở các nguồn nitơ Sử dụng môi trường cơ bản thích hợp để hữu cơ và vô cơ: cao nấm men 4 (g/l), peptone làm môi trường cho khảo sát pH. Các thành 4 (g/l), monosodium glutamate 1 (g/l), NaNO3 phần môi trường được cố định, chỉ thay đổi 1 (g/l) và NH4Cl 1 (g/l). Các nghiệm thức được nồng độ pH của các nghiệm thức. Các nghiệm chuẩn bị trong các bình erlen 100 ml chứa 50 ml thức được chuẩn bị trong các bình erlen 100 ml môi trường khảo sát. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 chứa 50 ml môi trường khảo sát. Khảo sát ở các lần. Chủng khảo sát được cấy vào mỗi bình với giá trị pH 5; 6; 7; 8 và 9. Mỗi nghiệm thức lặp cùng một mật ban đầu là 5,3 log. Nuôi lỏng lắc lại 3 lần. Chủng khảo sát được hoạt hóa trên môi 200 rpm trong 5 ngày ở 28oC. Theo dõi mật độ trường M1 và được cấy vào mỗi bình với cùng và cân trọng lượng khô. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 41
  5. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 + Đánh giá ảnh hưởng của môi trường tối 2.2.6 Xử lý số liệu ưu lên sự phát triển của chủng tảo phân lập Sử dụng phân tích ANOVA một yếu tố để Môi trường cơ bản thích hợp ở trên được sử phân tích số liệu. Khi bảng ANOVA xác định dụng làm môi trường khảo sát trong thí nghiệm sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nhóm, phép so này. Các thành phần khác của môi trường đều sánh multiple comparision test (Tukey’s) được được cố định, chỉ thay đổi các giá trị pH, nồng sử dụng để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa có ý độ muối, nồng độ đường và nguồn nitơ thích nghĩa thống kê (p
  6. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Khuẩn lạc ĐCM (a) có đặc điểm tròn, màu 3.2. Chọn lọc chủng tích lũy lipid cao trắng đục, nhám, tâm nhăn và lồi, viền bóng và nhất đều. Tế bào ĐCM (b) khi trưởng thành tạo thành 3.2.1. Định tính lipid bằng phương pháp nang bào tử, hình tròn có đường kính khoảng từ nhuộm với Nile Red 3,0 – 14,0 µm, bên trong nang có chứa nhiều bào Sau khi nhuộm và quan sát dưới kính hiển tử hình cầu nhỏ. Khuẩn lạc của chủng MCG (c) vi huỳnh quang ở bước sóng 552 – 632 nm cho có hình tròn, màu vàng, nhám, viền bóng và đều. thấy tế bào của cả 2 chủng MCG và ĐCM đều Tế bào MCG (d) khi trưởng thành tạo thành nang bắt màu vàng cam sáng (Hình 2). Điều này bào tử, hình tròn, bên trong chứa nhiều nang nhỏ chứng tỏ 2 chủng đều tích trữ lipid. và mỗi nang chứa nhiều bào tử có hình cầu. (a) (b) Hình 2. Tế bào chụp dưới kính hiển vi huỳnh quang (40X) ở bước sóng 552 - 632 nm sau khi được nhuộm với Nile Red, MCG (a) và ĐCM (b). 3.2.2. Định lượng lipid tổng số Bảng 3. Kết quả định lượng lipid tổng Kết quả định luợng lipid được thể hiện ở Khối Hàm Bảng 3. Các chủng trên được nuôi cấy trong lượng lượng Tên môi trường lỏng M1 (chỉ có các thành phần cơ Trạng thái mẫu mẫu lipid mẫu bản) ở 28 oC trong 4 ngày để thu sinh khối. Theo tổng kết quả trong Bảng 3, chủng ĐCM có tỷ lệ phần (g TLK) (%) trăm lipid tổng (26,65%) cao hơn gấp ba lần so Mẫu đông khô MCG 3,12 8,62 với mẫu MCG (8,62%). màu vàng nhạt Mẫu đông khô ĐCM 3,81 26,65 màu vàng nhạt TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 43
