1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (Stachys affinnis)

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (Stachys affinnis)

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng nhân chồi và tạo rễ nhằm thiết lập môi trường thích hợp để nhân nhanh cây sùng thảo trong vi nhân giống in vitro; đánh giá sự ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo ở giai đoạn vườn ươm. Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY SÙNG THẢO (STACHYS AFFINIS

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 88

Ngày tạo 10/11/2021 12:28:31 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 2.04 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng quy trình nhân giống in... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY SÙNG THẢO (STACHYS AFFINIS) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Hoàng Quân Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Hằng MSSV: 1311100026 Lớp: 13DSH01 TP. Hồ Chí Minh, năm 2017
  2. Đồ án tố t nghiê ̣p LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nô ̣i dung trong đồ án tố t nghiê ̣p là công trình nghiên cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Nguyễn Hoàng Quân – cán bộ kỹ thuật tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM. Đề tài đươ ̣c tiế n hành nghiên cứu thực nghiê ̣m ta ̣i phòng Thực nghiê ̣m Cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh Ho ̣c Tp. HCM. Các số liê ̣u và kế t quả có trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực.Tôi xin hoàn toàn chiụ trách nhiê ̣m về lời cam đoan này. Tp. HCM, ngày 20 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiê ̣n Nguyễn Thị Thanh Hằng
  3. Đồ án tố t nghiê ̣p LỜI CẢM ƠN Qua thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại Trung tâm, em xin gửi lời cám ơn đến Trung Tâm Công nghệ Sinh Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và hỗ trợ trang thiết bị giúp em hoàn thành đề tài. Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là gửi lời cám ơn đến tất cả các thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Môi trường – Thực phẩm đã tạo điều kiện tốt nhất cũng như dạy bảo và truyền đạt nhiều kiến thức bổ ích giúp em hoàn thành khóa học cùa mình. Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến TS. Hà Thị Loan – Phó Giám đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM và ThS. Nguyễn Hoàng Quân đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo kiến thức cho em trong suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp. Em xin cảm ơn toàn thể anh chị đang làm việc tại Trung tâm và các bạn sinh viên cùng làm đề tài tại Trung tâm đã giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đề tài. Con xin cám ơn ba mẹ đã có công sinh thành và nuôi dưỡng con khôn lớn. Cám ơn anh chị em và người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn ở bên cạnh giúp đỡ và luôn cổ vũ tinh thần cho em. Em xin chân thành cảm ơn. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 7 năm 2017 Sinh viện thực hiện Nguyễn Thị Thanh Hằng
  4. Đồ án tố t nghiê ̣p MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... i DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. ii DANH MỤC BIỂU ĐỒ ........................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. iv MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................1 2. Ý nghĩa của đề tài ...............................................................................................1 3. Đố i tươ ̣ng và pha ̣m vi nghiên cứu ......................................................................2 4. Mục đích nghiên cứu ..........................................................................................2 5. Nội dung nghiên cứu...........................................................................................2 6. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................3 7. Kết quả đạt được .................................................................................................3 8. Bố cục đồ án .......................................................................................................3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................4 1.1. Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật ......................................................4 1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật ................4 1.1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ......................................5 1.1.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro .................................8 1.1.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật ...............9 1.2. Giới thiệu về chi Stachys ...............................................................................17 1.3. Giới thiệu về cây sùng thảo (Stachys affinis) ................................................19 1.3.1. Phân loại ...............................................................................................19
