- Trang Chủ
- Nông nghiệp
- Hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne spp. của vi khuẩn Bacillus velezensis EK7 ở vùng rễ cây hồ tiêu
Xem mẫu
- TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HTKH 2019
HOẠT TÍNH KHÁNG TUYẾN TRÙNG Meloidogyne spp.
CỦA VI KHUẨN Bacillus velezensis EK7 Ở VÙNG RỄ CÂY HỒ TIÊU
TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG1,*, LÊ KHÁNH LINH 2
NGUYỄN ANH DŨNG2,**, LÊ THỊ ÁNH HỒNG3,***
1
Khoa KHTN&CN, Trường Đại học Tây Nguyên
2
Viện CNSH&MT, Trường Đại học Tây Nguyên
3
Viện Sinh học nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh
*
Email: tthtrang@ttn.edu.vn
**
Email: nazdungtaynguyenuni@gmail.com
***
Email: anhhongbi@yahoo.com
Tóm tắt: Tuyến trùng nốt rễ Meloidogyne spp. là nhóm đối tượng gây hại phổ biến
trên cây hồ tiêu (Piper nigrum). Nghiên cứu được tiến hành nhằm tuyển chọn, định
danh và đánh giá hoạt tính kháng tuyến trùng của chủng vi khuẩn vùng rễ ứng dụng
trong phòng trừ tuyến trùng gây bệnh trên cây hồ tiêu. Kết quả nghiên cứu đã tuyển
chọn được chủng vi khuẩn EK7 có khả năng kháng tuyến trùng cao trong điều kiện
in vitro với tỷ lệ tử vong 99%. Chủng này được định danh bằng giải trình tự gen 16S
rRNA với tên khoa học là Bacillus velezensis EK7. Nghiên cứu cơ chế kháng tuyến
trùng của chủng EK7 được thực hiện bằng đánh giá ảnh hưởng của enzyme đến tỷ
lệ tử vong tuyến trùng. Kết quả cho thấy, chitinase thu nhận từ chủng EK7 có thể tác
động lên tỷ lệ tử vong của tuyến trùng tại thời điểm 24h và tỷ lệ nở của trứng tuyến
trùng vào các thời điểm khảo sát 24h, 48h, 72h. Enzyme protease chỉ tác động tỷ lệ
nở của trứng tuyến trùng vào thời điểm 72h.
Từ khóa: Tuyến trùng, vi khuẩn vùng rễ, protease, chitinase, Bacillus velezensis.
1. MỞ ĐẦU
Hồ tiêu (Piper nigrum L.) là cây công nghiệp có giá trị kinh tế và xuất khẩu cao của Việt
Nam. Hiện nay, diện tích hồ tiêu vẫn tiếp tục tăng, tính đến tháng 12/2018, cả nước đã trồng
trên 150.000 ha (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn). Ở nước ta, vùng trồng tiêu lớn nhất
hiện nay tập trung ở các tỉnh Đông Nam Bộ (Bình Phước, Bà Rịa - Vũng Tàu và Đồng Nai),
Tây Nguyên (Đắk Nông, Đắk Lắk và Gia Lai). Tuy nhiên, do lợi nhuận kinh tế cao từ cây tiêu
đem lại nên gây ra tình trạng phát triển cây hồ tiêu ồ ạt và không theo quy hoạch. Cả nước đang
đối mặt với nhiều thách thức và phát triển thiếu bền vững, nhất là diện tích hồ tiêu phát triển
quá nhanh, vườn cây được đầu tư thâm canh cao độ, nhiều vườn tiêu bị hủy diệt do sự phá hại
của sâu bệnh… gây thiệt hại lớn cho bà con nông dân (Hoàng Thanh Tiệm và cộng sự, 2007).
Trong đó, tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. là một trong những nhóm đối tượng gây hại rất
phổ biến trên cây hồ tiêu còn gọi là tác nhân gây bệnh vàng lá, chết chậm (Trần Thị Thu Hà và
cộng sự, 2011). Theo Cục Bảo vệ Thực vật, tháng 4/2019 trên cả nước tổng diện tích hồ tiêu bị
nhiễm bệnh chết chậm là 6,759 ha (tăng 87 ha so với cùng kỳ trước, tăng 1,675 ha so với cùng
kỳ năm trước), nhiễm nặng 1.815 ha. Các biện pháp kiểm soát tuyến trùng chủ yếu bao gồm
các biện pháp hóa học, sinh học, vật lý và sử dụng giống cây trồng kháng bệnh. Việc sử dụng
thuốc hóa học tiêu diệt tuyến trùng thường gây ô nhiễm môi trường và tồn dư các độc tính. Vì
vậy, biện pháp sinh học được xem là giải pháp tối ưu nhất với các tác nhân phòng trừ trong đó
có vi khuẩn (Cetintas và cộng sự, 2018).