  7. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 3.2.3. Định danh bằng hình thái chủng vi triển thành tế bào sinh dưỡng (Hình 3c). Hình d, tảo được chọn e, và f, tế bào nhị phân liên tục tạo thành cụm tế Chủng ĐCM được hoạt hóa và cấy chuyển bào có 2, 4 và 8 tế bào). sang môi trường M3. Theo dõi liên tục hình thái Dựa theo khoá phân loại giống tế bào. Trong Hình 3a, nang tế bào truởng thành Schizochytrium của Raghu-Kumar (1988) chứa nhiều bào tử. Sau 6 giờ, nang tế bào trưởng cho thấy chủng ĐCM có đặc tính và hình thành phóng thích động bào tử (Hình 3b), động thái giống tảo Schizochytrium mangrovei bào tử có hai tiêm mao. Mỗi động bào tử phát Raghu-Kumar. Hình 3. Sự phát triển hình thái tế bào của chủng ĐCM được quan sát bằng kính hiển vi quang học (độ phóng đại 100X) 44 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
  8. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 3.2.4. Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh chủng S. mangrovei ĐCM khi nuôi trên môi hưởng tới sự tăng trưởng của tảo trường M1 (MĐTB: 7,46 ± 0,04 log; TLK: 8,39 3.2.4.1. Khảo sát môi trường cơ bản và ± 0,42 mg/ml) và môi trường M3 (MĐTB: 7,53 đường cong tăng trưởng ± 0,05 log; TLK: 11,89 ± 0,23 mg/ml) cao khác Thí nghiệm này tiến hành khảo sát 3 môi biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với môi trường trường cơ bản M1, M2, M3 (thành phần được M2 (mật độ: 7,05 ± 0,11 log; TLK: 1,47 ± 0,11 nêu trong Bảng 1), chủng Schizochytrium mg/ml). Trong đó, TLK của tảo được nuôi trong mangrovei ĐCM được hoạt hóa, sau đó cấy môi trường M3 cao nhất và khác biệt có ý nghĩa chuyển vào môi trường với mật độ ban đầu là (p < 0,05) so với môi trường M1 và M2. Kết quả 5,3 (log). Kết quả thí nghiệm cho thấy, mật độ thí nghiệm được thể hiện trong Bảng 4. tế bào (MĐTB) và trọng lượng khô (TLK) của Bảng 4. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của tảo S. mangrovei ĐCM được nuôi trên 3 môi trường trong 5 ngày Mật độ tế bào Môi trường Trọng lượng khô (mg/ml) (log cfu/ml) M1 7,46 ± 0,04a 8,39 ± 0,42B M2 7,05 ± 0,11b 1,47 ± 0,11C M3 7,53 ± 0,05a 11,89 ± 0,23A Sự thay đổi mật độ, trọng lượng khô và thước tăng dần đến ngày thứ 10 (12,29 µm). kích thước tế bào khi nuôi trên môi trường Từ ngày 10 đến ngày 14 (10,87 µm) KTTB M3 cho thấy (Hình 4) MĐTB ban đầu (5,30 giảm dần. Điều này có thể lý giải là do tế bào ± 0,06 log) tăng rất nhanh từ ngày đầu tiên trưởng thành phóng thích bào tử nên kích (7,74 ± 0,03 log) và ổn định cho đến ngày thứ thước trung bình giảm dần. 10 (7,78 ± 0,03 log). Từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 14 (7,54 ± 0,05 log) MĐTB bắt đầu giảm nhẹ. Trong khi đó, TLK của tế bào tương ứng với mật độ ban đầu chỉ đạt 0,02 ± 0,01 (mg/ ml) đã bắt đầu tăng mạnh đến ngày thứ 3 (9,68 ± 0,02 mg/ml) và duy trì ổn định đến ngày thứ 10 (9,41 ± 0,34 mg/ml). Từ ngày thứ 10 thì giảm dần đến ngày thứ 14 (8,48 ± 0,35 mg/ ml). KTTB từ môi trường hoạt hóa ban đầu có kích thước lớn 14,1 (µm). Sau 1 ngày giảm Hình 4. Diễn biến sự thay đổi của mật độ tế mạnh còn 6,3µm do quá trình phóng thích bào bào, trọng lượng khô và kích thước tế bào của chủng S. mangrovei ĐCM sau khi nuôi 14 ngày tử hàng loạt, các bào tử được giải phóng ban trên môi trường M3. đầu có kích thước nhỏ sau đó phát triển kích TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 45
