1. Trang Chủ
  2. Ngư nghiệp
  3. Dòng hóa và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trong tế bào nấm men Pichchia pastoris

Dòng hóa và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trong tế bào nấm men Pichchia pastoris

Nghiên cứu này có mục tiêu là tạo tái tổ hợp ADN của gen VP28 ở virus trong tế bào nấm men nhằm thu được chủng nấm men có khả năng biểu hiện protein VP28 ngoại bào làm nguyên liệu cho việc điều chế vắc xin/tolerine phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 DÒNG HÓA VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ VP28 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRONG TẾ BÀO NẤM MEN PICHCHIA PASTORIS Ngô Thị Ngọc Thủy1, Nguyễn Viết Dũng2, Đặng Thị Trà My1 TÓM TẮT Virus gây bệnh đốm trắng là loạ

Thể loại Tài liệu miễn phí Ngư nghiệp

Số trang 10

Ngày tạo 12/29/2020 11:36:26 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 0.48 M

Tên tệp

Tải Dòng hóa và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ VP28 c... (.pdf)

Xem mẫu

  1. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 DÒNG HÓA VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ VP28 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRONG TẾ BÀO NẤM MEN PICHCHIA PASTORIS Ngô Thị Ngọc Thủy1, Nguyễn Viết Dũng2, Đặng Thị Trà My1 TÓM TẮT Virus gây bệnh đốm trắng là loại virus phổ biến và là một trong những nguyên nhân gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm he trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Nghiên cứu này có mục tiêu là tạo tái tổ hợp ADN của gen VP28 ở virus trong tế bào nấm men nhằm thu được chủng nấm men có khả năng biểu hiện protein VP28 ngoại bào làm nguyên liệu cho việc điều chế vắc xin/tolerine phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi. Đoạn gen VP28 đã được khuếch đại bằng kỹ thuật Polymerase chain reaction; sản phẩm khuếch đại sau đó được dòng hóa vào vector pPIC9K để tạo tái tổ hợp pPIC9K-VP28 rồi pPIC9K-VP28 được biến nạp vào tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 để biểu hiện protein mục tiêu và cảm ứng biểu hiện bằng methanol. Quá trình sàng lọc 200 chủng nấm men sau biến nạp đã được thực hiện. Kết quả thu được 5 chủng nấm men có mang pPICK9K- VP28 có khả năng cảm ứng biểu hiện protein VP28 ngoại bào. Áp dụng phương pháp Bradford để đo nồng độ protein ngoại bào của 5 chủng nghiên cứu theo thời gian lên men P. pastoris và lượng protein tổng số cao nhất sau 72 giờ nuôi cấy là 106,9 μg/ml. Từ khóa: Pichia pastoris, protein, VP28, WSSV I. MỞ ĐẦU bằng chất kích thích miễn dịch và đặc biệt bằng Virus gây hội chứng đốm trắng (White spot protein/DNA tái tổ hợp (vắc xin/tolerine),... đã syndrome virus - WSSV) xuất hiện đầu tiên thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu năm 1992 tại Trung Quốc (Chou và ctv, 1995) nhất là sau khi hiện tượng “đáp ứng miễn dịch” là loại virus gây bệnh nghiêm trọng và phổ biến (quasi-immune response) trên tôm (Venegas và nhất cho các loài tôm he. Ở Việt Nam, virus ctv, 2000) được công bố. này được phát hiện năm 1993 và từ đó đến nay Việc sử dụng kỹ thuật tạo protein DNA tái chúng luôn là một trong những nguyên nhân tổ hợp đã được nghiên cứu ở Việt Nam với mục chủ yếu gây thiệt hại kinh tế lớn cho nghề nuôi tiêu phát triển kháng thể đa dòng trong chẩn tôm. Theo cục Thú y, Bộ Nông nghiệp và Phát đoán bệnh đốm trắng (Nguyễn Quỳnh Anh triển Nông thôn, năm 2012, bệnh đốm trắng đã 2006; Bùi Thị Bích Hằng, 2012). Tuy nhiên, xuất hiện ở vùng nuôi tôm của 19 tỉnh thành chưa có nghiên cứu nào ứng dụng kỹ thuật này trên cả nước với tổng diện tích bệnh là 8.108,5 trong việc nghiên cứu chế tạo vắc xin/tolerine ha. Bảy tháng đầu năm 2013, dịch bệnh đốm phòng bệnh đốm trắng trên tôm. Nghiên cứu trắng đã xuất hiện và lây lan nhanh tại 23 tỉnh này là một phần của đề tài cấp Bộ: “Bước đầu với tổng diện tích bệnh là 7.030 ha. Nhằm giảm nghiên cứu, sản xuất tolerin có khả năng hạn thiểu thiệt hại do dịch bệnh đốm trắng gây ra, chế lây lan của virus gây bệnh đốm trắng trên các biện pháp phòng bệnh bằng thảo dược, tôm Sú nuôi thương phẩm ở Đồng bằng sông 1 Phân Viện Nghiên cứu Thuỷ sản Minh Hải, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 Email: thuyngo8@yahoo.com 2 Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014 79
