- Trang Chủ
- Ngư nghiệp
- Đường truyền lây và mô đích tấn công của vi khuẩn Flavobacterium columnare trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)
Xem mẫu
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
ĐƯỜNG TRUYỀN LÂY VÀ MÔ ĐÍCH TẤN CÔNG CỦA VI KHUẨN
Flavobacterium columnare TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon
hypophthalmus)
Nguyễn Ngọc Du1*, Nguyễn Thị Tuyết Mai2, Mã Tú Lan1,
Lê Thị Bích Thuỷ3, Đoàn Văn Cường1
TÓM TẮT
Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định đường truyền lây của vi khuẩn Flavobacterium columnare
trên cá tra giai đoạn cá hương. Phương pháp ngâm cho tỷ lệ chết cao nhất (86,6 - 100%) ở nồng độ
cảm nhiễm từ 2,5 x 103 - 104 CFU/mL. Phương pháp tiêm cho tỷ lệ chết từ 56,6 - 100% ở nồng độ
cảm nhiễm 2,5 x 105 - 106 CFU/cá. Ở phương pháp cho tiếp xúc cá bệnh - cá khỏe với tỷ lệ 10%,
20%, 30% tổng số nhóm cá thí nghiệm, tỷ lệ cá chết từ 11 - 45%. Không ghi nhận cá chết khi cảm
nhiễm bằng phương pháp cho ăn.
Phân tích mô bệnh học thể hiện vi khuẩn bám nhiều trên lớp nhớt tiết bên ngoài da vùng đuôi và
phần cơ bị hoại tử. Phân tích các mẫu mô thu từ cá bệnh bằng kỹ thuật PCR cũng cho thấy mô đích
tác động của vi khuẩn F. columnare trên cá tra được xác định là cơ đuôi và mang. Ngoài ra vẫn có sự
hiện diện của vi khuẩn này trên mô thận với tỷ lệ và cường độ nhiễm thấp hơn, tuy nhiên không phát
hiện vi khuẩn ở mô gan. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn gây bệnh ở các mô có sự tương đồng giữa phương
pháp ngâm với cá bệnh tự nhiên nhưng có sự khác biệt giữa phương pháp tiêm và cá bệnh tự nhiên
(p < 0,05). Kết quả trên cho thấy cơ chế tấn công của vi khuẩn là từ bên ngoài vào, gây tổn thương
các cơ quan bên ngoài (đuôi và mang), trong đó phần cơ đuôi dễ bị tổn thương nhất, sau đó mới xâm
nhiễm vào các cơ quan nội quan.
Từ khóa: Flavobacterium columnare, cá tra, đường truyền lây, mô đích.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ columnare cũng gây bệnh ở nhiều loài cá cảnh
Trong nghề nuôi cá da trơn ở Mỹ, nhiệt đới như cá molly (Poecilia sphenops), cá
Flavobacterium columnare là vi khuẩn phổ platie (Xiphophorus maculatus) (Decostere và
biến thứ hai, sau Edwardsiella ictaluri (Hawke ctv., 1998), cá da trơn Brazil và cá rô phi sông
& Thune, 1992), gây tổn thất hàng năm lên đến Nile (Barony và ctv., 2015). Bệnh columnaris
30 triệu USD (Shoemaker và ctv., 2011). Trong được cho là nguyên nhân gây tổn thất nhiều
suốt hai thập kỷ gần đây, bệnh columnaris cũng nhất ở các trang trại nuôi cá da trơn ở bang
là mối đe dọa lớn nhất cho nghề nuôi cá hồi Đại Mississippi, Mỹ vào năm 2000. Khoảng thời
Tây Dương (Salmo salar), cá hồi nâu (Salmo gian từ năm 2004 - 2007, tỷ lệ thiệt hại do bệnh
trutta), cá hồi Thái Bình Dương (Oncorhynchus columnaris chiếm 18,33% (Cunningham và ctv.,
mykiss) ở vùng Fennoscandia, Phần Lan. Vi 2012).