Vi khuẩn vùng rễ có thể được sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học vì chúng là nhóm
vi khuẩn sống ở vùng rễ dưới dạng vi sinh vật đất có vai trò quan trọng trong việc đối kháng vi
sinh vật gây bệnh hại ký chủ và kích thích sinh trưởng của cây trồng (Kloepper và cộng sự, 1992).
368
- HỘI THẢO KHOA HỌC QUỐC GIA CÁC NHÀ NGHIÊN CỨU TRẺ | 11/2019
Trên thế giới đã ghi nhận nhiều chủng vi khuẩn vùng rễ thuộc chi Bacillus và Pseudomonas có
khả năng kích thích sinh trưởng, kiểm soát bệnh do tuyến trùng gây ra như Pseudomonas putida
và Pseudomonas alcaligenes tác động lên tuyến trùng Meloidogyne javanica và kích thích sinh
trưởng trên cây đậu (Siddiqui và cộng sự, 2009), Bacillus cereus và Bacillus pumilus tác động lên
tuyến trùng Meloidogyne incognita (Gao và cộng sự, 2016; Cetintas và cộng sự, 2018) và kích
thích sinh trưởng trên cây cà chua, các chủng Bacillus amyloliquefaciens, B. mojavensis, B.
safensis và B. subtilis tác động lên tuyến trùng Meloidogyne incognita gây hại trên cây bông
(Xiang và cộng sự, 2014).
Mục tiêu nghiên cứu này nhằm tuyển chọn, định danh và đánh giá hoạt tính kháng tuyến
trùng của chủng vi khuẩn vùng rễ ứng dụng trong phòng trừ tuyến trùng gây bệnh trên cây hồ
tiêu trên địa bàn tỉnh Đắk Lắk.
2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng tuyến trùng Meloidogyne spp.
trong điều kiện in vitro.
2. Định danh các chủng vi khuẩn vùng rễ có hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne
spp. cao trong điều kiện in vitro bằng phương pháp sinh học phân tử.
3. Ảnh hưởng của enzyme protease và chintinase đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng và tỷ
lệ nở của trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. theo thời gian.
2.2. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu được phân lập tại tỉnh Đắk Lắk lưu trữ tại Phòng
Thí nghiệm Vi sinh, Bộ môn Sinh học, Trường Đại học Tây Nguyên. Tuyến trùng và trứng
Meloidogyne spp. gây u sung rễ cây Hồ tiêu.
Hóa chất sử dụng bao gồm: Thuốc thử DNS, dung dịch huyền phù chitin 1%, dung dịch
N-acetylglucosamin, đệm tris HCl 0.05M pH 8, dung dịch casein 1%, dung dịch TCA 5%, dung
dịch NaOH 0,5N; HCl 0,2N, thuốc thử Folin, dung dịch Tyrosin.
Một số môi trường dinh dưỡng sử dụng trong nghiên cứu: LB, LB-chitin 1%, LB-casein 1%
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng tuyến trùng
Meloidogyne spp. trong điều kiện in vitro
Thu nhận tuyến trùng từ trứng: Thu nhận rễ tiêu bị u sưng (khi thu nhận sử dụng kéo sạch
và cắt sát, không để vết thương hở tiếp xúc với đất), đựng trong túi nilon sạch. Rửa sạch rễ đã
thu nhận, dùng dao lam hoặc dao rọc giấy, cắt phần vỏ, lấy các bọc trứng chuyển vào đĩa petri,
bổ sung nước cất vô trùng, đậy nắp đĩa petri, để tối, ủ ở nhiệt độ phòng từ 24 - 48h. Đếm xác
định mật độ tuyến trùng.