  2. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Cửu Long” sẽ thực hiện việc dòng hóa và biểu Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng cách hiện gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus gây sử dụng bộ kit PCR purification (Invitrogen) và bệnh đốm trắng trong tế bào nấm men để làm thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. nguyên liệu cho việc chế tạo vắc xin/tolerine  Tinh sạch plasmid pPICK9K phòng bệnh cho tôm. Plasmid pPIC9K trong vi khuẩn E. coli II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP DH5α được tinh sạch bằng bộ kit Wizard® NGHIÊN CỨU Plus SV Minipreps DNA Purification (A1330, 2.1. Vật liệu nghiên cứu Promega, Mỹ). Cụ thể, một khuẩn lạc E. coli Chủng virus đốm trắng được sử dụng DH5α mang vector pPIC9K trên môi trường trong nghiên cứu này là chủng thu được tại LB có ampicilin được chọn và nuôi sinh khối tỉnh Quảng Ngãi trong thời gian dịch bệnh; là trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicilin loại virus đã dùng trong nghiên cứu của Dieu (100µg/ml), nuôi cấy lắc (200 vòng/phút) ở (2010) được cung cấp bởi trường Đại học 37°C; sinh khối thu sau 18-24 giờ nuôi cấy. Sau Wageningen, Hà Lan. đó, plasmid pPIC9K trong sinh khối vi khuẩn nuôi cấy được tinh sạch bằng kit theo hướng 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu dẫn của nhà sản xuất. Plasmid tinh sạch được Công việc được tiến hành tại Viện Nghiên bảo quản ở -20°C. cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 từ tháng 4/2013 đến  Xử lý DNA VP28 và plasmid đã tinh sạch tháng 12/2013. bằng enzyme cắt giới hạn 2.3. Phương pháp nghiên cứu DNA VP28 và plasmid đã tinh sạch được 2.3.1. Phương pháp tạo vector tái tổ hợp xử lý với enzyme cắt giới hạn EcoRI và NotI . pPick9K-VP28 Thành phần hóa chất tham gia quá trình phân (1). Chuẩn bị gen VP 28 và vector cắt bao gồm: 1,6μl nước cất; 30,0μl DNA  Khuếch đại và tinh sạch cấu trúc gen (VP28) hoặc pPIC9K; 4,0μl NEB Buffer 3 VP28 (Jha và ctv, 2007) (10X); 2,0μl EcoRI (10.000U/μl, NEB); 2,0μl NotI (10.000U/ μl, NEB) và 0,4μl BSA 100X. Đoạn gen VP28 của virus được nhân lên về Hỗn hợp cắt được ủ qua đêm ở 37°C. Toàn bộ số lượng bằng phương pháp polymerase chain sản phẩm sau phản ứng được điện di trên gel reaction (PCR) sử dụng cặp mồi VP28YE-FW agarose 1% và sau đó tinh sạch lại bằng bộ (5’-AAAGAATTCATGGATCTTTCTTTCA hóa chất Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up CTCTTTCGGG-3’) mang trình tự System (Promega, Mỹ). Sản phẩm sau tinh sạch nhận biết enzyme cắt giới hạn EcoRI và được bảo quản ở -20°C. VP28YE-R-His (5’-GCGGCCGCATG AT G AT G AT G AT G AT G C T C G G T C T C (2). Tạo vector tái tổ hợp pPIC9K-VP28 AGTGCCAGAG-3’) có gắn trình tự nhận biết Gen VP28 và vector pPIC9K sau khi được của enzyme cắt giới hạn NotI và một trình tự mã xử lý với 2 enzyme EcoRI và NotI sẽ được nối hóa liên tục 6 amino acid Histidine (phần gạch bằng enzyme gắn kết T4 ligase (Promega, Mỹ). chân). Điều kiện phản ứng: 94°C trong 3 phút Phản ứng nối bao gồm các thành phần: 2μl nước sau đó chu kỳ 95°C trong 30 giây, 55°C trong cất, 1μl dung dịch đệm 10x, 1μl VP28/EcoRI- 45 giây, 72°C trong 60 giây được lặp lại 35 lần NotI, 5μl pPIC9K/EcoRI-NotI, 1,0μl T4 ligase, và phản ứng được giữ ở 72°C trong 10 phút ủ nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Bằng việc thiết lập trước khi kết thúc. Sản phẩm phản ứng được pPICK9K-VP28 tại vị trí chèn của cặp enzyme điện di trên gel agarose 1,5% và kiểm tra dưới EcoRI và NotI, hệ thống vector này sẽ cho phép tia UV. Sản phẩm PCR của gen VP28 là 650bp. biểu hiện protein VP28 tái tổ hợp mang trình 80 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