khuẩn này cũng được coi là tác nhân gây bệnh Bệnh do Flexibacterium columnaris lần
quan trọng trong nghề nuôi cá rô phi ở Brazil. F. đầu được công bố vào năm 1922 và được xem
1
Viện Nghiện cứu Nuôi trồng Thủy sản II
2
Trường Đại học Quốc tế Tp. Hồ Chí Minh
3
Trường Trung cấp Kỹ thuật Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh
* Email: ngocduaqua@yahoo.com
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 61
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
là mối đe dọa nghiêm trọng đối với cá tự nhiên và ctv., 2008). Ở Canada, bệnh do F. columnare
và cá nuôi. Năm 1944, Ordal và Rucker lần cũng được ghi nhận ở cá hồi trắng (Coregonus
đầu tiên phân lập được vi khuẩn này từ ổ dịch clupeaformis) với những biểu hiện bệnh tích
trên cá hồi đỏ (Onchorhynchus nerka) ngoài tự như: các vùng nhạt màu trên cơ thể từ từ bị
nhiên. Đến năm 1996, vi khuẩn này được đổi tróc da và lở loét, các sợi mang bị hoại tử. Mẫu
tên thành Flavobacterium columnare và được soi tươi vùng hoại tử của da và mang có nhiều
sử dụng cho đến nay. Vi khuẩn F. columnare vi khuẩn hình sợi chuyển động trượt (Scott &
được tìm thấy chủ yếu trên các loại cá nước Bollinger, 2014). F. columnare hiện diện nhiều
ngọt. Đối với những trường hợp cấp tính, bệnh ở da và vây của cá koi bệnh do cảm nhiễm thực
do Flavobacterium có khả năng gây chết lên nghiệm, không thường xuyên thấy ở mang, và ít
đến 70%, hoặc có thể đến 100% (Suomalainen khi phân lập được ở các cơ quan khác như gan,
và ctv., 2005). Những cá sống sót tăng trưởng thận, lách (Tripathi và ctv., 2005). Tuy nhiên,
rất kém, cơ và vây bị ăn mòn và hoại tử, khung trong tự nhiên, biểu hiện hoại tử mang là dấu
xương bị biến dạng sau một thời gian dài nhiễm hiệu thường thấy nhất khi dịch bệnh columnaris
bệnh (Austin & Austin, 1999). Các chủng vi xảy ra, làm cho cá chết trước khi xuất hiện
khuẩn có độc lực khác nhau có sự liên quan những dấu hiệu lở loét trên da (Decostere và
với khả năng bám dính vào mang cá và những ctv., 2002). Vi khuẩn F. columnare chủ yếu được
yếu tố môi trường cũng có ảnh hưởng đến khả quan sát ở lớp biểu bì, vùng bong tróc hoặc lở
năng bám dính này (Decostere, 2002). Đây là loét ở cá nheo (Ictalurus punctatus) và cá ngựa
bước quan trọng trong quá trình phát sinh bệnh vằn (Danio rerio) (Bullard và ctv., 2011). Ngoài
(Decostere và ctv., 1999). Cá nheo Mỹ 4 tháng ra, vi khuẩn còn được thấy nhiều ở mang và phần
tuổi gây nhiễm thực nghiệm với các chủng F. gốc đuôi trên các loài cá nước ngọt như cá chép
columnare 94-081 và Matt gây chết từ 87% đến (Cyprinus carpio), cá hồi vân (Oncorhynchus
100%, ở cá 6 tháng tuổi tỷ lệ chết lên đến 60% mykiss) (Declercq và ctv., 2015), cá mang xanh
trong vòng 8 ngày. Đối với những chủng 143- (Lepomis macrochirus) (Bullard và ctv., 2013).
94 và C56-1 mang độc lực thấp, có khả năng Phân tích sự hiện diện của F. columnare bằng
gây chết cá với tỷ lệ thấp hơn (dưới 40%). Cá kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
bị tuột nhớt, có dấu hiệu lở tróc trên da hoặc trên các mô cá có biểu hiện mang nhợt nhạt,
không. Dấu hiệu tuột nhớt càng cao, tỷ lệ cá đuôi mòn, da mất màu, tuột nhớt, cá mất thăng
chết càng tăng (Soto và ctv., 2008). Ở cá tra bằng… ở một số loài cá nước ngọt nuôi ở vùng
(Pangasianodon hypophthalmus), liều gây chết Mymensingh (Bangladesh), West Bengal (Ấn
50% (LD50) trên cá giống từ khoảng 4 x 105 - 1,6 Độ), Lembuchera, Tripura (Ấn Độ) cho thấy F.
x 106 CFU/mL (Tien và ctv., 2012) bằng phương columnare chủ yếu tìm được ở mang và cơ, một
pháp ngâm. Thí nghiệm cũng gây chết 100% ở số trường hợp có ở thận và lách (Patra và ctv.,
nồng độ 2 x 105 - 2 x 107 CFU/mL ở cá rô phi 2016).
(Dong và ctv., 2016). F. columnare có thể lây truyền thông qua
Trên cá nhiệt đới nuôi ở Brazil, F. columnare môi trường nước và bùn đất trong ao nuôi. Bệnh
cũng được phân lập ở những cá có vùng da bị columnaris xảy ra khắp mọi nơi và vi khuẩn
mất màu, tạo đốm màu trắng xám ở một số xâm nhiễm vào tất cả các loài cá nước ngọt và
phần trên cơ thể như đầu, miệng, mang, vây và một số loài lưỡng cư. Cá hồi giống, cá da trơn
thân, được bao quanh bởi vùng đỏ nhẹ do da giống nuôi ở các trại sản xuất thường rất dễ bị
bị tróc, đuôi bị ăn mòn, da bị lở loét (Pilarski bệnh columnaris do được nuôi với mật độ cao,
62 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
trong đó yếu tố môi trường là điều kiện quan ngoài khỏe mạnh, được nuôi thuần ít nhất 1
trọng gây phát sinh dịch bệnh. Khi kết hợp với tuần trước khi thí nghiệm trong bể composite.
các yếu tố gây sốc như nhiệt độ tăng, mật độ Cá được kiểm tra không nhiễm mầm bệnh F.
tăng, xây xát do vận chuyển…, F. columnare có columnare bằng cách phết lam từ nhớt da bên
thể tấn công và gây bệnh cho cá. Các nghiên ngoài để kiểm tra vi khuẩn và cấy nhớt cá trên
cứu cho thấy F. columnare có thể lây truyền trực môi trường TYES (Trypton Yeast Extract Salts).
tiếp từ cá sang cá thông qua môi trường nước Đồng thời, các mầm bệnh quan trọng khác
nhưng quá trình phát bệnh có liên quan đến các (Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri)
điều kiện gây sốc như chất lượng nước kém, là những tác nhân gây bệnh phổ biến trên cá tra
di chuyển cá trong quá trình thả giống hay thu cũng được kiểm tra bằng cách cấy mẫu thận trên
hoạch. F. columnare có thể tạo thành dạng kén môi trường thạch máu.
(microcyst) tồn tại nhiều năm và đây có thể là 2.1.2. Chuẩn bị vi khuẩn cảm nhiễm
nguồn lây nhiễm tự nhiên. Vi khuẩn có khả năng Chủng vi khuẩn F. columnare AG.07.19_8
sống sót hàng tháng trong nước hồ đã được vô được phân lập từ mẫu cá bệnh trắng đuôi, thối
trùng và có thể sống trên những mô cá chết. đuôi thu ở An Giang và lưu giữ chủng ở nhiệt
Hơn nữa, F. columnare có thể di chuyển rất hiệu độ -80ºC. Vi khuẩn được cấy trên đĩa môi trường
quả từ cá chết sang cá sống, thậm chí còn nhanh TYES ủ ở 30ºC trong 48 giờ. Khuẩn lạc đơn được
hơn từ cá sống sang cá sống. Khả năng này làm cấy chuyển sang nuôi trong môi trường TYES
gia tăng sự phát sinh bệnh tiềm ẩn khi thay đổi lỏng ở 30ºC trong vòng 24 giờ để huyền dịch vi
môi trường sống của cá. Thời gian ủ bệnh của F. khuẩn gốc đạt khoảng 108CFU/mL. Vi khuẩn
columnare có thể thay đổi tùy theo độc lực của được pha loãng thành các nồng độ 2,5 x 106, 5
chủng và điều kiện của môi trường. Chủng có x 106, 107 CFU/mL và sẵn sàng cho cảm nhiễm.
độc lực cao có thể gây dịch bệnh cấp tính trong 2.2. Cảm nhiễm xác định đường truyền lây
vòng 24 giờ, trong khi chủng có độc lực thấp có Thực hiện thăm dò các đường truyền lây:
thể cần nhiều thời gian hơn, từ 48 giờ cho đến ngâm trong nước, tiêm, cho ăn, tiếp xúc cá
vài tuần (Warren, 1981). bệnh- khỏe.
Nghiên cứu này được thực hiện trên cá tra Mỗi đường truyền lây được thực hiện ở 3
dưới 2 tháng tuổi vì đây là giai đoạn mẫn cảm nồng độ và lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố
của cá tra đối với tác nhân gây bệnh trắng đuôi, trí trong các bể nhựa, mỗi bể chứa 20 con. Ở
thối đuôi. Việc xác định được đường truyền lây nghiệm thức ngâm, cá được ngâm trong bể 1
của vi khuẩn vào cơ thể vật chủ nhằm hạn chế lít nước có chứa vi khuẩn nồng độ 2,5 x 103,
khả năng lây truyền mầm bệnh, đồng thời dữ 5 x 103, 104 CFU/mL trong vòng 1 giờ (1 mL
liệu phân tích mô đích bị xâm nhiễm bởi tác của vi khuẩn ở mỗi nồng độ 2,5 x 106, 5 x 106,
nhân gây bệnh giúp tăng cường khả năng chẩn 107 CFU/mL pha loãng trong 1 lít nước), sau đó
đoán phát hiện mầm bệnh ở vật chủ. nâng mức nước lên 5 lít cho mỗi bể. Ở nghiệm
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP thức tiêm, mỗi cá được tiêm vào nồng độ 2,5 x
NGHIÊN CỨU 105, 5 x 105, 106 CFU/cá. Vi khuẩn cũng được sử
2.1. Vật liệu nghiên cứu dụng trộn vào thức ăn trong nghiệm thức cho ăn,
2.1.1. Cá thí nghiệm trong đó 3 mL dung dịch vi khuẩn 2,5 x 106, 5 x
Cá tra khoảng 40 ngày tuổi, trọng lượng 106, 107 CFU/mL được trộn với thức ăn và chia
trung bình 0,8 - 1g, được sử dụng cho thí đều thành 3 phần tương đương nhau cho 3 bể
nghiệm cảm nhiễm. Sử dụng cá biểu hiện bên của mỗi nghiệm thức (mục đích để cá của mỗi
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 63
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
bể được cho ăn với 1 mL vi khuẩn trộn trong cho tiếp xúc và tiếp tục theo dõi.
thức ăn, tương đương với lượng vi khuẩn đưa Trong thời gian cảm nhiễm không cho ăn
vào mỗi bể trong nghiệm thức ngâm). Ở nghiệm đối với các lô ngâm và tiêm. Theo dõi và ghi
thức cho cá bệnh tiếp xúc cá khỏe, chọn những nhận cá có biểu hiện của bệnh trắng đuôi, thối
con cá lờ đờ, có biểu hiện bệnh trắng đuôi, thối đuôi, và cá chết trong vòng 1 tuần. Một số cá
đuôi cho vào bể cá khỏe với tỷ lệ 10%, 20%, lờ đờ hoặc vừa mới chết được lấy mẫu để kiểm
30% tổng số cá thí nghiệm trong bể. Những con tra vi khuẩn F. columnare. Nồng độ và tỷ lệ gây
cá bệnh (đã chết) được vớt ra khỏi bể sau 24 giờ nhiễm được thể hiện ở Bảng 1.
Bảng 1: Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm.
Đường truyền Ngâm (CFU/mL) Tiêm (CFU/cá) Tiếp xúc cá Cho ăn (CFU/
lây bệnh: khỏe bể thí nghiệm)
104 106 3:7 (30%) 107
Nồng độ cảm
5 x 103 5 x 105 2:8 (20%) 5 x 106
nhiễm
2,5 x 103 2,5 x 105 1:9 (10%) 2,5 x 106
2.3. Phân tích mô bệnh học của cá bệnh định danh F. columnare. Một hỗn hợp 25 μL
trắng đuôi thối đuôi dung dịch cho phản ứng PCR chứa 1X green
Cá bệnh (tự nhiên và sau cảm nhiễm) có Gotag reaction buffer, bao gồm 1,5 mM MgCl2,
những biểu hiện trắng đuôi hoặc thối đuôi được 10 nmole cho mỗi 200 μM dNTPs, 10 pmole
thu nguyên con và cố định trong dung dịch cho mỗi mồi, Taq DNA polymerase và 100 ng
formol 10%. Mẫu mô (đuôi, mang, thận) được DNA mẫu.
đúc parafin để cắt lát, sau đó xử lý loại parafin Chu trình PCR gồm có giai đoạn khởi đầu:
bằng cồn và tiến hành nhuộm Wright – Giemsa, 94ºC trong 2 phút (1 chu kỳ); nhân bản PCR (30
Hematoxylin và Eosin (H&E) hoặc nhuộm chu kỳ) gồm có bước biến tính: 94ºC trong 30
Gram. giây – bước gắn mồi: 54 ºC trong 1 phút – bước
Quan sát sự hiện diện của vi khuẩn trong kéo dài: 72ºC trong 1 phút; và giai đoạn kết thúc
các mô dưới kính hiển vi quang học. kéo dài 72ºC trong 5 phút (1 chu kỳ). Dung dịch
2.4. Phương pháp kiểm tra mô đích của sau PCR được điện di trên gel agarose 1,5%,
cá bệnh tự nhiên và sau cảm nhiễm cho sản phẩm có kích thước 675 bp (Darwish
Cá bệnh (tự nhiên và sau cảm nhiễm) được và ctv., 2004).
thu nguyên con và cố định bằng cồn 90% để 3. Phân tích thống kê
kiểm tra bằng phương pháp PCR. Mẫu mô Kết quả được phân tích thống kê sử dụng
(đuôi, mang, gan, thận) được tách bằng panh và phần mềm SPSS 13.0 for Windows, phân tích
kéo đốt khử trùng sau mỗi lần tách mô. ANOVA 2 yếu tố sự khác biệt có ý nghĩa với độ
DNA được tinh sạch bằng Wizard genomic tin cậy 95% (giá trị p
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
ngoài, cá có biểu hiện mất thăng bằng (chúi đầu 1). Hơn nữa, ở những nghiệm thức cảm nhiễm
xuống đáy bể). Cảm nhiễm với nồng độ cao, cá nồng độ vi khuẩn cao, mang và da cá tiết nhiều
chết nhanh trong vòng 24 giờ. Ở phương pháp nhớt, cá có biểu hiện suy giảm hô hấp.
tiêm, cá chết chậm hơn bắt đầu từ ngày thứ 2 Đối với lô cá cảm nhiễm bằng phương pháp
sau cảm nhiễm và rải rác cho đến ngày thứ 5. ngâm, cá chết tỷ lệ cao từ 86,6% đến 100%
Phương pháp cho tiếp xúc cá bệnh và cá khỏe, khi cảm nhiễm nồng độ vi khuẩn 2,5 x 103 –
cá chết chậm hơn hai phương pháp ngâm và 104 CFU/mL. Ở phương pháp tiêm, cá chết từ
tiêm. Tuy nhiên ở phương pháp cho ăn, không 56,6% đến 100% với nồng độ tiêm 2,5 x 105
ghi nhận có cá chết. Biểu hiện bên ngoài của cá – 106 CFU/cá. Khi cho tiếp xúc giữa cá bệnh và
bệnh cho thấy một số con bị cụt vây đuôi hoặc cá khỏe, tỷ lệ cá chết từ trung bình từ 11% đến
có lớp nhầy trắng đục bám bên ngoài, tương tự 43%, cao nhất ở tỷ lệ tiếp xúc cá bệnh với 30%
như biểu hiện ở những cá bệnh tự nhiên (Hình (Bảng 2).
Bảng 2: Tỷ lệ cá chết ở các phương pháp gây nhiễm khác nhau.
Phương pháp Nồng độ Tổng số cá chết/ Tỉ lệ cá chết (%)
cá cảm nhiễm
Ngâm (CFU/mL) 104 60/60 100
5 x 103 60/60 100
2,5 x 103 52/60 86,6
Tiêm (CFU/cá) 106 60/60 100
5 x 105 60/60 100
2,5 x 105 34/60 56,6
Tiếp xúc cá bệnh và cá khỏe 30% 18/42 43
(tỷ lệ) 20% 18/48 37,5
10% 6/54 11
Cho ăn (CFU/bể thí nghiệm) 107 0/60 0
5 x 106 0/60 0
2,5 x 106 0/60 0
Hình 1A: Cá bị bệnh trắng đuôi, thối đuôi tự nhiên. Cá bị hoại tử và ăn mòn nửa thân
dưới, gây cụt đuôi (1A, 1B). Lớp da bên ngoài ở vùng đuôi tiết nhiều nhớt, mất màu. Một
số vùng có màu vàng nhạt do vi khuẩn bám vào (Hình 1B, mũi tên).
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 65
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Cá bị bệnh trắng đuôi, thối đuôi sau cảm nhiễm. Đuôi bị ăn mòn, hoại tử, lớp da bên ngoài tiết
nhiều nhớt, da mất màu (Hình 1C). Cơ đuôi bị hoại tử, ăn mòn đến xương (Hình 1D).
Hình 1: Biểu hiện bệnh tích của cá bị bệnh trắng đuôi, thối đuôi.
3.2. Phân tích mô bệnh học của cá bệnh biểu mô, đặc biệt ở phần đuôi bị hoại tử và vùng
trắng đuôi, thối đuôi nhớt trắng đục bên ngoài, một số vùng biểu bì
Phân tích mô bệnh học lát cắt mang và gốc bên ngoài bị bong tróc ra khỏi lớp mô bên trong
đuôi cho thấy có sự hiện diện của vi khuẩn hình (Hình 2). Tuy nhiên, không thấy có sự thay đổi
sợi ở mang, lá mang bị hoại tử, cấu trúc tế bào cấu trúc hoặc tổn thương ở các cơ quan nội quan
mang bị phá vỡ, có chỗ kết dính. Ở lát cắt cơ (thận, gan).
đuôi, nhiều vi khuẩn dạng hình sợi bám ở vùng
Cá bệnh tự nhiên, lát cắt mang (nhuộm H&E, x Cá bệnh tự nhiên, lát cắt đuôi (nhuộm Wright –
1500). Vi khuẩn quan sát thấy rải rác ở lá mang Giemsa, x 1500). Vi khuẩn quan sát thấy nhiều ở
(mũi tên), mang bị hoại tử. lớp da bị tuột nhớt (mũi tên liền), lớp biểu bì bị
long tróc khỏi phần cơ (mũi tên đứt khúc).
Cá cảm nhiễm (nhuộm Wright – Giemsa), x1500. Vi khuẩn quan sát thấy nhiều ở vùng da và
vùng cơ đuôi bị hoại tử (mũi tên 2C, 2D).
66 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Cá cảm nhiễm (nhuộm Gram). Vi khuẩn quan sát thấy nhiều ở vùng da và vùng cơ đuôi bị hoại tử
(mũi tên 2E, x40). Nhiều vi khuẩn mảnh, dài, Gram âm ở vị trí N (Hình 2F, x1500).
Mô thận (2G) và mô gan (2H) từ cá bệnh. Cấu trúc mô bình thường, không quan sát thấy vi
khuẩn có hình dạng dài, mảnh.
Hình 2: Phân tích mô bệnh học cá bệnh trắng đuôi, thối đuôi.
3.3. Sự hiện diện của F. columnare trên đó là gốc đuôi và thận. Ở cá bệnh tự nhiên, tỷ
các mô ở cá bệnh tự nhiên và cá cảm nhiễm lệ nhiễm ở gốc đuôi và mang có tỷ lệ cao (90
Phân tích sự hiện diện của vi khuẩn F. - 100%), ở thận nhiễm thấp hơn (50%). Tuy
columnare trên các mô lấy từ cá bệnh (tự nhiên nhiên, tương tự ở cá cảm nhiễm, vi khuẩn F.
và cảm nhiễm) bằng kỹ thuật PCR cho thấy ở columnare cũng không được tìm thấy ở mô gan
mang có sự hiện diện nhiều vi khuẩn nhất, sau (Bảng 3).
Bảng 3: Tỷ lệ nhiễm của F. columnare trên các mô ở cá bệnh.
Mô (tỷ lệ nhiễm/số mẫu cá; tỷ lệ nhiễm %)
Gốc đuôi Mang Thận Gan
Cá bệnh sau cảm nhiễm 6/10 (60%) 7/10 (70%) 5/10 (50%) 0/10 (0%)
(phương pháp ngâm)
Cá bệnh sau cảm nhiễm 2/10 (20%) 6/10 (60%) 2/10 (20%) 0/10 (0%)
(phương pháp tiêm)
Cá bệnh tự nhiên 10/10 (100%) 9/10 (90%) 5/10 (50%) 0/10 (0%)
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 67
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Hình 3: Hiện diện của F. columnare trên các mô ở cá bệnh.
Mức độ nhiễm trên các mô cho thấy cơ nhân gây bệnh, còn cơ quan nội quan (thận) bị
đuôi và mang là những mô đích quan trọng xâm nhiễm sau.
(Hình 3, Hình 4) bị tác động đầu tiên bởi tác
Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu mô cá bệnh tự nhiên.
1: Cơ đuôi (cá 1); 2: Mang (cá 1); 3: Gan (cá 1); 4: Thận (cá 1);
5: Cơ đuôi (cá 2); 6: Mang (cá 2); 7: Gan (cá 2); 8: Thận (cá 2);
9: Cơ đuôi (cá 3); 10: Mang (cá 3); 11: Gan (cá 3); 12: Thận (cá 3);
13: Cơ đuôi (cá 4); 14: Mang (cá 4); 15: Gan (cá 4); 16: Thận (cá 4);
17: Cơ đuôi (cá 5); 18: Mang (cá 5); 19: Gan (cá 5); 20: Thận (cá 5);
21: Chứng dương F. columnare CF1-Thai; 22: chứng âm; 23: 100 bp ladder.
Kết quả phân tích ANOVA 2 yếu tố đánh diện của F. columnare lên các mô được khảo sát
giá trên phương pháp gây nhiễm và mô đích tác (p
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
không có sự khác biệt giữa phương pháp ngâm mang cũng không bị nhiều tổn thương như ở
và cá bệnh tự nhiên. gốc đuôi. Ngược lại, theo một số nghiên cứu
So sánh tỷ lệ nhiễm F. columnare ở các về bệnh columnaris ở các loài cá có vảy, F.
mô khảo sát cho thấy giữa cơ đuôi và mang, cơ columnare được quan sát thấy nhiều ở mô mang
đuôi và thận là tương đương nhau. Tuy nhiên, và lớp da bên ngoài, mang thường là cơ quan
có sự khác biệt có ý nghĩa giữa mang và thận, bị tổn thương nhiều nhất. Sự khác biệt này có
giữa gan và các mô khác (cơ đuôi, mang, thận) thể giải thích do lớp da mềm ở cá da trơn làm
(p
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
vào hệ tuần hoàn và từ đó xâm nhiễm vào cơ trung nhiều ở vùng gốc đuôi. Kiểm tra sự hiện
quan sinh sản, trứng phôi, và cá bột (Suebsing diện của vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR trên các
và ctv., 2015). mô cơ (gốc đuôi), mang, gan, thận cho thấy vi
Việc phân tích sự hiện diện của vi khuẩn khuẩn có nhiều ở mô cơ và mang, ở thận ít hơn
trên các mô của cá tra bệnh bằng kỹ thuật PCR và không thấy có sự hiện diện ở gan. Mức độ
cho thấy mang và gốc đuôi có tỷ lệ nhiễm cao. nhiễm trên các mô cho thấy cơ đuôi và mang là
Đối với cơ quan nội tạng, thận có bị nhiễm F. những mô đích quan trọng bị tác động đầu tiên
columnare nhưng tỷ lệ thấp hơn và sản phẩm bởi tác nhân gây bệnh, chứng tỏ cơ chế tác động
khuyếch đại từ PCR cũng ít hơn so với mang của vi khuẩn lên cá là xâm nhiễm và tấn công
và cơ, có khả năng mô thận bị nhiễm sau do từ các cơ quan bên ngoài, còn cơ quan nội quan
cơ chế tác động của vi khuẩn từ bên ngoài (thận) bị xâm nhiễm sau.
vào hoặc lượng mô sử dụng để phân tích mẫu LỜI CÁM ƠN: Nghiên cứu này được thực
không tương đương nhau (do cỡ cá nhỏ). Mô hiện thuộc nội dung đề tài: “Nghiên cứu bệnh
gan không cho thấy có hiện diện của vi khuẩn trắng đuôi, thối đuôi trên cá tra giống và giải
này, chứng tỏ gan không phải là mô đích quan pháp phòng trị” với nguồn kinh phí được cấp từ
trọng của F. columnare. Như vậy vi khuẩn F. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Chúng
columnare tác động mạnh nhất vào các cơ quan tôi cũng chân thành cảm ơn TS. Đồng Thanh
bên ngoài, phân hủy protein gây hoại tử mô (cơ Hà (Centex Shrimp – Trường đại học Mahidol,
và mang). Đối với cá da trơn, vùng gốc đuôi đặc Thái Lan) đã cung cấp chủng đối chứng dương
biệt bị tổn thương, dẫn đến hiện tượng mất màu Flavobacterium columnare.
da ở nửa thân dưới và vùng đuôi (hay còn gọi là TÀI LIỆU THAM KHẢO
trắng đuôi) ở trường hợp chết cấp tính. Trường Austin, B., & Austin, D. A., 1999. Bacterial Fish
Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish
hợp bệnh tiến triển chậm hơn, phần đuôi của cá
(Vol. XXVIII).
bị ăn mòn hoặc gốc đuôi bị đứt gãy, nửa thân
Barony, G. M., Tavares, G. C., Assis, G. B., Luz, R.
dưới bị lở loét. K., Figueiredo, H. C., & Leal, C. A., 2015. New
V. KẾT LUẬN hosts and genetic diversity of Flavobacterium
Phương pháp cảm nhiễm bằng cách ngâm columnare isolated from Brazilian native species
cá trong dịch vi khuẩn cho kết quả cao nhất and Nile tilapia. Dis Aquat Organ, 117(1), 1-11.