  5. Đồ án tố t nghiê ̣p 1.3.2. Đặc điểm sinh học và công dụng .........................................................19 1.3.4. Thành phần hóa học .............................................................................21 1.3.5. Giá trị dinh dưỡng ................................................................................22 1.4. Một số nghiên cứu về chi Stachys .................................................................23 1.4.1. Kháng viêm và giảm đau......................................................................24 1.4.2. Chống oxy hóa .....................................................................................24 1.4.3. Chống lo âu ..........................................................................................25 1.4.4. Kháng khuẩn .......................................................................................26 1.5. Các nghiên cứu nhân giống in vitro chi Stachys............................................27 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................29 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................29 2.2. Vật liệu và phương pháp ................................................................................29 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu ..............................................................................29 2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất ......................................................29 2.2.3. Môi trường nghiên cứu.........................................................................30 2.2.4. Điều kiện phòng nuôi cấy ....................................................................30 2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................30 2.3. Nội dung nghiên cứu......................................................................................30 2.4. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................31 2.4.1. Pha môi trường nuôi cấy ......................................................................31 2.4.2. Các thao tác trong phòng cấy ..............................................................32 2.4.3. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................32
  6. Đồ án tố t nghiê ̣p 2.4.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo. ......................................................................32 2.4.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo .............................................................................................................33 2.4.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của gía thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo ngoài vườn ươm .................................................................................35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................37 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo. ..................................................................................................................37 3.2. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo .........................42 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm ...........................................................................................................................47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................52 4.1. Kết luận ..........................................................................................................52 4.2. Kiến nghị........................................................................................................52 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................53 1. Tài liệu Tiếng Việt ............................................................................................53 2. Tài liệu Tiếng Anh ............................................................................................53 PHỤ LỤC ...................................................................................................................1 Phu ̣ lu ̣c A: Thành phần môi trường MS .................................................................1 Phụ lục B: Quy trình nhân giống cây sùng thảo (Stachys affinis) ..........................2 Phụ lục C: Bảng số liệu được xử lí thống kệ bằng phần mềm SAS 9.4 .................3