  3. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 tự peptide α-factor, protein VP28 với 6xHis quả các dòng nấm men này chỉ còn gene AOX2 gắn ở đầu C-terminal sẽ được P. pastoris tiết nên quá trình biến dưỡng methanol sẽ kém đi và ra môi trường nuôi cấy. Trong quá trình tiết ra được gọi là chủng MutS. Ngược lại, ở kiểu hình môi trường, trình tự peptide α-factor sẽ tự động Muts gen AOX1 bị bất hoạt nên quá trình biến được cắt bỏ. dưỡng methanol sẽ kém đi, làm nấm men phát (3). Phương pháp hóa biến nạp và chọn triển kém trên môi trường có methanol. dòng vi khuẩn tái tổ hợp pPICK9K-VP28 và pPICK9K rỗng (không Sử dụng phương pháp biến nạp bằng sốc mang gen mục tiêu) ở dạng mạch thẳng sẽ nhiệt để chuyển sản phẩm nối pPIC9K-Vp28 được điện biến nạp vào P. pastoris GS115 vào các tế bào khả nạp E. coli JM109 (L2001, (Invitrogen, Mỹ). Cụ thể, 10µg pPICK9K- Promega, Mỹ). Quy trình tóm tắt như sau: lấy VP28 hoặc pPICK9K mạch thẳng được trộn 2μl sản phẩm nối pPIC9K-VP28 cho vào 50 μl cùng 80µl tế bào nấm men khả biến đã tinh sạch E. coli giữ lạnh, khuấy nhẹ và ủ 15 phút trong trong cuvette điện biến nạp vô trùng. Cuvette đá lạnh; rồi cho vào bể nhiệt ở 42°C trong 45 này được ủ đá trong 5 phút rồi tiến hành điện giây và ủ ngay lại trên đá lạnh trong 2 phút. biến nạp ở 1500V trong 1,5 giây. Sau đó, 100µl Dung dịch sau đó được bổ sung 950μl môi Sorbitol 1M lạnh được cho vào cuvette rồi tiến trường SOC lạnh và nuôi cấy lắc (200 vòng/ hành trải hỗn hợp tế bào sau điện nạp trên 2 đĩa phút) trong 1 giờ ở 37°C. Chia đều 1000μl môi trường MD, ủ đĩa ở 28°C. Sau 2-3 ngày hỗn hợp thành hai phần và trải trên 2 đĩa môi nuôi cấy, quan sát các khuẩn lạc mọc trên môi trường LB Agar có ampiciline (100 μg/ml) và trường MD. ủ ở 37°C qua đêm. Sự hiện diện của pPIC9K- 2.3.3. Chọn lọc dòng P. pastoris mang gen VP28 trong vi khuẩn được kiểm tra bằng VP28 và có khả năng biểu hiện protein phương pháp PCR với mồi VP28YE-FW và (1). Chọn lọc dựa trên tốc độ tăng trưởng VP28YE-R-His. Đồng thời, sự hiện diện của trên môi trường chứa methanol gen VP28 trong vector tái tổ hợp pPICK9k- Chuyển các chủng Pichia tái tổ hợp trên VP28 được xác định bằng máy giải trình tự AB môi trường Minimal dextrose (MD) sau điện system với mồi giải trình tự AOX1 Reverse biến nạp sang môi trường Minimal methanol 5’-GCAAATG GCATTCTGACATCC-3’ và α (MM), MD và Yeast extract peptone dextrose factor 5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’ (YPD), theo thứ tự. Ủ các đĩa môi trường ở (Công ty Nam Khoa, Việt Nam). 28°C trong 2-3 ngày. Các chủng Mut+ và MutS 2.3.2. Điện biến nạp pPICK9K-VP28 vào được phân biệt dựa vào mức độ tăng sinh tế bào nấm men của nấm men: Mut+ tăng trưởng bình thường Vector tái tổ hợp pPIC9K-VP28 được mở trên cả MM và MD, trong khi, MutS chỉ tăng vòng bằng enzyme SalI nhằm tạo điều kiện cho trưởng trên môi trường MD mà không hoặc gene mục tiêu gắn chèn vào bộ gene P. pastoris tăng trưởng yếu trên MM. GS115 ở vị trí gene HIS4 và giữ được gene (2). Chọn lọc dòng nấm men mang gene AOX1 nguyên vẹn. Do đó, đa số các chủng nấm mục tiêu bằng PCR men này là có kiểu hình Mut+ - gen AOX1 tự Sự hiện diện của plasmid pPIC9K-VP28 nhiên của nấm men còn nguyên vẹn - có thể trong các dòng P. pastoris được xác định phát triển tốt trên môi trường có methanol. Tuy bằng phương pháp PCR với cặp mồi AOX1-F nhiên, do trong plasmid vẫn còn sự hiện diện ( 5 ’ G A C T G G T T C C A AT T G A C A A G C ) của trình tự AOX1 nên sự tái tổ hợp cũng có thể và AOX1-R (3’GCAAA xảy ra trên gene AOX1 làm bất hoạt gen, kết TGGCATTCTGACATCC). DNA từ các dòng TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014 81
  4. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 nấm men được tách chiết bằng bộ kit DNeasy đạt nồng độ cuối cùng là 2% rồi được ủ ở 28°C Plant Mini (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà có lắc (250 vòng/phút). Sau mỗi 24 giờ nuôi sản xuất. Điều kiện phản ứng: 10ng DNA; cấy, methanol 100% lại được bổ sung vào môi 1,25µl mồi (10µM), 0,5µl dNTP mix (10mM), trường (nồng độ cuối cùng 2%) nhằm cảm ứng 2,5µl dung dịch đệm và MgCl2 (10x), 1µl Taq sự biểu hiện protein. Sau 24, 48, 72 giờ nuôi cấy polymerase (1U), ddH2O cho đủ 25µl. Chế độ tiến hành thu dịch nuôi cấy và xác tế bào bằng nhiệt của phản ứng : 94°C trong 5 phút, sau đó cách ly tâm; sản phẩm được bảo quản ở -80°C. là 30 chu kỳ 94°C trong 5 giây, 55°C trong 30 Sự hiện diện của protein VP28 trong xác giây, 72°C trong 2 phút 30 giây và cuối cùng là tế bào và dịch nuôi cấy được kiểm tra bằng chu kỳ 72°C trong 10 phút. Kết quả được điện SDS-PAGE và khẳng định lại bằng phương di trên agarose gel 1%. pháp Western blot với kháng thể đặc hiệu VP28 (3). Chọn dòng P. pastoris mang nhiều gen (Invitrogen, Mỹ); hàm lượng protein được đo VP28 trên môi trường YPD Geneticin bằng phương pháp Bradford. Vector pPICK9K có trình tự mã hóa cho gen kanamycine, gen này không kháng kháng III. KẾT QUẢ sinh kanamycine mà kháng G418. Mức kháng 3.1. Tạo dòng vector tái tổ hợp pPIC9K- G418 phụ thuộc vào số lượng gen kanamycine VP28 trong tế bào E.coli JM109 tích hợp trong P. pastoris. Giữa gen kanamycine Kết quả nhân dòng gen mã hóa protein và “cassette biểu hiện” có một mối liên hệ di VP28 được thể hiện trong Hình 1. Theo đó truyền, dựa vào đó người ta có thể suy luận rằng đoạn gen được khuyếch đại có độ dài khoảng những dòng có khả năng kháng G418 ở nồng 650 bp tương đương với độ dài của đối chứng độ cao thường chứa nhiều bản sao của gen được dương là chủng virus WSSV nhận được từ biến nạp vào và do đó khả năng biểu hiện protein ĐH Arizone (Mỹ) và phù hợp với chiều dài cao hơn. Do đó, các dòng P. pastoris pPIC9K- lý thuyết của sản phẩm khuếch đại là 645 bp. VP28 đã chọn lọc theo 2 phương pháp trên sẽ được chuyển sang môi trường YPD có G418 Sau xử lý với enzyme cắt giới hạn, băng nồng độ 2, 4, 6mg/ml. Chọn dòng P. pastoris DNA VP28/EcoRI-NotI và pPIC9K/EcoRI- pPIC9K-VP28 có khả năng kháng G418 ở nồng NotI được phân tách trên gel agarose 1,2% và độ cao nhất. được cắt ra để tinh sạch nhằm loại bỏ những 2.3.4. Biểu hiện protein DNA tạp không mong muốn. Kết quả kiểm tra kích thước, độ sạch của VP28/EcoRI-NotI và Các dòng P. pastoris pPIC9K-VP28 mọc pPIC9K /EcoRI-NotI được thể hiện ở Hình 2. tốt trên môi trường YPD Geneticin 6mg và dòng Theo đó băng VP28/EcoRI-NotI và pPIC9K/ đối chứng (mang plasmid rỗng) sẽ được chọn EcoRI-NotI có kích thước tương ứng với để cảm ứng biểu hiện protein trong môi trường lý thuyết là 645bp và 9276bp và không tạp có bổ sung 2% methanol. Cụ thể, các khuẩn lạc đơn của nấm men được nuôi cấy trong môi nhiễm với DNA có kích thước khác. trường BMGY ở 28°C có lắc (250 vòng/phút) Vector tái tổ hợp PIC9K-VP28 được chuyển cho đến khi OD600nm đạt 2-6 được thu sinh khối vào E. coli JM109 bằng kỹ thuật sốc nhiệt và vi bằng cách ly tâm môi trường nuôi cấy ở 1500g khuẩn sau biến nạp được trải trên môi trường trong 5 phút ở nhiệt độ phòng và được huyền thạch LB bổ sung ampicilin 50µg.10-1ml. Sáu phù trong môi trường BMMY sao cho OD600nm khuẩn lạc được chọn để kiểm tra sự hiện diện của dịch nuôi cấy bằng 1. Tiếp theo, môi trường của gen VP28 bằng phương pháp PCR với bộ nuôi cấy sẽ được bổ sung methanol 100% để mồi VP28YE-FW và VP28YE-R-His. Kết quả 82 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
  5. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 phân tích (Hình 3) cho thấy cả 6 dòng vi khuẩn 6-11 đều cho kết quả dương tính với gen VP28. Trong đó hai khuẩn lạc 7 và 11 cho kết quả khuyếch đại tốt hơn nên được chọn cho phân tích tiếp theo với enzyme cắt giới hạn. Hình 3. Kết quả phân tính dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pPIC9K-VP28 Giếng 6-11: Khuẩn lạc E. coli sau biến nạp với pPIC9KVP28 Giếng M: Thang DNA Giếng Pos: Chứng dương với WSSV Giếng Neg: Chứng âm với vi khuẩn E.coli Sự hiện diện của vector tái tổ hợp pPIC9K- VP28 trong hai khuẩn lạc 7 và 11 được kiểm tra bằng cắt giới hạn với cặp enzyme EcoRI và NotI. Kết quả cho thấy vector tái tổ hợp pPIC9K-VP28 của dòng vi khuẩn 7 và 11 sau Hình 1. Kết quả khuyếch đại gen VP28 bằng khi xử lý bằng enzyme cắt giới hạn cho hai phương pháp PCR băng sản phẩm, băng có kích thước nhỏ tương Giếng M: Thang DNA 100bp. Giếng Pos: ứng với kích thước của gen VP28/EcoRI-NotI chứng dương; Giếng Neg: chứng âm; W: chủng và băng có kích thước lớn tương đương kích virus WSSV sử dụng làm khuôn mẫu. thước của pPIC9K/EcoRI-NotI (Hình 4); ngoài ra không có vạch phụ xuất hiện, vậy phản ứng cắt đã được thực hiện hoàn toàn. Hình 4. Kết quả cắt pPIC9K-VP28 với EcoRI và NotI Giếng M1, M2: thang DNA 1kb và 100bp Hình 2. VP28 và pPIC9K sau khi xử lý với Giếng 1, 2: Gen VP28/EcoRI-NotI; enzyme EcoRI và Not I. pPIC9K/EcoRI-NotI; Giếng M1: thang DNA 1Kb. Giếng M2: Giếng 3, 5, 4, 6: pPIC9K-VP28 của vi thang DNA 100bp khuẩn 7 và 11 chưa và đã xử lý enzyme TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014 83
  6. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Để kiểm tra độ chính xác của trình tự (AF332093.2), Nhật Bản (AY249443.1), Mỹ gen VP28 và vị trí nối với vector pPIC9K, (AY249442.1), Indonesia (AY249441.1), Ấn plasmid tái tổ hợp tách từ hai dòng 7 Độ (DQ681069.1), Việt Nam (AY168644) và 11 được chọn giải trình tự tại công ty đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu Nam Khoa (Việt Nam). Kết quả cho thấy NCBI. Ngoài ra, phân tích dịch mã cho thấy giải trình tự gen VP28 của 2 dòng giống gen VP28 đặt trong vector pPIC9K-VP28 nhau và tương đồng 100% với các chủng cho phép mã hóa một protein tái tổ hợp có WSSV được phân lập từ nhiều quốc gia 204 a.a và được gắn thêm 6 Histidine vào gồm Hàn quốc (JX515788.1), Trung Quốc đầu C-terminal của protein này (Hình 5). Hình 5. Trình tự nucleotide và trình tự amino acid giả định protein VP28 được định mã từ vector pPIC9K-VP28 của dòng vi khuẩn 7 và 11 Từ những kết quả trên, chúng tôi có thể lạc clone 7 và 100 khuẩn lạc clone 11) được khẳng định đã tạo được hai dòng vi khuẩn E.coli chọn để kiểm tra kiểu hình bằng cách nuôi cấy JM109 mang vector pPIC9k chứa gen mã hóa lần lượt trên 3 môi trường MM, MD và YPD ở protein VP28 của virus WSSV. Trên vector 28°C trong 3 ngày. Kết quả nuôi cấy cho thấy pPIC9K, đoạn gen mã hóa protein VP28 được 182 khuẩn lạc có khả năng mọc tốt trên cả 3 gắn thêm một trình tự nucleotide mã hóa 6xHis môi trường chọn lọc; các khuẩn lạc này sẽ được ở đầu 3’ đã được chèn vào vị trí ngay sau trình dùng cho quá trình chọn lọc tiếp theo. tự mã hóa peptide α-factor. 3.2. Kết quả chuyển plasmid pPIC9K- VP28 vào nấm men P. pastoris GS115 Vector pPIC9K thuộc dạng vector sát nhập, khi biến nạp sẽ sát nhập vào bộ gen của tế bào chủ thông qua tái tổ hợp tương đồng. Tế bào nấm men sau điện biến nạp được trải trên môi trường MD không có histidin và ủ trong 2-3 ngày. Kết quả ghi nhận được có 400 khuẩn lạc mọc trên môi trường MD sau điện biến nạp. Hình 6. Sự hiện diện của gene VP28 trong 3.3. Kết quả sàng lọc các dòng P. pastoris genome của 1 số chủng nấm men GS115 mang nhiều bản sao gen VP28 Giếng M: Thang DNA 100bp Hai trăm khuẩn lạc mọc tốt, to, tròn, rời Giếng pPIC9K: plasmid pPIC9K. trên môi trường MD (trong đó có 100 khuẩn Giếng p-VP28: plasmid pPIC9K-VP28 84 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
  7. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Giếng P.P: Pichia pastoris 3.4. Kết quả sàng lọc các dòng P. Giếng P.pPIC9K: P.pastoris –pPIC9K. pastoris GS115 có khả năng tiết protein Giếng 120, 120A, 125, 126, 179: chủng số 120, VP28 ngoại bào 120A, 125, 126, 179 Sáu mươi hai chủng nấm men mang Sự hiện diện của gen VP28 trong 182 pPIC9K-VP28 đã qua sàng lọc và 1 chủng nấm khuẩn lạc nấm men chọn lọc được kiểm tra men mang pPICK9K (đối chứng âm) được cảm bằng phương pháp PCR với cặp mồi AOX1-F ứng biểu hiện protein trên môi trường nuôi và AOX1-R dựa trên khuôn mẫu là DNA tổng cấy sinh khối BMGY và kích thích methanol số của tế bào nấm men. Kết quả cho thấy các 2% trên môi trường BMMY trong 72 giờ. Sự chủng nghiên cứu đều cho 2 vạch: khoảng 1.117 hiện diện của protein VP28 trong dịch nuôi cấy bp (kích thước của gen VP28 thêm 492bp - kích được phân tích bằng kỹ thuật Western blot với thước từ vị trí bắt cặp của mồi trên hệ gen P. kháng thể đặc hiệu của VP28. Kết quả biểu hiện pastoris đến vị trí gắn chèn) và khoảng 2,2 protein đã xác định được 25 chủng có sự hiện kb - kích thước của gen AOX1 (Hình 6). Như diện của protein VP28 trong dịch nuôi cấy. Tuy vậy, tất cả các chủng nấm men kiểm tra đều nhiên, chỉ 5 chủng: 120, 120A, 125, 126, 179 có chứa pPICK9K-VP28 trong genome; nói cho vạch rõ ràng ở kích thước khoảng 28 kDa cách khác, gen VP28 đã được biến nạp thành trên bản gel chạy Western blot với kháng thể công vào bộ gen của nấm men P. pastoris với kháng VP28 được dùng để nghiên cứu tiếp theo. kiểu hình Mut+. Sau khi tạo dòng thành công, quá trình sàng lọc dòng P.pastoris có khả năng biểu hiện pro- tein VP28 cao nhất được thực hiện bằng cách cấy chuyển 182 khuẩn lạc sang môi trường YDP có bổ sung G418 ở các nồng độ 4mg/l và 6mg/l. Kết quả sàng lọc đã xác định được 123/182 khuẩn lạc có khả năng kháng Geneticin 418 ở nồng độ 4mg/l và 62 khuẩn lạc kháng G418 ở nồng độ 6mg/l (Hình 7). Theo lý thuyết, 62 khuẩn lạc này có chứa 14-18 copy gene VP28 trong genome và Hình 8. Protein VP28 trong dịch nuôi cấy chúng được sử dụng để kiểm tra khả năng biểu nấm men hiện protein VP28. M: Thang protein; 120, 120A, 125, 126, 179: các chủng nấm men Ctrl(-): Chứng âm-nấm men có pPICK9K rỗng 3.5. Kết quả biểu hiện protein Năm chủng nấm men có chứa pPICK9k- VP28 trong genome có khả năng tiết protein ngoại bào được cảm ứng biểu hiện và lượng protein tiết ra trong dịch nuôi cấy được xác định theo thời gian: 24, 48 và 72 giờ. Kết quả đo hàm lượng protein theo thời gian trong quá trình nuôi cấy cho thấy cả 5 chủng nghiên cứu đều có khả Hình 7. Kết quả chọn lọc dòng P. pastoris năng tiết protein ngoại bào và lượng protein tiết mang tái tổ hợp pPIC9K-VP28 kháng 6ppm Geneticin ra tăng dần theo thời gian lên men từ 24 đến 72 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014 85
  8. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 giờ (Đồ thị 1); Trong đó, chủng 126 có khả năng quả bảo vệ cho crayfish trước bệnh đốm trắng tiết ra lượng protein cao nhất (106,9μg/ml) sau sau 3 ngày và kéo dài tới 21 ngày sau khi dùng 72 giờ nuôi cấy. rVP28. Trong khi đó, thời gian bảo hộ của rVP28 biểu hiện bằng vi khuẩn gram âm E.coli hoặc vi khuẩn gram dương Brevibacillus choshinensis và B. brevis trên tôm lần lượt là 10 ngày, 7 ngày và 14 ngày (Caipang et al., 2008; Mavichak et al., 2009; Witteveldt et al., 2006). Chính vì vậy, việc tạo ra nguyên liệu là dòng nấm men có mang pPICK9K-VP28 có khả năng tiết protein ngoại bào là bước khởi đầu cho những nghiên cứu về vắc xin/tolerine phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi ở Việt Nam. V. KẾT LUẬN Đồ thị 1. Nồng độ protein tổng số của các chủng nghiên cứu ở các thời điểm khác nhau Đoạn gen VP28 của virus gây bệnh đốm trong quá trình lên men trắng trên tôm đã được nhân bản, gắn với plasmid pPICK9K và dòng hóa thành công vào IV. THẢO LUẬN vi khuẩn khả nạp E. coli JM109 và tế bào nấm men P. pastoris GS 115. Trên thế giới, nhiều tác giả đã dòng hóa và biểu hiện protein VP28 trong tế bào vi khuẩn Năm chủng nấm men Pichia patoris có chứa khả biến E.coli để làm nguyên liệu để chế tạo pPICK9K-VP28 trong bộ gen có khả năng biểu vắc xin/tolerine (Witteveldt và ctv., 2004; 2006; hiện được protein mục tiêu VP28 dạng ngoại Satoh và ctv., 2008). Ngoài E. coli, một số nhà bào trong điều kiện cảm ứng bằng methanol với nghiên cứu còn sử dụng các vi khuẩn khả biến nồng độ 2% và lượng protein tổng số tiết ra cao khác như: vi khuẩn gram dương Brevibacillus nhất sau 72 giờ nuôi cấy là 106,9 μg/ml. brevis (Caipang et al., 2008), hoặc tế bào côn trùng (Du et al., 2006) để dòng hóa các gen vỏ TÀI LIỆU THAM KHẢO của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm nuôi. Tài liệu tiếng Việt Ở Việt Nam, Nguyễn Quỳnh Anh (2006), Bùi Nguyễn Quỳnh Anh, 2006. Báo cáo đề tài: “Dòng hoá và Thị Bích Hằng (2012) cũng đã thành công trong biểu hiện Gen mã hoá Protein vỏ VP28 và VP281 việc dòng hóa gen VP28 của virus đốm trắng của Virus gây hội chứng đốm trắng ( WSSV ) trong vào tế bào khả biến E.coli để tạo kháng thể ứng E.coli”. dụng trong việc chẩn đoán nhanh bệnh. Việc Bùi Thị Bích Hằng, 2012. Tạo tái tổ hợp DNA VP28 dùng tế bào nấm men để dòng hóa và biểu hiện của virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm protein chỉ được 1 nhóm nhỏ các nhà nghiên sú. Tạp chí khoa học 2012:22a 1-7. Trường Đại cứu quan tâm nhưng hiệu quả bảo vệ của loại Học Cần Thơ. vắc xin/tolerine - sản phẩm của quá trình dòng Cục Thúy Y- Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, hóa này - mang lại cao hơn và cho thời gian 2012. Báo cáo Hội nghị tổng kết nuôi tôm nước bảo hộ dài hơn các loại vắc xin/tolerine khác. lợ. Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi năm 2012 Cụ thể, Jha và ctv (2006, 2007) đã xác định và triển khai kế hoạch năm 2013. dùng rVP28 biểu hiệu qua tế bào nấm men bằng Cục Thú Y - Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, phương pháp tiêm hoặc cho ăn đều đem lại hiệu 2013. Báo cáo Tình hình dịch bệnh, dịch tễ 86 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
  9. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 bệnh đốm trắng (WSD) và hoại tử gan tụy cấp Nishizawa, Yoshimizu, M., 2008. “Protection (AHPND) ở tôm nuôi 7 tháng đầu năm 2013 và against white spot syndrome virus (WSSV) một số đề xuất quản lý rủi ro đối với AHPND. Tài infection in kuruma shrimp orally vaccinated with liệu phục vụ Hội nghị tại Bạc Liêu – 6/8/2013. WSSV rVP26 and rVP28.” Diseases of Aquatic Tài liệu tiếng Anh Organisms 82(2), 89-96. Caipang, C.M.A., Verjan, N., Ooi, E.L., Kondo, Takahashi Y., Itami T., Kondo M., Maeda M., Fujii R., H., Hirono, I., Aoki, T., Kiyono, H., Yuki, Y., Tomonaga S., Supamattaya K., Boonyaratpalin S., 2008. Enhanced survival of shrimp, Penaeus 1994. Electron microscopy evidence of bacilliform (Marsupenaeus) japonicus from white spot virus infection in Kuruma shrimp (Penaeus syndrome disease after oral administration of Japonicus). Fish Pathol 29:121-125.Venegas, recombinant VP28 expressed in Brevibacillus C. A., L. Nonaka, Mushiake, K., Nishizawa, T., brevis. Fish & Shellfish Immunology 25, 315-320. Muroga, K., 2000. “Quasi-immune response of Chou, H.Y., Huang, C.Y., Wang, C.H., Chiang, H.C. Penaeus japonicus to penaeid rod-shaped DNA and Lo, C.F, 1995. Pathogenicity of a baculovirus virus (PRDV).” Diseases of Aquatic Organisms infection causing white spot syndrome in 42(2), 83-89. cultured penaeid shrimp in Taiwan. Diseases of Van Hulten M.C., Westenberg M., Goodall S.D., Vlak Aquatic Organisms. 