  9. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 3.2.4.2. Ảnh hưởng các yếu tố môi trường log) cao khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với lên tăng trưởng các môi trường có pH 7, 8, 9. Đối với chỉ tiêu + Khảo sát ảnh hưởng của pH TLK, ở pH 6 (3,24 ± 0,10 log) cao khác biệt có Chủng S. mangrovei ĐCM có khả năng ý nghĩa (p < 0,05) so với các môi trường có pH phát triển trên môi trường pH từ 5 – 9. MĐTB còn lại. Tóm lại, tảo S. mangrovei ĐCM phát ở các pH 5 (7,19 ± 0,02 log), pH 6 (7,21 ± 0,01 triển tốt nhất ở pH 6 (Hình 5). Hình 5. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của tảo S. mangrovei ĐCM được nuôi trên các môi trường có pH khác nhau sau 5 ngày. + Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối TLK của tảo S. mangrovei ĐCM khi nuôi ở các Chủng S. mangrovei ĐCM có khả phát nồng độ muối 25‰ (11,23 ± 1,25 mg/ml) và triển ở các nồng độ muối từ 10‰ đến 30‰. 30‰ (11,83 ± 0,15 mg/ml) cao khác biệt có ý MĐTB ở các nồng độ muối khác nhau khác nghĩa (p < 0,05) so với các nồng độ muối khác biệt không có ý nghĩa (p > 0,05). Tuy nhiên, (Hình 6). Hình 6. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của tảo S. mangrovei ĐCM được nuôi trên các môi trường có nồng độ muối khác nhau sau 5 ngày. 46 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
  10. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 + Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 0,09 log) và 50 g/l (7,39 ± 0,08 log) khác biệt glucose không có ý nghĩa (p > 0,05). TLK ở nồng độ Chủng S. mangrovei ĐCM đều có khả glucose 60 g/l (22,57 ± 0,31 mg/ml) cao khác năng phát triển tốt ở các nồng độ đường từ 20 biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với những nồng - 60 g/l (Hình 7). MĐTB ở nồng độ đường 60 độ còn lại. TLK ở nồng độ glucose 50 g/l và g/l (7,54 ± 0,11 log) cao khác biệt có ý nghĩa 60 g/l khác biệt khng có ý nghĩa thống kê (p (p < 0,05) so với nồng độ 30 g/l (7,31 ± 0,10 < 0,05). Do vậy, trong thí nghiệm khảo sát log). MĐTB ở các nồng độ 20 g/l (7,46 ± 0,35 môi trường TU của đề tài, sử dụng nồng độ log), 30 g/l (7,31 ± 0,10 log), 40 g/l (7,43 ± glucose 50 g/l. Hình 7. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của tảo S. mangrovei ĐCM được nuôi trên các môi trường có nồng độ glucose khác nhau sau 5 ngày. Theo báo cáo của Wu và ctv., (2005) cho nitơ khác nhau. Xét về TLK, giữa các nguồn thấy, nồng độ glucose thích hợp nhất cho sự nitơ không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > phát triển của chủng Schizochytrium sp. S31 là 0,05). Xét về MĐTB có sự khác biệt rõ rệt. Cao trong khoảng 20 – 40 g/l. Còn trong báo cáo của nấm men (7,46 ± 0,04 log) và peptone (7,63 ± Hồng và ctv., (2007) cho thấy, đối với chủng 0,10 log) có MĐTB cao khác biệt có ý nghĩa (p Schizochytrium PQ6 và PQ7, nồng độ glucose < 0,05) so với các môi trường chứa các nguồn thích hợp trong khoảng 60 – 90 g/l. Trong nitơ khác. Môi trường chứa NH4Cl (6,31 ± 0,03 nghiên cứu này cho thấy nồng độ 50g/l được log) có MĐTB thấp nhất khác biệt có ý nghĩa (p cho là thích hợp cho tăng sinh khối và mật độ tế < 0,05) so với các nguồn nitơ còn lại. Vậy tảo bào tảo S. mangrovei ĐCM. S. mangrovei ĐCM có khả năng sử dụng các + Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitơ nguồn nitrogen theo thứ tự: peptone, cao nấm Chủng S. mangrovei ĐCM có khả năng phát men (yeast extract), monosodium glutamate, triển được trong môi trường chứa các nguồn NaNO3, NH4Cl. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 47
  11. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Theo dõi sự phát triển hàng ngày của chủng Trong khi đó, ở môi trường chứa NH4Cl, tế bào Schizochytrium ĐCM trong các môi trường chứa phát triển không bình thường, kích thước tế bào các nguồn nitơ khác nhau cho thấy, tế bào trong nhỏ và trọng lượng khô thấp. Ở môi trường có các môi trường chứa cao nấm men, peptone và chứa NaNO3 quan sát thấy, kích thước của tế monosodium glutamate đều phát triển tốt về bào lớn và trọng lượng tế bào cao nhưng ngược mật độ, trọng lượng khô và kích thước tế bào. lại mật độ tế bào thấp. Hình 8. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của tảo Schizochytrium ĐCM được nuôi trên các môi trường có nguồn nitơ khác nhau sau 5 ngày. + Đánh giá ảnh hưởng của môi trường chọn ra nồng độ tối ưu như sau: Môi trường tối tối ưu ưu (MTTU) bao gồm: glucose (50g/l), cao nấm Dựa trên môi trường cơ bản M3 và đồng thời men (4g/l), monosodium glutamate (1g/l), NaCl thay đổi các giá trị pH, nồng độ muối và đường, (25g/l), CaCl2 (0,2g/l), KCl (1g/l), KH2PO4 nguồn nitơ thông qua các kết quả khảo sát trên (1g/l), MgSO4.7H2O (5g/l) và pH 6. Hình 9. Mật độ tế bào, trọng lượng khô và kích thước tế bào của chủng S. mangrovei ĐCM sau khi nuôi 14 ngày trên môi trường MTTU. 48 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
  12. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Kết quả khảo sát trên MTTU cho thấy khi nuôi môi trường tối ưu. MĐTB ban đầu là 5,30 ± 0,06 log sau 1 ngày Theo nghiên cứu của Barclay (2006) đã chỉ đã đạt trạng thái cân bằng 7,65 ± 0,06 log. Duy ra rằng, chi Schizochytrium phát triển tốt trong trì trạng thái cân bằng từ ngày thứ nhất (7,65 môi trường có pH từ 6,0 – 8,5 nhưng tùy theo ± 0,06 log) đến ngày thứ 14 (7,55 ± 0,01 log). từng loài sẽ có khoảng pH tối ưu riêng cho sự Trong khi đó, TLK ở ngày 0 (0,02 ± 0,01 mg/ phát triển tế bào và tích lũy lipid của loài đó. ml) vẫn tăng mạnh đến ngày thứ 6 (19,03 ± 0,42 Theo kết quả thí nghiệm có thể thấy, đối với mg/ml) sau đó duy trì cân bằng tới ngày thứ 10 chủng S. mangrovei ĐCM, có khả năng phát (18,62 ± 0,39 mg/ml). Từ ngày thứ 10 đến ngày triển tốt trên môi trường có tính acid (pH = 5 thứ 14 (17 ± 0,78 mg/ml) bắt đầu giảm nhẹ. và pH = 6). KTTB ở ngày 0 là 14,1 µm, sau 1 ngày giảm Theo báo cáo của Barclay (2006) đã chỉ ra mạnh còn 5,1 µm. Từ ngày 1 (5,1 µm) cho đến rằng chi Schizochytrium có khả năng sống trong ngày thứ 4 (12,5 µm) tăng mạnh, sau đó tăng môi trường có nồng độ muối dưới 75‰ nhưng chậm đến ngày thứ 14 (14,31 µm). tốt hơn nếu nồng độ muối nhỏ hơn 50‰ và tốt Kết quả trên cho thấy trên MTTU, chủng S. nhất là ở 25‰. Schizochytrium N-2 được phân mangrovei ĐCM đã đạt mật độ cực đại và kích lập từ những lá già của cây Đước (Kandelia thước tế bào tương đương khi nuôi trên môi candel) tại Hong Kong, có khả năng phát triển trường cơ bản M3. Tuy nhiên trọng lượng khô trên môi trường có độ mặn từ 0 – 30 ‰ và độ tăng gấp hơn 2 lần (M3: 9,68mg/ml, MTTU: mặn tối ưu cho sự phát triển dao động từ 20 – 19,15 mg/ml). 30 ‰ (Kamlangdee và Fan, 2003). Theo Leaño IV. THẢO LUẬN và ctv., (2003) thử nghiệm điều kiện nuôi cấy các chủng Schizochytrium mangrovei (IAo-1 và Leaño và ctv., (2003) phân lập được chủng IXm-6) và chủng Schizochytrium sp. BSn-1, cho Schizochytrium mangrovei (IAo-1 and IXm- thấy chúng phát triển tốt ở độ mặn 15 – 30‰ và 6), và Schizochytrium sp. BSn-1 có hàm lượng nhiệt độ 20 -30 oC, đạt sinh khối khô 7 mg/ml và lipid tổng số 16%-39%. Wu và ctv., (2005) khảo sát khả năng tích luỹ lipid tổng số của hàm lượng lipid tổng số 16 – 39%. Kết quả thí chủng Schizochytrium sp. S31 (ATCC 20888) nghiệm cho thấy, chủng Schizochytrium ĐCM đạt 40% trọng lượng khô. Ở Việt Nam, chủng cũng phát triển tốt nhất ở nồng độ muối từ 25 - tảo Schizochytrium PQ6 và PQ7 được phân lập 30‰. Điều này phù hợp với những nghiên cứu từ lá Đước ở vùng biển Phú Quốc có khả năng trước đây. tích luỹ lipid tổng số đạt 38%-41% trọng lượng Theo báo cáo của Wu và ctv., (2005) cho khô (Hồng và ctv., 2008). Trong nghiên cứu này thấy, nồng độ glucose thích hợp nhất cho sự chúng tôi phân lập được chủng tảo ĐCM có phát triển của chủng Schizochytrium sp. S31 là khả năng tích luỹ lipid tổng số đạt 26,7% trọng trong khoảng 20 – 40 g/l. Còn trong báo cáo của lượng khô khi nuôi trên môi trường cơ bản. Do Hồng và ctv., (2007) cho thấy, đối với chủng đó chủng ĐCM có tiềm năng tích lũy lipid cao Schizochytrium PQ6 và PQ7, nồng độ glucose TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 49
  13. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 thích hợp trong khoảng 60 – 90 g/l. Trong 5.2. Đề nghị nghiên cứu này cho thấy nồng độ 50g/l được Cần nghiên cứu thêm các điều kiện nuôi cho là thích hợp cho tăng sinh khối và mật độ tế cấy nhằm nâng cao hàm lượng lipid và HUFA. bào tảo S. mangrovei ĐCM. Thử nghiệm ứng dụng tảo S.mangrovei Theo mô tả của Wu (2005) khảo sát các ĐCM làm giàu luân trùng và Artemia nhằm nguồn nitơ khác nhau cho thấy cao nấm men nâng cao tỉ lệ sống một số ấu trùng cá biển. (0,4%) thích hợp cho tảo Schizochytrium sp. phát Thử nghiệm dùng tảo S.mangrovei ĐCM triển tăng sinh khối, tích lũy lipid và DHA. Còn làm thức ăn cho zoea tôm thẻ, ương nuôi động đối với các nguồn nitơ khác như monosodium vật hai mảnh vỏ. glutamate, NH4Cl và NaNO3 thì monosodium glutamate 0,1% cho kết quả cao nhất cho quá LỜI CẢM ƠN trình tích lũy lipid và phát triển tế bào. Để hoàn thành nghiên cứu này, tôi xin chân V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ thành cảm ơn các Anh Chị ở phòng Nguồn Lợi 5.1. Kết luận và Khai thác thủy sản nội địa (Viện Nghiên Cứu Kết quả phân lập được chủng tảo dị dưỡng Nuôi Trồng Thủy Sản II) đã giúp thu mẫu. Tôi Schizochytrium mangrovei ĐCM có khả năng chân thành cảm ơn Ban Lãnh Đạo phòng Sinh tích lũy lipid tổng số 26,65%. Tảo S. mangrovei học Thực nghiệm và Viện Nghiên Cứu NTTS II ĐCM phát triển thích hợp ở pH 5-6, nồng độ đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất cho tôi thực muối 25-30‰, nồng độ đường 50-60 g/l, nguồn hiện nghiên cứu này. Xin cảm ơn các bạn sinh nitơ thích hợp bao gồm peptone, cao nấm men viên trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ đã và monosodium glutamate. cùng tôi nghiên cứu đề tài này. TÀI LIỆU THAM KHẢO Akimoto, M., Ishii, T., Yamagaki, K., Ohtaguchi, K., Barclay, W. R., 1992. Process for the heterotrophic Koide, K., and Yazawa, K., 1990. Production of production of microbial products with high eicosapentaenoic acid by a bacterium isolated concentrations of omega-3 highly unsaturated from mackerel intestines. Journal of the American fatty acids. U.S. Patent 5, 130, 242. Oil Chemists’ Society 67, 911-915. Barclay, W. R., 2006. Schizochytrium and Alonso, D. L., Grima, E. M., Pérez, J. A. S., Sánchez, J. Thraustochytrium strains for producing high L. G., and Camacho, F. G., 1992. Isolation of clones concentrations of omega-3 unsaturated fatty of Isochrysis galbana rich in eicosapentaenoic acids, Martek Biosciences Corporation, United acid. Aquaculture 102, 363-371. States Patent 7,022,512 B2. Ando, S., Nakajima, K., and Hatano, M., 1992. Carmona, M. L., Naganuma, T., and Yamaoka, Y., 2003. Incorporation of n-3 polyunsaturated fatty Identification by HPLC-MS of carotenoids of the acids into phospholipids of a marine bacterium Thraustochytrium CHN-1 strain isolated from the Vibrio sp. cultivated with sardine oil. Journal of Seto Inland Sea. Biosci Biotechnol Biochem 67, Fermentation and Bioengineering 73, 169-171. 884-8. Bajpai, P., Bajpai, P., and Ward, O., 1991. Production Chini Zittelli, G., Lavista, F., Bastianini, A., Rodolfi, of docosahexaenoic acid by Thraustochytrium L., Vincenzini, M., and Tredici, M. R., 1999. aureum. Applied Microbiology and Biotechnology Production of eicosapentaenoic acid by 35, 706-710. Nannochloropsis sp. cultures in outdoor tubular 50 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
  14. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 photobioreactors. Journal of Biotechnology 70, mangroves, Philippines. Fungal Diversity 12, 299-312. 111-122. Goldstein, S., 1963. Development and nutrition of new Product Technical Information Sheet, 2012. Nile Red species of Thraustochytrium. American Journal of *UltraPure Grade*, AAT Bioquest®, Inc., US. Botany 50, 271-279. Raghu-Kumar, S., 1988. Schizochytrium mangrovei sp. Gunstone, F. D., 1996. Fatty acid and lipid chemistry. now., a Thraustochytrid from mangroves in India. Blackie Academic, London. Trails. Br. My col. Soc. 90, 627-631. Honda, D., Yokochi, T., Nakahara, T., Erata, M., and Raghu-kumar, S., 2002. Ecology of the marine protists, Higashihara, T., 1998. Schizochytrium limacinum the Labyrinthulomycetes (Thraustochytrids and sp. nov., a new thraustochytrid from a mangrove Labyrinthulids). European Journal of Protistology area in the west Pacific Ocean. Mycological 38, 127-145. Research 102, 439-448. Ringø, E., Jøstensen, J., and Olsen, R., 1992. Production Hồng, Đ. D., Anh, H. L., and Thu, N. T. H., 2008. Phân of eicosapentaenoic acid by freshwater Vibrio. lập được vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium giàu Lipids 27, 564-566. DHA ở vùng biển huyện đảo Phú Quốc. Tạp chí Shinmen, Y., Kawashima, H., Shimizu, S., and Yamada, sinh học 30, 50-55. H., 1992. Concentration of eicosapentaenoic acid Hồng, Đ. D., Hiền, H. M., Hưng, N. Đ., Nam, H. S., and docosahexaenoic acid in an arachidonic Anh, H. L., Thu, N. H., and Chi, Đ. K., 2007. acid-producing fungus, Mortierella alpina 1S-4, Nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp DHA từ grown with fish oil. Applied Microbiology and các loài vi tảo biển dị dưỡng mới Labyrinthula, Biotechnology 38, 301-304. Schizochytrium và ứng dụng. Tạp Chí Khoa Học Sijtsma, L., and Swaaf, M. E., 2004. Biotechnological và Công Nghệ 45, 144-154. production and applications of the ω-3 Kamlangdee, N., and Fan, K. W., 2003. Polyunsaturated polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid. fatty acids production by Schizochytrium sp. Applied Microbiology and Biotechnology 64, isolated from mangrove. Songklanakarin J. Sci. 146-153. Technol. 25, 643-650. Watanabe, T., 1993. Importance of docosahexaenoic Kanazawa, A., Teshima, S., and Endo, M., 1979. acid in marine larval fish. Journal of the World Requirements of prawn Penaeus japonicus for Aquaculture Society 24, 152-161. essential fatty acids. Memories of the Faculty of Watanabe, T., and Vassallo-Agius, R., 2003. Broodstock Fisheries of Kagoshima University 28, 27-33. nutrition research on marine finfish in Japan. Kendrick, A., and Ratledge, C., 1992. Lipids of Aquaculture 227, 35-61. selected molds grown for production of n-3 and Wu, S.-T., Yu, S.-T., and Lin, L.-P. (2005). Effect of n-6 polyunsaturated fatty acids. Lipids 27, 15-20. culture conditions on docosahexaenoic acid Kyle, D. J., and Gladue, R. M., 1991. Eicosapentaenoic production by Schizochytrium sp. S31. Process acids and methods for their production. Biochemistry 40, 3103-3108. International Patent Application, Patent Yokochi, T., Honda, D., Higashihara, T., and Nakahara, Cooperation Treaty Publication WO 91/14427, T., 1998. Optimization of docosahexaenoic acid October 3, 1991. production by Schizochytrium limacinum SR21. Leaño, E. M., Gapasin, R. S. J., Polohan, B., and Applied Microbiology and Biotechnology 49, Vrijmoed, L. L. P., 2003. Growth and fatty 72-76. acid production of thraustochytrids from Panay TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 51
  15. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 RESULTS OF ISOLATION OF Schizochytrium MANGROVE WITH HIGH LIPID FOR AQUACULTURE Vo Minh Son1*, Vuong Thi Hong Hanh1 ABSTRACT PUFA is essential nutrient for aquatic animal, promoting growth, increasing survival rate and repro- ductivity, improving FCR. Because PUFA/HUFA supplying source is limitated from animals and plants, many scientist are looking for PUFA/HUFA supplying from micro-bacteria and microalgae in which heterotrophic microalgae (or marine fungi) have ability to stimulate high unsaturated fatty acid. This research, heterotrophic microalgae were isolated from leaf of mangrove in Can Gio and Nam Can province and evaluation of culture condition. The result showned that Schizochitryum mangrove ĐCM had ability to stimulate 26,65% total lipid. S. mangrove ĐCM was culture in the medium with pH 5-6, salinity 25-30%0, 50-60 g/l glucose, and nitrogen source is from peptone, yeast extract, and monosodium glutamate. Keywords: HUFA, Schizochytrium, heterotrophic microalgae. Người phản biện: TS. Đặng Tố Vân Cầm Ngày nhận bài: 29/5/2015 Ngày thông qua phản biện: 10/6/2015 Ngày duyệt đăng: 15/6/2015 1 Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No 2. * Email: vominhson@yahoo.com 52 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
nguon tai.lieu . vn
Nông nghiệp Ngư nghiệp Lâm nghiệp Sinh học Hoá học Ngôn ngữ học Ngân hàng - Tín dụng