  7. Đồ án tố t nghiê ̣p DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây sùng thảo ............................................................................................19 Hình 1.2. Củ sùng thảo ..............................................................................................20 Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy .............................................................................39 Hình 3.2. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy. ............................................................................................................................46 Hình 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau 4 tuần trồng .......................................................................................51 i
  8. Đồ án tố t nghiê ̣p DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng của một số chất khử trùng ........................10 Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi .......33 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ ...................................34 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm .........................................................................................................35 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy. ............................................................................38 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy. ............................................................................................................43 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau 4 tuần trồng .......................................................................................48 ii
  9. Đồ án tố t nghiê ̣p DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến tỷ lệ tạo mẫu tạo chồi sau 4 tuần nuôi cấy .....................................................................................................................39 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy .............................................................................39 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy .....................................................................................................................44 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau 4 tuần trồng .................................................................................................48 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau 4 tuần trồng .......................................................................................49 iii
  10. Đồ án tố t nghiê ̣p DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T Trichlorophenoxyacetic acid ABA Abscisic acid BA Benzyl Adenine CNSH Công Nghệ Sinh Học ĐC Đối chứng GA Gibberellin IAA 3-Indole acetic acid IBA 3-Indole butyric acid MS Murashige – Skoog NAA Napthalene Acetic Acid PhG Phenylpropanoid Glycosides TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh iv
  11. Đồ án tố t nghiê ̣p MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam có một tiềm năng lớn về tài nguyên cây dược liệu, trong số hơn 12.000 loài thực vật tại Việt Nam thì có gần 4.000 loài có công dụng làm thuốc với vùng phân bố rộng khắp cả nước, có nhiều loài dược liệu được xếp vào loài quý hiếm trên thế giới như: Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang, Bách hợp, Thông đỏ, Vàng đắng, Hoàng liên ô rô, Hoàng liên gai, Thanh thiên quỳ, Ba gạc Vĩnh Phú,… Theo kết quả điều tra và đánh giá tại một số vùng, trồng cây dược liệu đem lại giá trị kinh tế to lớn hơn bất kỳ loại cây lương thực, thực phẩm nào (có thể thu nhập trên 100 triệu đồng/ha). Tuy nhiên theo báo cáo tháng 9/2016 của Cục Quản lý Y, Dược cổ truyền (Bộ Y tế) cho biết hàng năm, ngành dược Việt Nam sử dụng khoảng 60.000 tấn dược liệu các loại, nhưng Việt Nam mới chỉ tự cung cấp được khoảng 20% nguyên liệu để phục vụ việc sản xuất thuốc trong nước, còn khoảng 80 - 85% vẫn phải nhập khẩu từ nước ngoài (chủ yếu nhập từ Trung Quốc) và mới chỉ có 1.400 tấn dược liệu nhập khẩu có nguồn gốc rõ ràng, rất ít so với nhu cầu sử dụng dược liệu hiện nay. Cây sùng thảo là một loại cây đã được trồng làm thực phẩm ở nhiều nơi trên thế giới như Trung Quốc, Nhật Bản, Pháp…. Củ sùng thảo giàu dinh dưỡng và chứa nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe. Các bộ phận của cây và các chiết xuất từ cây sùng thảo đã được sử dụng như một phương thuốc cổ truyền điều trị nhiễm trùng, cảm lạnh, bệnh tim, bệnh lao và viêm phổi ở Trung Quốc. Các nghiên cứu về các loài cùng chi và nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của Stachys affinnis đã chứng minh chúng chứa nhiều hoạt chất thứ cấp có nhiều công dụng như kháng viêm, chống oxy hóa, ngừa loãng xương, điều trị ung thư, bệnh tiểu đường,…. Nắm bắt những cơ sở khoa học thực tiễn và nhu cầu của thị trường, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thực hiện đề tài: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (Stachys affinnis). 2. Ý nghĩa của đề tài 1