Xác định hoạt tính kháng tuyến trùng của vi khuẩn vùng rễ trong điều kiện in vitro được
thực hiện theo hai bước:
Bước 1: Sàng lọc sơ bộ hoạt tính kháng tuyến trùng của các chủng vi sinh vật vùng rễ cây
hồ tiêu nhằm thu hẹp tổng số chủng vi khuẩn phải tập trung nghiên cứu, chúng tôi sử dụng
phương pháp của Aravind cải tiến. Cách tiến hành: nhân nuôi vi khuẩn vùng rễ trong môi trường
LB lỏng, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ thường trong 12 giờ. Hút 0,4ml huyền phù vi khuẩn pha
loãng đạt OD 610nm khoảng 0,2 -0,3, ly tâm lạnh ở 8.000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn. Bổ
369
- TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HTKH 2019
sung vào mỗi giếng chứa 0,1ml nước cất vô trùng chứa khoảng 30 tuyến trùng. Giếng được ủ
ở nhiệt độ thường trong 24 giờ. Đối chứng là nước cất. Đếm số tuyến trùng chết trong mỗi giếng
bằng kính hiển vi soi nổi. Tuyến trùng được cho là đã chết khi kiểm tra thấy cơ thể chúng nằm
bất động, duỗi thẳng, nội tạng bị phá hủy.
Bước 2: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có hoạt tính kháng tuyến
trùng được thực hiện theo phương pháp của Aravind (2010) và Chen (2000). Các bước tiến
hành: Xây dựng đường chuẩn vi khuẩn vùng rễ đã thể hiện hoạt tính kháng tuyến trùng ở
bước 1. Sau đó, nhân nuôi vi khuẩn trong môi trường LB lỏng, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ
thường trong 24 giờ. Hút 0,4 ml huyền phù vi khuẩn vùng rễ, mật độ 107 CFU/ml cho vào
mỗi giếng, ly tâm lạnh ở 8.000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ dịch, thu cặn. Bổ sung 0,1ml nước
cất vô trùng chứa khoảng 30 tuyến trùng. Giếng được ủ ở nhiệt độ phòng trong 24h. Đếm số
tuyến trùng chết trong mỗi giếng.
Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng tuyến trùng chết lô thí nghiệm so với lô đối chứng.
Tỷ lệ tuyến trùng chết được tính theo công thức:
Số tuyến trùng chết
Tỷ lệ tử vong % = × 100%
Tổng số tuyến trùng
Đánh giá hoạt tính kháng tuyến trùng của vi khuẩn như sau:
- Hoạt tính cao (+++): Tỷ lệ tuyến trùng bị chết trên 80%.
- Hoạt trung bình (++): Tỷ lệ tuyến trùng bị chết từ 60 – 80%.
- Hoạt tính yếu (+): Tỷ lệ tuyến trùng bị chết dưới 60%.
- Không có hoạt tính (-): Tỷ lệ tuyến trùng chết 0%
2.3.2. Định danh sinh học phân tử các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có hoạt tính
kháng tuyến trùng cao
Chủng vi khuẩn có hoạt tính cao được gửi định danh tại Công ty Cổ phần Công nghệ TBR
(553 Hương Lộ 2, phường Bình Trị Đông, quận Bình Tân, TP. Hồ Chí Minh) thông qua giải
trình tự gen 16S rRNA với cặp mồi 27F và 1492R.
Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phần mềm MEGA version 6.0.
2.3.3. Phương pháp xác định ảnh hưởng của enzyme protease và chitinase đến tỷ lệ tử vong
của tuyến trùng theo thời gian
Thu nhận enzyme chitinase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn bổ sung chitin 1%: Nuôi cấy vi
khuẩn trong môi trường thích hợp có bổ sung chitin 1% không có agar ở 300C, tốc độ lắc 150
vòng/phút, nuôi cấy trong 5 ngày, sau đó ly tâm dịch nuôi cấy (8.000 vòng/10 phút) ở 4oC để
loại bỏ vi khuẩn, thu dịch trong. Một phần dịch được sử dụng để xác định hoạt tính enzyme
chitinase bằng phương pháp định lượng đường khử dựa trên sản phẩm thủy phân chitin bởi
chitinase là N - acetyl - glucosamine.
Thu enzyme protase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn bổ sung casein 1%: Nuôi cấy vi khuẩn
trong môi trường thích hợp có bổ sung casein 1% không có agar ở 300C, tốc độ lắc 150
vòng/phút, nuôi cấy trong 5 ngày, sau đó ly tâm dịch nuôi cấy (8.000 vòng/10 phút) ở 4oC để
loại bỏ vi khuẩn, thu dịch trong. Xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Anson
cải biên dựa trên sản phẩm thủy phân casein bởi protease là tyrosin.