23(3):p. 165-173.Du, H.H., J.M., 2000. Identification of two major virion Xu, Z. R., Wu, X. F., Li, W. F., Dai, W., 2006. protein genes of white spot syndrome virus of Increased resistance to white spot syndrome virus shrimp. Virology 266, 227-36. in Procambarus clarkii by injection of envelope Wang, C., Lo, C., Leu, J., Chou, C., Yeh, P., Chou, H., protein VP28 expressed using recombinant Tung, M., Chang, C., Su, M. and Kou, G., 1995. baculovirus. Aquaculture, 2006 260(1-4), p. 39-43. Purification and genomic analysis of baculovirus Huang, J., Song, X.L., Yu, J., Yang, C.H., 1994. associated with white spot syndrome (WSBV) Baculoviral hypodermal and haematopoietic of Penaeus monodon. Diseases of Aquatic necrosis-pathology of the shrimp explosive Organisms, 1995. 23, 239-242. epidermic disease. Yellow Sea Fishery Research Witteveldt, J., J. M. Vlak, van Hulten, M. C. W., 2004. Institute, Qingdae, P.R. China.Jha, R.K., Xu, Z. “Protection of Penaeus monodon against white R., Bai, S. J., Sun, J. Y., Li, W. F., Shen, J., 2007. spot syndrome virus using a WSSV subunit vác Protection of Procambarus clarkii against white xin.” Fish & Shellfish Immunology 16(5), 571-579 spot syndrome virus using recombinant oral vac- Witteveldt, J., J. M. Vlak, van Hulten, M. C. W., 2006. cine expressed in Pichia pastoris. Fish & Shellfish “Increased tolerance of Litopenaeus vannamei Immunology, 2007. 22(4), p. 295-307. to white spot syndrome virus (WSSV) infection Jha, R.K., Xu, Z.R., Pandey, A., 2006. The efficacy after oral application of the viral envelope protein of recombinant vaccines against white spot syn- VP28.” Diseases of Aquatic Organisms 70(1-2), drome virus in Procambarus clarkii. Immunology 167-170. Letters, 2006. 105(1), p. 68-76. Wongteerasupaya C., Vicker J.E., Sriurairatana S., Mavichak, R. K., Hirino, H., Aoki, I., Kiyono, T., Nash G.L., Akarajarmorn A., Boonsaeng V., Yuki, Y., 2009. Protection of pacific white shrimp, Panyim S., Tassanakajon A., Withyachumnarnkul Liptopenaeus vannamei against white spot virus B., Flegel T.W., 1995. A nonoccluded, systemic following administration of N-terminus truncated baculovirus that occurs in cells of ectodermal and recombinant VP28 protein expressed in Gram mesodermal origin and causes high mortality in positive bacteria, Brevibacillus choshinensis. the black tiger prawn Penaeus monodon. Disease Aquaculture Science 57:83-90. Satoh, J., T. of Aquatic Organism 21, 69–77 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014 87
  10. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 DEVELOP DNA RECOMBINANT VP28 OF WHITE SPOT SYNDROME VIRUS IN YEAST PICHIA PASTORIS Ngo Thi Ngoc Thuy1, Nguyen Viet Dung2, Dang Thi Tra My1 ABSTRACT White spot syndrome virus (WWSSV) is a popular and devastating virus to Penaeus shrimp-culture industry worldwide. The aim of this study is to develope DNA recombinant VP28 of the virus in yeast P. pastoris for expressing protein VP28 extracellularly in order to make materials for recombinant protein vaccine/tolerine against WSSV in shrimp. DNA fragment content of VP28 was amplified from WSSV and its product was di- gested by restriction enzyme EcoRI and NotI; then cloned into plasmid pPICK9K to make recombinant vector pPICK9K-VP28. This vector, after that was transformed into Pichia pastoris GS115 to express protein VP28. The screening of 200 yeast clones after transformation was conducted and 5 yeast clones which expressed protein VP28 extracellular were selected for Bradford assay. The results indicated that the total extracellular protein containing VP28 increased with fermentation periods of 24, 48 and 72 hours and the highest concen- tration of total protein reached to 106.9 μg.ml-1. Keywords: Pichia pastoris, protein, VP28 , WSSV Người phản biện: ThS. Nguyễn Thị Hiền Ngày nhận bài: 10/02/2014 Ngày thông qua phản biện: 28/02/2014 Ngày duyệt đăng: 30/3/2014 1 Minh Hai Sub-Institute for Fisheries Research, Research Institute for Aquaculture No 2. Email: thuyngo8@yahoo.com 2 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No 2. 88 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
nguon tai.lieu . vn
Nông nghiệp Ngư nghiệp Lâm nghiệp Sinh học Hoá học Ngôn ngữ học Ngân hàng - Tín dụng