  12. Đồ án tố t nghiê ̣p • Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên củng cố lại kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học. - Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học nhằm bổ sung thông tin về cây sùng thảo, kỹ thuật nhân giống in vitro cây sùng thảo. - Kết quả nghiên cứu có thể là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo của cùng đối tượng hoặc một số giống cây có giá trị khác. - Biết được phương pháp nghiên cứu một số vấn đề khoa học, xử lý và phân tích số liệu, biết cách trình bài một bài báo khoa học. • Ý nghĩa thực tiễn - Xây dựng quy trình nhân giống cây sùng thảo, tạo ra cây giống có chất lượng cao đáp ứng nhu cầu sản xuất tại Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM. 3. Đố i tươ ̣ng và pha ̣m vi nghiên cứu Đố i tươ ̣ng nghiên cứu đươ ̣c sử du ̣ng trong đề tài này là cây sùng thảo vitro đươ ̣c cung cấ p từ phòng nuôi cấ y mô ta ̣i phòng Thực nghiê ̣m cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM. Pha ̣m vi nghiên cứu trong đề tài này là tâ ̣p trung khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA, IBA lên quá trình nhân chồi, tạo rễ của cây sùng thảo và khảo sát ảnh hưởng của các loại giá thể: mụn xơ dừa, tro trấu,… đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo. 4. Mục đích nghiên cứu - Đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng nhân chồi và tạo rễ nhằm thiết lập môi trường thích hợp để nhân nhanh cây sùng thảo trong vi nhân giống in vitro. - Đánh giá sự ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo ở giai đoạn vườn ươm. 5. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo. 2
  13. Đồ án tố t nghiê ̣p - Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo. - Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm. 6. Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiê ̣m đươ ̣c bố trí theo kiể u hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yế u tố . Mỗi thí nghiê ̣m gồ m 3 – 5 nghiê ̣m thức, các nghiê ̣m thức thí nghiê ̣m đươ ̣c lă ̣p la ̣i ba lầ n. Các số liê ̣u thu thâ ̣p đươ ̣c xử lý thố ng kê bằ ng phầ n mề m SAS 9.4 và chương trình MicroSoft Excel 2016®. 7. Kết quả đạt được - Xác định được nồng độ BA thích hợp kết hợp với NAA cho quá trình nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo. - Xác định được nồng độ IBA thích hợp cho quá trình tạo rễ cây sùng thảo. - Xác định được loại giá thể thích hợp để trồng cây sùng thảo khi trồng cây con in vitro ngoài vườn ươm. 8. Bố cục đồ án Kết cấu của đồ án gồm 4 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 3
  14. Đồ án tố t nghiê ̣p CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật 1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật Nuôi cấy mô và tế bào đã trả qua một lịch sử phát triển lâu dài và được đánh dấu bằng những sự kiện chính sau: Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào. Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào. Năm 1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ quan sinh dục. Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng không thành công. Năm 1904, Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ Cải Crucifers. Năm 1922, Knudson và Bot. Gaz. Cho hạt phong lan nảy mầm in vitro. Năm 1924, Blumenthal và cộng sự tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy hình thành callus tử rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic. Năm 1925, Knudson L, Bot. Gaz làm hạt phong lan nảy mầm in vitro. Năm 1929, Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hoà hợp khi lai ở Linum spp. Năm 1934, Kogl và cộng sự lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một phytohormone thực vật đầu tiên thuộc có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Năm 1936, LaRue và Bull đã nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau. Năm 1939, Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá. 4
  15. Đồ án tố t nghiê ̣p Năm 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cà rốt. Năm 1942, Gautheret lần đầu theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp trong nuôi cấy mô sẹo thực vật. Năm 1944, Skoog lần đầu tiên nghiên cứu sự hình thành chồi phụ từ nuôi cấy mô thuốc lá in vitro. Năm 1950, Morel lần đầu tiên nuôi cấy thành công cây một lá mầm bằng nước dừa. Năm 1951, Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ quan. Năm 1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công. Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy. Năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi). Năm 1962, Murashige và Skoog phát minh ra môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật – môi trường MS. Năm 1964 – 1998, hàng loạt các công trình thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật như cải tiến môi trường và phương pháp nuôi cấy, chuyển gen để lai tạo giống mới, thương mại hóa sản phẩm nuôi cây mô (Dương Tấn Nhựt, 2011). 1.1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Theo Dương Công Kiên (2003), có một số phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật như: 1.1.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Phương pháp thuận lợi có thể đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh bên). 5