(từ 86,6 - 100% ở nồng độ cảm nhiễm từ 2,5 doi: 10.3354/dao02931.
Bullard, S., McElwain, A., & Arias, C., 2011.
x 103 - 104 CFU/mL) so với phương pháp tiêm
Scanning Electron Microscopy of “Saddleback”
và phương pháp cho tiếp xúc cá bệnh - cá khỏe.
Lesions Associated with Experimental Infections
Hơn nữa, cá trong các nghiệm thức ngâm chết of Flavobacterium columnare in Channel Catfish,
nhanh hơn so với các nghiệm thức khác, cho Ictalurus punctatus (Siluriformes: Ictaluridae),
thấy con đường xâm nhập từ bên ngoài vào tác and Zebrafish, Danio rerio (Cypriniformes:
động đến cá nhiều hơn thâm nhập từ bên trong Cyprinidae). Journal of the World
cơ thể. Aquaculture Society, 42. doi: 10.1111/j.1749-
7345.2011.00527.x
Có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm của vi
Bullard, S. A., Mohammed, H., & Arias, C. R., 2013.
khuẩn lên các mô giữa phương pháp tiêm với
First record of the fish pathogen Flavobacterium
cá bệnh tự nhiên, tuy nhiên tỷ lệ này không có columnare genomovar II from bluegill, Lepomis
sự khác biệt giữa phương pháp ngâm và cá bệnh macrochirus (Rafinesque), with observations on
tự nhiên. Phân tích mô bệnh học cho thấy vi associated lesions. J Fish Dis, 36(4), 447-451.
khuẩn chủ yếu bám ở lớp biểu bì ngoài da, tập doi: 10.1111/jfd.12005
70 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Cai, W., De La Fuente, L., & Arias, C. R., 2013. Dong, H., Nguyen, V., Phiwsaiya, K., Gangnonngiw,
Biofilm formation by the fish pathogen W., Withyachumnarnkul, B., Rodkhum, C., &
Flavobacterium columnare: development and Senapin, S., 2015. Concurrent infections of
parameters affecting surface attachment. Applied Flavobacterium columnare and Edwardsiella
and environmental microbiology, 79(18), 5633- ictaluri in striped catfish, Pangasianodon
5642. doi: 10.1128/AEM.01192-13 hypophthalmus in Thailand. Aquaculture, 448.
Cunningham, F. L., Jack, S. W., Hardin, D., & Wills, R. doi: 10.1016/j.aquaculture.2015.05.046
W., 2012. Pond-level risk factors associated with Dong, H., Senapin, S., LaFrentz, B., & Rodkhum, C.,
columnaris disease on Mississippi commercial 2016. Virulence assay of rhizoid and non-rhizoid
catfish farms. J Aquat Anim Health, 24(3), 178- morphotypes of Flavobacterium columnare in
184. doi: 10.1080/08997659.2012.675932 red tilapia, Oreochromis sp., fry (Vol. 39).
Dalsgaard, I., 1993. Virulence mechanisms in Hawke, J. P., & Thune, R. L., 1992. Systemic
Cytophaga psychrophila and other Cytophaga- Isolation and Antimicrobial Susceptibility of
like bacteria pathogenic for fish. Annual Review Cytophaga columnaris from Commercially
of Fish Diseases, 3, 127-144. doi: https://doi. Reared Channel Catfish. Journal of
org/10.1016/0959-8030(93)90032-7 Aquatic Animal Health, 4(2), 109-113. doi:
Darwish, A. M., Ismaiel, A. A., Newton, J. C., & 10.1577/1548-8667(1992)004
Tang, J., 2004. Identification of Flavobacterium 2.3.CO;2
columnare by a species-specific polymerase Morrison, C., Cornick, J., Shum, G., & Zwicker,
chain reaction and renaming of ATCC43622 B., 1981. Microbiology and histopathology of
strain to Flavobacterium johnsoniae. Molecular ‘saddleback’ disease of underyearling Atlantic
and Cellular Probes, 18(6), 421-427. doi: https:// salmon, Salmo salar L (Vol. 4).
doi.org/10.1016/j.mcp.2004.07.002 Patra, A., Sarker, S., Banerjee, S., Adikesavalu,
Declercq, A. M., Chiers, K., Haesebrouck, F., Van H., Debadyuti, & Abraham, T. J., 2016. Rapid
den Broeck, W., Dewulf, J., Cornelissen, M., & Detection of Flavobacterium columnare
Decostere, A., 2015. Gill infection model for Infection in Fish by Species-specific Polymerase
columnaris disease in common carp and rainbow Chain Reaction. Journal of Aquaculture
trout. J Aquat Anim Health, 27(1), 1-11. doi: Research & Development, 7. doi: 10.4172/2155-
10.1080/08997659.2014.953265 9546.1000445.
Decostere, A., 2002. Flavobacterium columnare Pilarski, F., Rossini, A., & Ceccarelli, P., 2008.
infections in fish: the agent and its adhesion to Isolation and characterization of Flavobacterium
the gill tissue. Verh K Acad Geneeskd Belg, columnare (Bernardet et al., 2002) from four
64(6), 421-430. tropical fish species in Brazil. Brazilian Journal
Decostere, A., Ducatelle, R., & Haesebrouck, F., of Biology, 68, 409-414.
2002. Flavobacterium columnare (Flexibacter Scott, S. J., & Bollinger, T. K., 2014. Flavobacterium
columnaris) associated with severe gill necrosis columnare: an important contributing
in koi carp (Cyprinus carpio L). Vet Rec, 150(22), factor to fish die-offs in southern lakes of
694-695. Saskatchewan, Canada. Journal of Veterinary
Decostere, A., Haesebrouck, F., Charlier, G., Diagnostic Investigation, 26(6), 832-836. doi:
& Ducatelle, R., 1999. The association of 10.1177/1040638714553591
Flavobacterium columnare strains of high and low Shoemaker, C. A., Klesius, P. H., Drennan, J. D.,
virulence with gill tissue of black mollies (Poecilia & Evans, J. J., 2011. Efficacy of a modified
sphenops). Vet Microbiol, 67(4), 287-298. live Flavobacterium columnare vaccine in fish.
Decostere, A., Haesebrouck, F., & Devriese, L. A., Fish Shellfish Immunol, 30(1), 304-308. doi:
1998. Characterization of four Flavobacterium 10.1016/j.fsi.2010.11.001
columnare (Flexibacter columnaris) strains Soto, E., Mauel, M., Karsi, A., & Lawrence, M. L.,
isolated from tropical fish. Vet Microbiol, 62(1), 2008. Genetic and virulence characterization of
35-45. Flavobacterium columnare from channel catfish
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 71
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
(Ictalurus punctatus) (Vol. 104). skin and gills. Dis Aquat Organ, 63(1), 61-68.
Suebsing, R., Kampeera, J., Sirithammajak, doi: 10.3354/dao063061
S., Withyachumnarnkul, B., Turner, W., & Tien, N. T., Dung, T. T., Tuan, N. A., & Crumlish,
Kiatpathomchai, W., 2015. Colorimetric M., 2012. First identification of Flavobacterium
Method of Loop-Mediated Isothermal columnare infection in farmed freshwater
Amplification with the Pre-Addition of Calcein striped catfish Pangasianodon hypophthalmus.
for Detecting Flavobacterium columnare and Dis Aquat Organ, 100(1), 83-88. doi: 10.3354/
its Assessment in Tilapia Farms. Journal of dao02478
Aquatic Animal Health, 27(1), 38-44. doi: Tripathi, N. K., Latimer, K. S., Gregory, C. R., Ritchie,
10.1080/08997659.2014.966212 B. W., Wooley, R. E., & Walker, R. L., 2005.
Suomalainen, L. R., Tiirola, M. A., & Valtonen, Development and evaluation of an experimental
E. T., 2005. Effect of Pseudomonas sp. MT5 model of cutaneous columnaris disease in koi
baths on Flavobacterium columnare infection of Cyprinus carpio. J Vet Diagn Invest, 17(1), 45-
rainbow trout and on microbial diversity on fish 54. doi: 10.1177/104063870501700109
72 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
INFECTED TRANSMISSIONS AND TARGET TISSUES ATTACKED
BY Flavobacterium columnare ON TRA CATFISH (Pangasianodon
hypophthalmus)
Nguyen Ngoc Du1*, Nguyen Thi Tuyet Mai2, Ma Tu Lan1,
Le Thi Bich Thuy3, Doan Van Cuong1
ABSTRACT
The study was to determine the infected transmissions of the bacteria Flavobacterium columnare
causing white and tail rot disease in striped catfish fingerling. Bath immersion challenge presented
the highest mortality rate (86,6 – 100%) with 2,5 x 103 to 104 CFU/mL of bacteria. Injected challenge
had 56,6 to 100% of mortality at the bacterial concentration from 2,5 x 105 to 106 CFU/fish. The
diseased – heathy contact challenge at the rate of 10%, 20%, 30% of total experimental fish resulted
mortality from 11 to 45%. However, there was no dead fish in oral challenge experiments.
Histopathological examinations of lethally infected fish revealed that the bacteria were adhered
the most in the mucous of caudal tail and necrosis tissues. The PCR analysis of tissues taken from
diseased fish has detected F. columnare most in tail and gill. The bacteria was also found in kidney
but not as frequency as in the other tissues, yet never been identified in liver. The bacteria infected
tissues were the same in immersed infection group and naturally infected group, but significantly
different beetween injected infection and naturally diseased fish (p
nguon tai.lieu . vn