370
- HỘI THẢO KHOA HỌC QUỐC GIA CÁC NHÀ NGHIÊN CỨU TRẺ | 11/2019
Thu dịch vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng: Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB lỏng,
chuyển 1ml dịch vi khuẩn với nồng độ đạt 108cfu/ml vào môi trường LB bổ sung tuyến trùng
làm cơ chất, lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau 5 ngày ly tâm 8.000 vòng/10 phút ở 4oC,
thu dịch. Một phần dịch được sử dụng để xác định hoạt tính enzyme chitinase và protease.
Xác định ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, enzyme protease
và chintinase đến tỷ lệ chết của tuyến trùng theo thời gian được tiến hành theo phương pháp
của Gao (2016) cải tiến: Hút 200μl dịch vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, chitin, casein sau khi thu
nhận vào ống eppendorf 1,5ml chứa 100μl nước cất vô trùng có khoảng 30 tuyến trùng, bổ sung
100 μg/ml steptomycine, 100 μg/ml chloramphenicol, lắc đều. Ủ 20oC, theo dõi số tuyến trùng
chết trong các ống eppendorf ở các thời điểm 12h , 24h, 48h. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Thí
nghiệm được tiến hành tương tự với dịch vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, chitin, casein đã bất
hoạt bằng nhiệt độ. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đối chứng môi trường: 200μl môi trường nuôi
vi khuẩn+0,1ml nước cất vô trùng chứa khoảng 30 tuyến trùng + 100 μg/ml steptomycine+
100 μg/ml chloramphenicol, lặp lại 3 lần. Đối chứng nước: 0,1ml nước cất vô trùng chứa 30
tuyến trùng + 200μl nước cất vô trùng, lặp lại 3 lần.
2.3.4. Phương pháp xác định ảnh hưởng của enzyme protease và chitinase đến tỷ lệ nở của
trứng tuyến trùng theo thời gian
Hút 200 μl dịch vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, chitin, casein sau khi thu nhận vào ống
eppendorf 1.5ml chứa 100μl nước cất vô trùng có khoảng 30 trứng tuyến trùng (trứng được thu
nhận bằng cách bóc trực tiếp từ rễ tiêu bị u sưng), bổ sung 100μg/ml steptomycine, 100μg/ml
chloramphenicol, lắc đều. Ủ 20oC, theo dõi số tuyến trùng chết trong các ống eppendorf ở các
thời điểm 12h, 24h, 48h và 72h. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được tiến hành tương
tự với dịch vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, chitin, casein đã bất hoạt bằng nhiệt độ.
Đối chứng môi trường: 200𝜇l môi trường nuôi vi khuẩn+0,1ml nước cất vô trùng chứa
khoảng 30 trứng tuyến trùng + 100𝜇g/ml steptomycine+ 100𝜇g/ml chloramphenicol, lặp lại 3
lần. Đối chứng nước: 0,1ml nước cất vô trùng chứa 30 tuyến trùng + 200𝜇l nước cất vô trùng,
lặp lại 3 lần.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình SAS (Statistical Analysis Systems)
phiên bản 9.1 dùng cho Windows. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,01 của giá trị được biểu
hiện bằng các mẫu tự khác nhau.
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng tuyến trùng Meloidogyne spp.
trong điều kiện in vitro
Từ 44 chủng vi khuẩn vùng rễ phân lập tại tỉnh Đắk Lắk, sau khi sàng lọc sơ bộ các chủng
vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng tuyến trùng tại bước 1 mục 2.3.1 thu nhận được 21 chủng.
Các chủng này tiếp tục được tuyển chọn tại bước 2 mục 2.3.1 kết quả ghi nhận ở bảng 1. Khả
năng đối kháng tuyến trùng của các chủng với tỷ lệ tử vong cao hơn so với đối chứng, 6 chủng vi
khuẩn vùng rễ có hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne spp với tỷ lệ tuyến trùng chết >95%
bao gồm EK2, EK7, BH3, BH11, KN3. Trong đó, chủng EK7 có tỷ lệ tử vong tuyến trùng cao
nhất 99% được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Mekete và cs (2009) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của dịch lọc từ vi khuẩn vùng rễ cây cà
phê kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita. Kết quả nghi nhận trong 43 chủng vi khuẩn được thử
nghiệm có 14 chủng có khả năng ức chế tuyến trùng M. incognita J2 từ 38-98% sau 3 ngày. Khả năng
371
- TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HTKH 2019
ức chế tuyến trùng M. incognita J2 cao nhất đối với B. megaterium, A. radiobacter và C. davisae đạt
98,3%, 97,3% và 94,6%.
Như vậy, chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu tuyển chọn EK7 có hoạt tính kháng tuyến trùng
trong nghiên cứu này tương đương với kết quả của nhóm tác giả trên.
Bảng 1. Khả năng kháng tuyến trùng của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu phân lập tại Đắk Lắk
STT Chủng Tỷ lệ tử vong (%)* Hoạt tính kháng **
1 EK1 73,0gh ++
2 EK2 98,0ab +++
3 EK4 90,7abcde +++
4 EK7 99,0a +++
5 EK10 88,3abcde +++
6 EK12 78,7defgh ++
7 KN3 96,0abc +++
8 KN5 74,7fgh ++
9 KN6 87,0abcdef +++
10 KN7 77,3abcdefg ++
11 KN8 83,7cdefg +++
12 KN10 78,7defgh ++
13 KN11 85,0bcdefg +++
14 KN12 68,3h ++
15 BH3 96,7abc +++
16 BH6 91,3abcd +++
17 BH7 86,0abcdef +++
18 BH8 78,3defgh ++
19 BH11 95,7abc +++
20 BH13 79,0defgh ++
21 BH14 80,3defgh +++
22 ĐC 13,3i -
LSD0,01 15,38 -
CV% 8,37 -
Ghi chú:
* Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g, h trong cùng một cột là khác biệt có ý nghĩa thống kê với trắc nghiệm
Duncan với P
- HỘI THẢO KHOA HỌC QUỐC GIA CÁC NHÀ NGHIÊN CỨU TRẺ | 11/2019
Bacillus velezensis MG5213 (MN368201), B. velezensis TPS3N (MK130897) và B. velezensis
TPSA (MK130896). Kết quả phân tích phát sinh loài bằng phần mềm MEGA 6.0 (Hình 1) cho
thấy chủng EK7 có quan hệ di truyền gần gũi nhất với B. velezensis.
Hình 1. Cây phân loại thể hện mối liên quan giữa chủng EK7
với các loài gần gũi dựa trên trình tự 16S rRNA
3.3. Ảnh hưởng của enzyme protease và chitinase thu nhận từ chủng EK7 đến tỷ lệ tử
vong của tuyến trùng và tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng theo thời gian
Protease là một enzyme có khả năng phá vỡ các liên kết peptide trong protein và được
chia thành hai loại dựa trên vị trí của các liên kết peptide: endopeptidase và exopeptidase.
Endopeptidase xúc tác sự phân hủy các liên kết peptide trong chuỗi polypeptide, trong khi
exopeptidase là nguyên nhân phá vỡ liên kết peptide ở cuối chuỗi polypeptide. Enzyme protease
ngoại bào được sản xuất bởi vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát một số loại
mầm bệnh thực vật, trong đó có tuyến trùng (Kerry 2000; Compant và cộng sự, 2005;
Khatamidoost và cộng sự, 2015). Bên cạnh protease, vi khuẩn vùng rễ còn có khả năng sản sinh
chitinase để kháng lại mầm bệnh. Enzyme thủy phân liên kết β-1,4 giữa N-acetyl glucosamine
(NacGlc) trên chitin là một polysacharide của thành tế bào của nấm và tuyến trùng (Quecine và
cộng sự, 2008). Mặt khác, chitinase có thể ức chế tỷ lệ trứng nở của tuyến trùng Globodera
rostochiensis lên đến 70% (Cronin và cộng sự, 1997).
Kết quả bảng 2 cho thấy, dịch nuôi cấy chủng EK7 có bổ sung tuyến trùng có hoạt tính
enzyme tương đối thấp (hoạt tính chitinase và protease đạt lần lượt 1,79UI/ml, 0,089UI/ml) so
với dịch nuôi cấy có bổ sung cơ chất casein (hoạt tính protease 0,2UI/ml) và chitin (hoạt tính
protease đạt 4,5UI/ml). Tại thời điểm 12h, môi trường bổ sung tuyến trùng và môi trường bổ
sung chitin, tỷ lệ tử vong của tuyến trùng đều giảm khi bất hoạt dịch nuôi cấy. Tuy nhiên, tại
thời điểm 24h, chỉ có môi trường bổ sung chitin tỷ lệ tử vong của tuyến trùng giảm 1,12 lần
(dịch chứa enzyme chitinase đạt 81%, dịch bất hoạt đạt 78%). Như vậy, enzyme chitinase có
thể tác động đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng tại thời điểm này. Tại thời điểm 48h, không có
sự tác động của enzyme đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng.
373
- TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HTKH 2019
Bảng 2. Ảnh hưởng của chủng EK7 đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng trong in vitro
Hoạt tính enzyme (UI/ml) 12h 24h 48h
Thời gian
Chitinase Protease KBH BH KBH BH KBH BH
a a a a a
Môi trường 1,79 0,089 83,67 78,33 88,33 93,67 95,67 100,00a
bổ sung TT
Môi trường - 0,2 71,00a 82,67a 82,00a 92,00a 100,00a 97,67a
bổ sung casein
Môi trường 4,5 - 79,333a 68,33a 81,00a 78,00b 93,67a 96,67a
bổ sung chitin
ĐC nước - - 4,33b 6,33b 7,67c 7,33d 8,00c 8,00c
ĐC môi trường - - 12,00ab 23,00b 29,67b 22,67c 23,67b 29,33b
LSD0,01 - - 21,00 21,72 11,31 8,34 7,82 13,56
CV % - - 16,90 14,70 7,20 5,19 4,45 5,55
Ghi chú: Các chữ a, b, c trong cùng một cột là khác biệt có ý nghĩa thống kê theo trắc nghiệm Duncan
với P
- HỘI THẢO KHOA HỌC QUỐC GIA CÁC NHÀ NGHIÊN CỨU TRẺ | 11/2019
Hình 2. Tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn EK7 đến quá trình nở của trứng tuyến trùng và gây chết
tuyến trùng trưởng thành (A): Trứng tuyến trùng bình thường; (B, C): Trứng tuyến trùng bị phá hủy
nguyên sinh chất và nhân; (D): Trứng tuyến trùng đang nở; (E): Tuyến trùng trưởng thành;
(F): Tuyến trùng chết
4. KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu đã tuyển chọn được chủng vi khuẩn EK7 ở vùng rễ cây hồ tiêu có khả năng
kháng tuyến trùng cao trong điều kiện in vitro với tỷ lệ tử vong 99%. Chủng này được định danh với tên
khoa học Bacillus velezensis EK7 bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA. Enzyme chitinase thu nhận
từ chủng EK7 có thể tác động lên tỷ lệ tử vong của tuyến trùng tại thời điểm 24h và tỷ lệ nở của trứng
tuyến trùng vào các thời điểm khảo sát 24h, 48h, 72h. Enzyme protease chỉ tác động tỷ lệ nở của trứng
tuyến trùng vào thời điểm 72h.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Trần Thị Thu Hà, Nguyễn Tăng Tôn (2011). Nghiên cứu thành phần và mật số tuyến trùng
gây hại trên cây hồ tiêu tại Cam Lộ, Quảng Trị. Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, Số 67(4).
[2] Hoàng Thanh Tiệm, Lê Ngọc Báu, Tôn Nữ Tuấn Nam, Nguyễn Hùng, Nguyễn Thị Thoa
(2007). Kỹ thuật trồng, chăm sóc và chế biến Hồ tiêu. NXB Nông nghiệp Hà Nội.
[3] Aravind, R., Antony, D., Eapen, S. J., Kumar, A., & Ramana, K. V. (2009). Isolation and
evaluation of endophytic bacteria against plant parasitic nematodes infesting black pepper
(Piper nigrum L.). Indian Journal of Nematology, 39(2), 211-217.
[4] Compant S, Duffy B, Nowak J, Clément C, Barka EA (2005). Use of plant growth-promoting
bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future
prospects. Appl Environ Microbiol. 71 (9): 4951-4959.
[5] Cetintas, R., Kusek, M., & Fateh, S. A. (2018). Effect of some plant growth-promoting
rhizobacteria strains on root-knot nematode, Meloidogyne incognita, on tomatoes. Egyptian
Journal of Biological Pest Control, 28(1), 7.
[6] Cronin, D., Moënne-Loccoz, Y., Dunne, C., & O'gara, F. (1997). Inhibition of egg hatch of
the potato cyst nematode Globodera rostochiensis by chitinase-producing bacteria. European
Journal of Plant Pathology, 103(5), 433-440.
375
- TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HTKH 2019
[7] Gao, H., Qi, G., Yin, R., Zhang, H., Li, C., & Zhao, X. (2016). Bacillus cereus strain S2
shows high nematicidal activity against Meloidogyne incognita by producing
sphingosine. Scientific reports, 6, 28756.
[8] Kerry, B. R. (2000). Rhizosphere interactions and the exploitation of microbial agents for the
biological control of plant-parasitic nematodes. Ann Rev Phytopathol. 38 (1): 423-441.
[9] Khatamidoost, Z., Jamali, S., Moradi, M., Saberi Riseh, R. (2015). Effect of Iranian strains
of Pseudomonas spp. on the control of root-knot nematodes on Pistachios. Biocontrol Sci
Technol. 25 (3): 291-301.
[10] Kloepper, J.W., Rodríguez-Kábana, R., McInroy, J. A., Young, R. W. (1992) Rhizosphere
bacteria antagonistic to soybean cyst (Heterodera glycines) and root-knot (Meloidogyne
incognita) nematodes: identification of fatty acid analysis and frequency of biological control
activity. Plant Soil 139(1):75–84.
[11] Oka, Y., Koltai, H., Bar‐Eyal, M, Mor M, Sharon E (2000). New strategies for the control of
plant‐parasitic nematodes. Pest Manag Sci (formerly Pesticide Sci) 56 (11): 983-988.
[12] Quecine, M., Araujo ,W., Marcon, J., Gai, C., Azevedo, J. (2008). Chitinolytic activity of
endophytic Streptomyces and potential for biocontrol. Lett Appl Microbiol. 47 (6): 486-491.
[13] Siddiqui, Z. A., Akhtar, M. S. (2009). Effect of plant growth promoting rhizobacteria,
nematode parasitic fungi and root-nodule bacterium on root-knot nematodes Meloidogyne
javanica and growth of chickpea. Biocont Sci Technol. 19, 511-521.
[14] Mekete, T., Hallmann, J., Kiewnick, S., Sikora, R. (2009). Endophytic bacteria from
Ethiopian coffee plants and their potential to antagonise Meloidogyne incognita. Institute for
Crop Sciences and Resource Conservation, INRES, Department of Plant Pathology, Vol.
11(1), 117-127.
[15] Thongkaewyuan, A., & Chairin, T. (2018). Biocontrol of Meloidogyne incognita by
Metarhizium guizhouense and its protease. Biological control, 126, 142-146.
[16] Xiang, N., Lawrence, K. S., Kloepper, J. W., Mcinroy, J. A. (2014). In vitro screening of
biological control agents on Meloidogyne incognita. In Proceedings of the 2014 Beltwide
Cotton Conference (Vol. 1, pp. 258-260).
Title: THE ANTI-NEMATODE (Meloidogyne spp.) BACTERIA Bacillus velezensis EK7 ACTIVITY
IN BLACK PEPPER RHIZOSPHERE
Abstract: Root-knot nematode Meloidogyne spp. is a group of common pests on black pepper (Piper
nigrum). The aim of the study is to select, identify and assess the nematode resistance activity of the
rhizobacteria strains used in the prevention and control of nematode pathogens in black pepper. This
study result has selected rhizobacteria strain EK7 which is resistance to nematodes under in vitro with
nematode killing values reaching 99%. This strain was identified as Bacillus velezensis EK7 based on
16S rRNA sequencing method. Research on nematode resistance mechanism of strain EK7 was
conducted by assessing the effect of enzyme on nematode mortality. The results showed that chitinase
obtained from the strain EK7may have an effect on nematode mortality at 24 h and hatching nematode
eggs at 24, 48, and 72 h tested time. The protease enzyme only affects the hatching rate of nematode
eggs at 72 h.
Keywords: Nematode, rhizosphere, protease, chitinase, Bacillus velezensis.
376
nguon tai.lieu . vn