  16. Đồ án tố t nghiê ̣p Sau khi vô trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Sau đó chồi tiếp tục vươn dài hình thành thân, lá, ra rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh. Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân giống thông thường khác. 1.1.2.2. Nuôi cấy mô sẹo Trong điều kiện môi trường nuôi cấy có chứa nhiều auxin, mô sẹo được hình thành. Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có định hướng, thường có màu trắng. Trong môi trường phù hợp, mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những loài thực vật không có khả năng nhân giống đỉnh sinh trưởng, hoặc với các loại mẫu nuôi cấy không thể trực tiếp hình thành chồi. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma rất cao trong quá trình nuôi cấy để tạo mô sẹo. 1.1.2.3. Nuôi cấy tế bào đơn Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt tên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp. Khối mô sẹo dưới tác dụng của cơ học và các hóa chất hỗ trợ tách ra nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối. Hệ thống nuôi cấy tế bào đơn giống như hệ thống nuôi cấy vi sinh. Với các cơ chất phù hợp được bổ sung môi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học (alkloid, steoid,…). Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch, tế bào đơn được phát triển thành từng cụm tế bào mô sẹo khi môi trường có auxin hoặc có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên môi trường có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp. Sử dụng các tế bào đơn để xử lý đột biến bằng tia phóng xạ, hóa chất, có ý nghĩa lớn trong chọn tạo giống cây trồng. 6
  17. Đồ án tố t nghiê ̣p 1.1.2.4. Nuôi cấy tế bào trần Tế bào trần thực chất là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có. Tế bào trần có thể tách trực tiếp từ các bộ phận của thực vật (lá, rễ) bằng cơ học (nghiền mẫu và enzyme) trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, tế bào trần có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn năng di truyền). Khi mất thành tế bào, hai tế bào trần có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện cây trồng. quá trình dung hợp tế bào trần có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hoặc khác loài (khoai tây, cà chua). Ở trạng thái không có màng tế bào bao bọc, tế bào trần dễ dàng hấp thu các AND ngoại lai mang các đặc điểm di truyền khác nhau: cải thiện đặc tính kháng bệnh, năng suất và chất lượng cây trồng. Hiện nay kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào trần đang được nghiên cứu và hoàn thiện . 1.1.2.5. Nuôi cấy hạt phấn Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Bao phấn chứa các bào tử hoặc hạt phấn chưa chín nuôi trong môi trường dinh dưỡng xác định nhằm mục đích tạo cây đơn bội. Sau đó dùng colchicin lưỡng bội hóa tạo thành cây lưỡng bội. Nuôi cấy bao phấn được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc tạo ra các dòng, giống thuần ở các cây tự thụ phấn vì đã rút ngắn được thời gian tạo ra giống mới. Nuôi cấy bao phấn tạo giống mới được ứng dụng thành công ở một số loài cây như: lúa mì, lúa nước, thuốc lá, ngô,… 1.1.2.6. Nuôi cấy protoplast Nagata và Takebe (1930) đã thành công trong việc làm cho các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một huyền phù tế bào trong môi trường lỏng. Những năm gần đây kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần đang mở ra nhiều triển vọng trong nghiên cứu di truyền soma, cải tạo, phục tráng và tạo giống cây mới ở thực vật bậc cao nói chung. Phương pháp này được ứng dụng thành công trên nhiều đối tượng khác nhau. Năm 1971, Takebe đã nhận được cây Thuốc lá nhị bội từ tế bào trần, sau đó Ohiama và Nitch nhận được cây thuốc lá đơn bội từ tế bào trần đơn bội. 7
  18. Đồ án tố t nghiê ̣p Đến nay, kỹ thuật nuôi cấy và tái sinh protoplast đã hoàn thiện đối với cây hai lá mầm cũng như nhiều loại cây một lá mầm và trở thành một trong những công cụ quan trọng trong nghiên cứu di truyền nói chung và di truyền tế bào chất nói riêng cũng như trong công tác giống cây trồng . 1.1.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro Cho tới nay việc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro đã được áp dụng cho nhiều loại cây trồng (trên 400 loài). Giáo sư Murashige (1974) đã chia quy trình nhân giống in vitro làm ba giai đoạn và một giai đoạn tiếp sau in vitro: 1.1.3.1. Tạo vật liệu nuôi cấy khởi đầu in vitro Giai đoạn này là bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy. Các mẫu đã được khử trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để tạo ra các chồi mới. Giảm tỷ lệ mẫu nhiễm bệnh, tăng khả năng tái sinh có vai trò quan trọng ở giai đoạn này. Theo Yildiz (2012), mô lấy từ cây non có khả năng tái sinh cao hơn từ cây trưởng thành. Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 – 6 tuần. 1.1.3.2. Nhân nhanh chồi, cụm chồi in vitro Là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhằm tạo ra hệ số nhân cao nhất. Ở giai đoạn này các chồi được kích thích phát sinh thành nhiều chồi, mầm nhằm cung cấp cho các lần cấy chuyển tiếp theo. Hệ số nhân phụ thuộc nhiều vào vai trò của các loại phytohoocmon (thường là cytokynin). 1.1.3.3. Tạo cây hoàn chỉnh, huấn luyện cây con Tạo cây hoàn chỉnh: Các chồi in vitro đủ tiêu chuẩn được chuyển sang môi trường tạo rễ để tạo ra cây giống in vitro hoàn chỉnh với đầy đủ thân, lá, rễ. Trong giai đoạn này, nồng độ cytokynin được giảm xuống và tăng nồng đô auxin nhằm kích thích sự hình thành rễ. Huấn luyện cây con: Là giai đoạn chuấn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô trùng khi đã đạt kích thước nhất định. 1.1.3.4. Chuyển cây ra trồng ngoài điều kiện tự nhiên Đây là giai đoạn chuyển cây in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng và thích nghi với điều kiện tự nhiên (Hazarika, 2003). Sự biến 8
  19. Đồ án tố t nghiê ̣p động của các yếu tố như: thời tiết, đất đai, sâu bệnh,… gây nhiều khó khăn trong việc đưa cây in vitro ra trồng ngoài tự nhiên. Như vậy, cả bốn giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro đều có vai trò quyết định đến khả năng ứng dụng thành công các quy trình nhân giống in vitro vào thực tiễn. Tuy nhiên, đối với cây hoa chuông do toàn thân được phủ một lớp lông tơ dày, thân lá chứa nhiều nước nên giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu gặp nhiều khó khăn (số lượng mẫu nhiễm và chết rất cao). Vì vậy, để tăng hiệu quả của giai đoạn này cần lựa chọn được hóa chất khử trùng, thời gian khử trùng và cơ quan sinh dưỡng đưa vào nuôi cấy. 1.1.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật 1.1.4.1. Sự lựa chọn mẫu cấy Theo Mantell và cộng sự (1985) mẫu cấy thích hợp nhất cho nuôi cấy mô phải có mô phân sinh hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng. Mô non như đỉnh chồi nách, chồi ngọn hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng một cây (Nguyễn Quang Thạch, 2001). Thời vụ và giai đoạn sinh trưởng của cây mẹ có ảnh hưởng hoàn toàn khác nhau tới khả năng tái sinh, phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Mamaril và Lopez, 1997). 1.1.4.2. Khử trùng mô thực vật Các mô cấy hầu hết là các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, lá, rễ, thân, củ,… tùy theo sự tiếp xúc của môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa ít hay nhiều vi khuẩn và nấm. Để chuyển mô thực vật từ môi trường tự nhiên vào môi trường nuôi cấy in vitro, các mô thực vật phải trải qua giai đoạn khử trùng để loại bỏ hết các nguồn tạp nhiễm (Bhojwani và Razdan, 1996) Khử trùng mẫu cấy là một việc làm khó vì mẫu sống không thể khử trùng bằng nhiệt độ cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó. Do đó mẫu cấy thực vật phải được khử trùng bằng dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường dùng là hypochlorite calcium, hypochlorite sodium, oxy già,… Các mẫu cấy sau khi chọn phải rửa phải ngâm rửa mẫu bằng xà phòng dưới dòng chảy rồi mới cho vào ngâm trong dung dịch khử trùng. Hiệu quả xử lý các chất phụ thuộc vào thời gian, nồng độ 9
  20. Đồ án tố t nghiê ̣p và khả năng xâm nhập vào các khe của tế bào và khả năng đẩy hết bọt khí trên bề mặt các mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng hoạt động của các chất khử trùng trước tiên người ta thường ngâm tế bào mô thực vật trong cồn 70 o trong 30 giây, sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn. Việc xử lý thành công nguồn gây nhiễm phần lớn phụ thuộc vào kỹ thuật xử lý trong nuôi cấy vô trùng. Các nguồn gây nhiễm phần lớn là bụi tóc, tay, quần áo vì vậy trong khi cấy phải rửa tay bằng xà phòng, lau cồn 70o tới khuỷa tay,… Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng của một số chất khử trùng Chất khử trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả Hypochorite calcium 9 – 10 5 – 30 Rất tốt Hypochorite sodium 0,5 - 5 5 – 50 Rất tốt Hydro peroxide 10 – 12 5 – 15 Tốt Nước bromie 1–2 2 – 10 Rất tốt HgCl2 0,1 – 1 2 – 10 Trung bình Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60 Khá tốt 1.1.4.3. Carbon và nguồn năng lượng Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, vì vậy cần phải bổ sung nguồn carbon vào môi trường nuôi cấy để cung cấp năng lượng (Nguyễn Quang Thạch, 2001). Hai loại đường thường được sử dụng là sucrose và glucose nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn. Nồng độ sucrose thay đổi từ 2 – 3 % hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống, tuổi mẫu cấy, giai đoạn sinh trưởng và yêu cầu thí nghiệm (Laneri; Franconi; Altavista, 1990). 10
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược