- Trang Chủ
- Báo cáo khoa học
- Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự thay đổi của gen AhR và AIP ở các nạn nhân nhiễm dioxin
Xem mẫu
- ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LÊ THỊ KIM DUNG
NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI CỦA GEN AHR VÀ AIP
Ở CÁC NẠN NHÂN NHIỄM DIOXIN
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21
DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
HÀ NỘI – 2017
- Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên - ĐHQGHN
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS. TS Nông Văn Hải
2. PGS. TS Nguyễn Huy Hoàng
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Đại học
Quốc gia họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào
hồi…..ngày……tháng…...năm 20
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam;
- Trung tâm Thông tin Thư viện - ĐHQGHN
- MỞ ĐẦU
Aryl hydrocarbon Receptor (AhR) là thụ thể tiếp nhận dioxin
và nhiều chất ô nhiễm môi trường khác. Khi AhR được hoạt hóa bởi
phối tử, dẫn đến điều hòa biểu hiện các gen tham gia nhiều quá trình
sinh lý quan trọng của cơ thể. Các cá thể khác nhau, mặc dù phơi
nhiễm với các chất độc trong môi trường như nhau, nhưng lại chịu
ảnh hưởng cũng như có nguy cơ với ung thư là khác nhau. Điều này
có liên quan đến đa hình gen AhR và AIP (Aryl hydrocarbon receptor
Interacting Protein). Trên thế giới, các nghiên cứu về gen AhR và
AIP chủ yếu trên người không phơi nhiễm dioxin. Ở Việt Nam, đã có
những nghiên cứu về gen trên đối tượng phơi nhiễm dioxin.Tuy
nhiên, chưa có nghiên cứu nào về gen AIP cũng như đa hình/đột biến
trên toàn bộ exon gen AhR ở người phơi nhiễm có nồng độ dioxin
trong máu cao. Ảnh hưởng tác động của dioxin cũng như các chất ô
nhiễm môi trường qua con đường tín hiệu AhR vẫn được coi là phức
tạp, chưa được biết đầy đủ, có nhiều kết quả trái chiều nhau. Hiện
nay cũng chưa có dữ liệu đầy đủ về các gen chịu ảnh hưởng của tác
động dioxin. Xuất phát từ thực tễ trên, chúng tôi thực hiện đề tài
“Nghiên cứu sự thay đổi của gen AhR và AIP ở các nạn nhân
nhiễm dioxin”nhằm mục tiêu sau: (1) Xác định đa hình/đột biến các
gen AhR và AIP ở người sống trong vùng phơi nhiễm dioxin và
người có nồng độ dioxin trong máu cao; (2) Tìm hiểu mối liên hệ
giữa những đa hình/đột biến các gen AhR và AIP với dioxin, trong đó
có các bệnh liên quan đến dioxin; (3) Bước đầu giải trình tự toàn bộ
hệ gen biểu hiện (whole exome sequencing, WES) ở người có nồng
độ dioxin trong máu cao, để phân tích các biến đổi gen có thể liên
quan đến chuyển hóa dioxin.
- Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ DIOXIN
1.1.1. Khái niệm dioxin và các hợp chất tƣơng tự dioxin
Thuật ngữ “Dioxin” thường được sử dụng để nói đến 2 nhóm
chất là policlodibenzo-p-dioxin (PCDD) và policlodibenzofuran
(PCDF). Trong các chất dioxin có 2,3,7, 8-tetrachlorodibenzo-p-
dioxin (TCDD) là chất độc nhất.
1.1.2. Đặc tính của dioxin
Dioxin có độ bền vững cao. Thời gian bán hủy trong cơ thể
người là từ 5-12 năm. Khoảng 90% dioxin hấp thụ vào cơ thể qua
con đường ăn uống.
1.1.3. Ảnh hƣởng của dioxin đối với sức khỏe con ngƣời
Dioxin gây tổn thương đa dạng và phức tạp, làm phát sinh
nhiều bệnh lý ở các cơ quan khác nhau. Dioxin không chỉ gây tổn hại
tới sức khỏe của người bị phơi nhiễm mà còn gây ảnh hưởng tới con
cái họ ở những thế hệ kế tiếp trong tương lai.
1.1.4. Một số phƣơng pháp định lƣợng dioxin
1.1.3.1. Phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ độ phân giải cao,
1.1.3.2. Phương pháp DR CALUX
1.2. CƠ CHẾ PHÂN TỬ TÁC ĐỘNG CỦA DIOXIN
1.2.1. Thụ thể Aryl hydrocarbon receptor (AhR)
1.2.1.1. Cấu trúc của thụ thể AhR
Thụ thể AhR - thụ thể của dioxin được hoạt hóa bởi các phối
tử (ligand). Phối tử điển hình của AhR là TCDD. AhR là một thành
viên của họ protein thuộc nhân tố điều hòa phiên mã (transcription
factor), có cấu trúc basic helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim
1
- (bHLH/PAS). AhR có các vùng cấu trúc đảm nhiệm các chức năng:
liên kết với phối tử, liên kết với DNA của gen đích, liên kết các
protein thành phần và chức năng hoạt hóa phiên mã.
1.2.1.2. Vai trò của protein AhR trong cơ thể
AhR là yếu tố điều hòa biểu hiện các gen tham gia đảm
nhiệm các chức năng sinh lý quan trọng của cơ thể. AhR tham gia
biệt hóa nhiều loại tế bào trong giai đoạn sớm của quá trình phát
triển cá thể (Li Y, 2011; Gargaro, 2016). AhR đóng vai trò thiết yếu
trong việc duy trì cân bằng nội môi trong tế bào. Khi cơ thể tích tụ
dioxin có thể chứa protein AhR được hoạt hóa lâu dài, thường xuyên,
dẫn đến trạng thái ức chế miễn dịch thường xuyên và liên tục (Ridolfi,
2010).
1.2.1.3. Vai trò protein AhR đối với bệnh ung thư
Thông qua thụ thể AhR, dioxin ảnh hưởng lên các giai đoạn
của ung thư. Mức độ biểu hiện cao của AhR có liên quan lớn với sự
tiến triển ung thư cũng như với tỷ lệ mắc ung thư (Dietrich, 2010;
Safe, 2013). Ngoài ra, AhR đóng vai trò quan trọng trong giảm kết
dính tế bào dẫn đến gia tăng sự xâm lần mô và di căn của tế bào ung
thư. Mặt khác, AhR có thể hoạt động như một gen ức chế khối u
(tumor suppressor gene) và gen trở nên không hoạt động trong quá
trình hình thành khối u ở một số điều kiện nhất định (Fan Y, 2010).
1.2.2. Cơ chế tác động của dioxin thông qua thụ thể AhR
1.2.2.1. Con đường tín hiệu cổ điển (canocial signaling pathway)
Trong điều kiện không có phối tử, AhR trong tế bào chất, liên
kết với các protein thành phần như: AIP (aryl hydrocarbon receptor
interacting protein), p23 và 2 phân tử HSP90 (90-kDa heat shock
2
- protein). Khi dioxin khuếch tán qua màng tế bào vào liên kết với AhR,
phức hệ AhR được hoạt hóa, thay đổi cấu hình và vận chuyển vào
trong nhân tế bào. Trong nhân, AhR được giải phóng khỏi hệ thống
phức hợp các protein thành phần và tương tác với nhân tố dẫn truyền
nhân ARNT (AHR nuclear translocator-ARNT). Phức hệ AHR/ARNT
sau đó liên kết với vị trí DNA đặc biệt trên gen đích, gọi là yếu tố đáp
ứng với các chất lạ (xenobiotic respone element, XRE) hay yếu tố đáp
ứng dioxin (dioxin response element, DRE), qua đó điều hòa biểu hiện
các gen đích (Quintuna, 2013; Wright, 2017).
1.2.2.2. Con đường tín hiệu phi cổ điển (non-canocial signaling
pathway)
AhR còn điều hòa phiên mã gen đích thông qua con đường
khác không liên quan đến trình tự đáp dioxin (DRE) trên gen đích,
mà qua vị trí DRE (non-consensus DRE, NC - DRE) trên vùng
promoter của gen đích. Để liên kết được với trình tự này, AHR cần
kết hợp một protein Kruppel-like Factor 6 (KLF6) và có sự đồng tham
gia của protein carbamoyl phosphate synthase 1 (CPS1) (Wright, 2017).
1.2.3. Dioxin gây biến đổi vật chất di truyền
Dioxin là tác nhân môi trường gây tổn thương vật chất di truyền
và phát sinh đột biến gen thông qua hình thành các gốc tự do chứa oxy
hoạt động (reactive oxygen species, ROS) (Mates, 2010; Franken, 2017).
1.3. TỔNG QUAN VỀ GEN AHR
1.3.1. Đặc điểm gen AhR ở ngƣời
Gen AHR ở người có kích thước khoảng 50 kb, nằm trên vai
ngắn của nhiễm sắc thể số 7 (7p21.1), gồm 11 exon và 10 intron, mã
hóa protein AhR có 848 acid amin.
3
- 1.3.2. Vai trò của đa hình gen AhR trong chuyển hóa dioxin và
các chất ô nhiễm môi trƣờng
Đa hình gen AHR thúc đẩy hoặc kìm hãm hoạt động của thụ
thể AhR. Đa hình gen AHR có thể điều chỉnh đáp ứng của cơ thể đối
với các nhân tố gây tổn hại gen có trong môi trường sống (Ridolf,
2014). Mặc dù ô nhiễm môi trường và dioxin làm gia tăng nghiêm
trọng tỷ lệ ung thư, vẫn có nhiều cư dân sống trong vùng ô nhiễm lại
không mắc ung thư hay các bệnh liên quan đến dioxin. Điều này
được giải thích dựa trên cơ sở ái lực liên kết giữa dioxin với receptor
AHR. Các cá thể khác nhau trong nhạy cảm với dioxin có thể là do
các đa hình gen AHR mã hóa các receptor có ái lực khác nhau với
TCDD (Ridolf, 2014; Kovalova 2016).
1.4. TỔNG QUAN VỀ GEN AIP
1.4.1. Đặc điểm gen AIP
Gen AIP nằm trên nhiễm sắc thể số 11 (11q13.2) có 6 exon mã
hóa protein AIP có 330 amino acid, trọng lượng phân tử là 37 kDa.
1.4.2. Đột biến gen AIP liên quan bệnh lý ở ngƣời
Các thể đột biến protein AIP mất khả năng ức chế phân bào và
không có khả năng liên kết với các protein thành phần, bao gồm cả
các protein trong con đường thụ thể AhR (Igreja, 2010). AIP hoạt
động như là nhân tố áp chế khối u ở hầu hết các mô. Đột biến gen
AIP liên quan tới bệnh u tuyến yên (Hernandez, 2017).
1.5. VAI TRÒ PROTEIN AIP TRONG CON ĐƢỜNG TÍN HIỆU
THÔNG QUA THỤ THỂ AHR
AIP có vai trò ổn định phức hợp của AhR gắn kết với phối tử,
duy trì AhR trong bào tương, ngăn chặn sự phân giải AhR bởi
proteasome. AIP có thể ảnh hưởng đến tính nguyên vẹn của AhR
4
- hoặc sự truyền tín hiệu của thụ thể AhR (Jaffrain, 2009). AIP còn
điều hòa hoạt động phiên mã của gen AhR. Sự nhạy cảm của tế bào
với dioxin có liên quan tới protein AIP. Đột biến mất chức năng AIP
dẫn đến bất thường trong điều hòa biểu hiện các gen đích của con
đường tín hiệu AhR (Nukaya, 2010; Rowland, 2011).
1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN ĐỐI TƢỢNG NHIỄM
DIOXIN Ở VIỆT NAM
Tại Việt Nam, đã có các nghiên cứu đánh giá sự thay đổi nội
tiết, miễn dịch, sinh hoá, huyết học và tồn lưu dioxin trong máu,
trong sữa mẹ ở những người dân sống trong vùng ô nhiễm chất da
cam/dioxin. Các nghiên cứu điều tra thực trạng, cơ cấu bệnh tật trên
đối tượng nạn nhân dioxin. Các nghiên cứu phân tử đã chỉ ra những
thay đổi trong biểu hiện/đột biến ở một số gen trên đối tượng phơi
nhiễm dioxin như: p53, CypP1A1, AhR, CypP1B1, hOGG1... Đối
với các gen AhR, chưa có nhiều nghiên cứu tập trung xác định đa
hình/đột biến trên toàn bộ vùng biểu hiện gen AhR. Với gen AIP, cho
đến nay chưa có nghiên cứu về biến đổi gen AIP ở người nhiễm
dioxin nói riêng và quần thể người Việt Nam nói chung.
1.7. NGHIÊN CỨU HỆ GEN (GENOME) VÀ HỆ GEN BIỂU HIỆN
(EXOME) TRÊN ĐỐI TƢỢNG NHIỄM DIOXIN
Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) trên các đối tượng nạn
nhân dioxin đã được tiến hành ở tài cấp Nhà nước 33 (KHCN-33/11-
15), theo mô hình trio (bố - con – mẹ) đã giải mã hệ gen một số gia
đình nạn nhân chất độc da cam. Giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES)
được thực hiện trên đối tượng con/cháu của các nạn nhân chất độc da
cam bị thiểu năng trí tuệ trong đề tài NAFOSTED (106-YS.01-2014.34).
5
- Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu phơi nhiễm dioxin là 93 người đã được
xét nghiệm dioxin trong huyết thanh máu (thuộc đề tài Nhà nước
KHCN-33.04/11-15). Đối tượng không phơi nhiễm dioxin là 20
người dân sống ở khu vực quận Hà đông, Hà Nội. Đối tượng nghiên
cứu giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES) là 1 cựu chiến binh bị
nhiễm dioxin (thuộc đề tài NAFOSTED 106-YS.01-2014.34).
2.2. HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ
Hóa chất của các hãng: Sigma, Quiagen, Fermentas…Trang
thiết bị của Viện nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
6
- 2.3.1. Tách chiết DNA tổng số
2.3.2. Đo quang phổ DNA
2.3.3. Điện di DNA trên gel Agarose
2.3.4. Nhân gen bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR)
2.3.5. Giải trình tự gen tự động
2.3.6. Phương pháp giải trình tự toàn bộ exon (WES)
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. MỘT SỐ CHỈ SỐ SINH HỌC CỦA ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Chúng tôi phân tích chỉ số sinh học của 114 mẫu (94 mẫu phơi
nhiễm và 20 mẫu không phơi nhiễm dioxin). Các mẫu phơi nhiễm
dioxin được phân thành 3 nhóm:
Bảng 3.1. Phân nhóm đối tƣợng nghiên cứu
Nhóm đối tƣợng n Tổng
Không phơi nhiễm dioxin 20 20
Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10
ppt và bị bệnh liên quan dioxin 27
Nhóm 2: dioxin trong máu ≥10 ppt
Phơi nhiễm và không bị bệnh liên quan dioxin 34
94
dioxin
Nhóm 3: dioxin trong máu
- bệnh ung thư và đái tháo đường type II (9/27 mẫu; 33,33%). Độ tuổi
trung bình của đối tượng phơi nhiễm và không phơi nhiễm tương
đương nhau. Độ tuổi trung bình của 3 nhóm trong vùng phơi nhiễm
có sự chênh lệch, tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa thống kê
(p>0,05). Nữ giới chiếm tỷ lệ cao hơn nam giới trong cả 2 nhóm phơi
nhiễm và không phơi nhiễm dioxin. Tuy nhiên, ở nhóm có dioxin
≥10 ppt, bị bệnh liên quan dioxin thì nam chiếm tỷ lệ cao hơn nữ
khoảng 1,5 lần. Trong khi ở 2 nhóm còn lại, nữ giới nhiều gấp 1,6
đến 1,7 lần so với nam giới. Chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index,
BMI) liên quan đến nồng độ dioxin trong cơ thể cũng như khả năng
đào thải dioxin. Chỉ số BMI ở 3 nhóm đối tượng trong vùng phơi
nhiễm dioxin không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p>0,05.
Tỷ lệ người thừa cân, béo phì tương đương nhau giữa nhóm 1 và
nhóm 2. Trong nhóm 3 tỷ lệ người béo phì thấp hơn, tuy nhiên khác
biệt này không có ý nghĩa thống kê .
3.2. ĐA HÌNH CÁC GEN AHR VÀ AIP
3.2.1. Tách chiết DNA tổng số
3.2.2. Nhân bản gen các gen AHR và AIP
Sản phẩm PCR khuếch đại 11 exon gen AhR và 6 exon gen
AIP là đặc hiệu, có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết.
3.2.3. Phân tích đa hình gen AHR
Xác định được 4 đa hình trên exon và exon 10; 1 đa hình
intron 5 gen AhR. Các đa hình đều xuất hiện riêng lẻ ở các cá thể
khác nhau.
8
- Bảng 3.6. Các đa hình gen AhR phát hiện trong nghiên cứu
Thay Nhóm đối tƣợng
Số hiệu Thay đổi Số mẫu
Vị trí đổi PN Không PN
đa hình nucleotide (n)
protein % (n) % (n)
rs17779352 Exon 2 c.132T>C N44N 22 8,3% (1) 0
rs3802082 Intron 5 c. 575-199A>T - 22 75,0% (9) 60% (6)
rs2066853 Exon 10 c.1661G>A R554K 114 63,8% (60) 65% (13)
rs75519181 Exon 10 c.1459A>G N487D 114 2,10% (2) 0
rs779531731 Exon 10 c.1541T>C I514T 114 1,10% (1) 0
Chú thích: PN - phơi nhiễm. Không PN - không phơi nhiễm. Dấu - biểu thị đa hình
không làm thay đổi protein
Phân tích so sánh tần số các đa hình gen AR trong nghiên cứu
này và một số quần thể người trên thế giới theo Human Genetic
Varition Database (HGVD), vói n=100 cho mỗi quần thể. Người
Việt Nam trên HGVD là người Kinh sống ở thành phố Hồ Chí Minh
Bảng 3.7. Tần suất các đa hình gen AhR trong nghiên cứu, so sánh với
đa hình ở các quần thể ngƣời (theo HGVD )
Tần số đa hình theo HGVD, n=100 cho mỗi quần thể
Số hiệu Nghiên cứu
Việt Nhật Trung Nam Châu Châu Châu
đa hình n (%)
Nam bản quốc Á Phi Mỹ Âu
rs17779352 1/22 (4,5) 8,1 5,8 5,6 18,8 4,1 6,3 14,1
rs3802082 15/22 (68,2) 57,4 70,2 70,4 73,8 24 30,9 30,3
rs2066853 73/114 (64) 56,6 71,2 67,6 27,4 70,7 31,7 20,9
rs75519181 2/114 (1,8) 0.0 2,9 2,9 0 0 0 0
rs779351731 1/114 (0,9) --- --- --- --- --- --- ---
Ký hiệu ---là không có thông tin tần số đa hình trên Human Genetic Varition Database
9
- 3.2.3.1. Đa hình trên exon 2 gen AhR
Đa hình trên exon 2 được phát hiện là c.132T>C, p.N44=, số
hiệu rs17779352, có ở một mẫu vùng phơi nhiễm, đối tượng có nồng
độ TCDD trong máu cao (53,57ppt), chẩn đoán mắc bệnh ung thư
khí quản và tiểu đường type II.
3.2.3.2. Đa hình trên intron 5 gen AhR
Đa hình được phát hiện là rs3802082 (c.575-199A>T), tần số
68,2%. Tần số đa hình ở quần thể người Việt Nam là 57,4 % . Ở các
quần thể người đa hình đều xuất hiện với 3 kiểu gen AA, AT và TT.
Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, đa hình chỉ thấy có 2 kiểu gen TA
và TT, không có kiểu (AA) ở tất cả các mẫu nghiên cứu.
3.2.3.3. Đa hình trên exon 10 gen AhR
Phát hiện thấy có 3 điểm đa hình exon 10 đều dẫn đến thay đổi
amino acid (Bảng 3.8). Tần số kiểu gen của cả 3 đa hình đều đạt
trạng thái cân bằng Hardy-Weinberg.
Bảng 3.8. Tần suất allele, kiểu gen các đa hình exon 10 gen AhR
Kiểu gen Allele
Đa hình HWpval
Kiểu gen n, (%) allele %
GG 36% (41)
rs2066853 G 61,8%
GA 51,8% (59) 0.4317
Đa hình (1) A 38,2%
AA 12,3% (14)
rs75519181 GA 1,8% (2) G 99,1%
1
Đa hình (2) AA 98,2% (112) A 0,9%
rs779351731 TT 99,1% (113) T 99,6%
CT C 0,4% 1
Đa hình (3) 0,9% (1)
HWpval (Hardy-Weinberg p value): giá trị cân bằng Hardy-Weinberg, tần
số các kiểu gen đạt trạng thái cân bằng khi p>0.001.
10
- Đa hình (1) exon 10 gen AhR: rs2066853
Đa hình rs2066853 (c.1661G>A, p.R554K) chiếm tỷ lệ cao
(64%), xuất hiện ở cả 3 kiểu gen là GG, GA và AA.
Tỷ lệ % Phơi nhiễm
60 55
51
Không phơi nhiễm
36 35
40
20 13 10
0 Kiểu gen
GG GA AA
Hình 3.10. Phân bố các kiểu gen của đa hình rs2066853 gen AhR
ở nhóm phơi nhiễm và không phơi nhiễm dioxin
Trục tung: Tỷ lệ % đối tượng nghiên cứu. Trục hoành: Các kiểu gen (GG, GA và
AA) của đa hình rs206853 gen AhR. Cột màu đỏ biểu thị nhóm đối tượng phơi
nhiễm dioxin. Cột màu xanh biểu thị nhóm đối tượng không phơi nhiễm dioxin.
Kiểu gen GA chiếm tỷ lệ cao hơn kiểu gen GG ở cả vùng phơi
nhiễm và không phơi nhiễm dioxin (Hình 3.10).
Bảng 3.10. Tần suất các kiểu gen (GG, GA, AA) của đa hình rs2066853
gen AhR ở 3 nhóm vùng phơi nhiễm dioxin
Kiểu gen: %, (n)
Nhóm nghiên cứu P
GG GA AA
Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10 ppt, 55,6 % 29,6% 14,8%
bị bệnh liên quan dioxin (15 (8) (4)
Nhóm 2: dioxin trong máu ≥10 ppt, 23,5% 64,7% 11,8% P=0.083
không bị bệnh liên quan dioxin (8) (22) (4)
Nhóm 3: dioxin trong máu
- Tần số các kiểu gen GG, GA và AA giữa 3 nhóm trong vùng
phơi nhiễm không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p>0.05,
(bảng 3.10). Tuy nhiên, ở nhóm 1 tần số kiểu gen GG cao hơn 1,88
lần kiểu gen GA. Ngược lại, ở nhóm 2, tần số kiểu gen GA lại cao
hơn 2.75 lần so với kiểu gen GG. Để đánh giá sự khác biệt này có ý
nghĩa thống kê hay không, chúng tôi phân tích riêng tần số kiểu gen
GG và GA giữa nhóm 1 và nhóm 2 (bảng 3.11)
Bảng 3.11. Tần suất kiểu gen GG và GA của đa hình rs2066853
gen AhR ở nhóm 1 và nhóm 2 vùng phơi nhiễm dioxin
Kiểu gen: %, (n)
Nhóm nghiên cứu p, OR, 95%CI
GG GA
65,2 % 34,8%
Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10 ppt, bị
(15) (8) p = 0.005
bệnh liên quan dioxin
OR = 5.156
26,7% 73,3%
Nhóm 2: dioxin trong máu ≥10 ppt, 95%CI:
(8) (22)
không bị bệnh liên quan dioxin (1.585 - 16.1771)
Chú thích: p thu được từ kiểm định χ2 , OR (Odd ratio): tỷ số chênh. 95%CI
(95% confidnece interval): khoảng tin cậy 95%.
Sự khác biệt kiểu gen GG và GA giữa nhóm 1 và nhóm 2 có ý
nghĩa thống kê (OR = 5.156; 95%CI: 1.585 - 16.1771; p
- thể AhR với các phối tử (Frericks, 2008; Chen, 2009). Trong nghiên
cứu này, nhóm có dioxin trong máu
- 6.923; 95%CI: 1.624 - 29.513; pG, p.N487D) trong nghiên cứu
của chúng tôi xuất hiện với 2 kiểu gen là AA và GA.
Bảng 3.12. Phân bố tần suất allele và kiểu gen đa hình rs75519181 gen
AhR trong nghiên cứu, so sánh với các quần thể ngƣời (theo HGVD)
Allele Trong Tần số đa hình theo HGVD, n=100 cho mỗi quần thể
Kiểu gen nghiên cứu Việt Nhật Trung Nam Châu Châu Châu
n=114 Nam bản quốc Á Phi Mỹ Âu
Allele A 99,1 100 98,6 98,6 100 100 100 100
G 0,9 0 1,4 1,4 0 0 0 0
Kiểu AA 98,2 100 97,1 97,1 100 100 100 100
gen
GA 1,8 0 2,9 2,9 0 0 0 0
Hầu hết các quần thể người trên thế giới, đều không có đa hình
rs75519181 (Bảng 3.12). Tuy nhiên, trong nghiên cứu này phát hiện
thấy đa hình rs75519181 ở 2 mẫu trong vùng phơi nhiễm, nhóm 2
(1,8%). Không phát hiện thấy đa hình này ở các mẫu không phơi
nhiễm dioxin. Phân tích đánh giá ảnh hưởng của đa hình rs75519181
cho thấy, khi Asp thay thế Asn tại vị trí 487 dẫn đến mất đi một cầu
nối hydro trong phân tử. Ngoải ra, Asn là amino acid trung tính,
14
- không tích điện, được thay bằng một amino acid mang tính acid và
tích điện âm (Asp). Điều này có thể làm thay đổi ái lực liên kết ion
trong phân tử protein.
Đa hình (3) exon 10 gen AhR: rs779351731
Đa hình rs779351731 (c.1541T>C, p.I514T) có 2 kiểu gen TT
và CT. Cho đến nay chưa có dữ liệu về tần số đa hình cũng như tần
số các allele và kiểu gen của đa hình trên các chủng tộc người trên
thế giới. Trong nghiên cứu này, đa hình rs779351731 (kiểu gen CT)
có ở 1 /114 mẫu (tỷ lệ 0,88%), đối tượng có nồng độ dioxin trong
máu cao, được xác nhận là không mắc bệnh liên quan đến dioxin.
Phân tích cấu trúc protein cho thấy, khi thay thế I (Isoleucine) dẫn
đến mất một liên kết hydro tai vị trí Gl516, hình thành mới liên kết
hydro tại His511. Ngoài ra, Isoleucine có đặc tính không phân cực,
kị nước được thay bằng Threonine có tính phân cực.
3.2.4. Phân tích đa hình gen AIP
Phiện thấy 5 đa hình/đột biến ở các exon 2, exon 4 và exon 5.
Bảng 3.13. Các đa hình gen AIP phát hiện trong nghiên cứu
Nhóm đối tƣợng
Số hiệu Thay đổi Thay đổi Số mẫu
Vị trí PN Không PN
đa hình nucleotide protein (n)
% (n) % (n)
rs747233720 Exon2 c.120 G>A - 114 8,5% (8) 10% (2)
Đột biến mới Exon2 c.124C>A H42N 114 3,2% (3) 0
rs138902236 Exon 4 c.517G>A E173K 114 10,6 (10) 15% (3)
rs2276020 Exon 4 c.516C>T p.D172D 114 23,4% (22) 20% (4)
rs641081 Exon 5 c.682C>A p.Q228K 114 94 (100%) 20 (100%)
Trong 4 đa hình gen AIP, đa hình rs641081 xuất hiện ở 100% ở
đối tượng nghiên cứu. Tần số kiểu gen của cả 3 đa hình còn lại
15
- (rs747233720, rs138902236, rs2276020) đều đạt trạng thái cân bằng
Hardy-Weinberg, với giá trị Hwpval =1 (>0.001) (bảng 3.14).
Bảng 3.14. Tần suất allele, kiểu gen 3 đa hình gen AIP trong nghiên cứu
Kiểu gen Allele
Đa hình HWpval
kiểu gen n (%) allele %
GG 104 (91,2) G 95,6
rs747233720 1
GA 10 (8,8) A 4,4
GG 101 (88,6) G 94,6
rs138902236 1
GA 13 (11,4) A 5,4
CC 88 (77,2)
C 87,7
rs2276020 CT 24 (21,1) 1
T 12,3
TT 2 (1,7)
3.2.4.1. Đa hình trên exon 2 gen AIP
Đa hình rs747233720 có ở 10/114 mẫu (8,8%). Chưa có dữ
liệu công bố về tần số đa hình cũng như tần số allele và kiểu gen của
đa hình này ở các quần thể người trên thế giới. Một biến đổi khác
được phát hiện trên exon 2 là c.124C>A, p.H42N, biến đổi có thể coi
là đột biến mới (chưa có trên dbSNP). Đột biến xuất hiện ở ba mẫu
(DN30, DN34, DN52), nhóm có nồng độ dioxin cao và bị bệnh liên
quan dioxin. Đột biến H42N dẫn đến mất 1 liên kết hydro trong phân
tử protein, đồng thời thay thế một một amino acid vòng, tích điện
dương (Histidine) thành một amino acid trung tính, không tích điện
(Asparagine). Đa hình H42N nằm ở đầu cuối N của protein. Đầu N
của AIP đóng vai trò quan trọng trong tương tác của AIP với các
protein khác cũng như duy trì cấu trúc và sự ổn định của AIP trong tế
bào (Linnert, 2013).
16
- 3.2.4.2. Đa hình trên exon 4 gen AIP
Đa hình rs138902236 (c.517G>A, p.E173K) xuất hiện ở 2
kiểu gen GG và GA. Hầu hết các quần thể người trên thế giới đều
không có đa hình này. Trong nghiên cứu này, đa hình rs138902236
(GA) xuất hiện với tỷ lệ khá cao (13/114 mẫu, 11,4%). Đa hình dẫn
đến thay thế amino acid có tính acid, tích điện âm (Glutamic acid)
thành amino acid có tính kiềm, tích điện dương (Lysine).
3.2.4.3. Đa hình trên exon 5 gen AIP
Đối với exon 5 phát hiện thấy đa hình rs641081 (c.682C>A,
p.Q228K) ở 100% mẫu nghiên cứu. Kết quả này phù hợp với tần số
đa hình rs641081 quần thể người Việt Nam trên cơ sở dữ liệu HGVD.
Ở nhóm đối tượng dioxin ≥ 10 ppt và mắc các bệnh liên quan
đến dioxin, có 2 trường hợp mang đồng thời đa hình H42N gen AIP
và đa hình R554K gen AhR (mẫu DN34, DN52). Cả 2 trường hợp
đều mắc bệnh tiểu đường type II, trong đó 1 trường hợp mắc đồng
thời ung thư khí quản (DN52). Ngoài ra, 2 trường hợp khác có đa
hình E173K gen AIP, trong đó 1 người có đa hình R554K gen AhR
kiểu gen GA (mẫu DN53) mắc bệnh thần kinh ngoại biên và 1 người có
đa hình R554K gen AhR kiểu gen AA (DN56) mắc ung thư khí quản.
3. GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ HỆ GEN BIỂU HIỆN (WES) NGƢỜI
CÓ NỒNG ĐỘ DIOXIN TRONG MÁU CAO
Từ kết quả WES mẫu có nồng độ dioxin trong máu cao (mẫu
ThN). Chúng tôi đã sàng lọc được 40 biến thể di truyền ở 8 gen (AhR,
AIP, AhRR, CYP1A1, ARNT, CYP1B1, HEMGN, CENPE) liên quan
đến con đường chuyển hóa dioxin thông qua thụ thể AhR (Bảng 3.18)
17
nguon tai.lieu . vn