Xem mẫu
- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
XÁC ĐỊNH CỘNG ĐỒNG VI SINH BẰNG PHƯƠNG
PHÁP PCR VÀ DGGE TỪ RƠM TRƯỚC VÀ SAU KHI
XỬ LÝ TRỒNG NẤM RƠM
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH
CN. NGÔ ĐỨC DUY
Sinh viên thực hiện : HOÀNG NGỌC PHƯƠNG THẢO
MSSV: 0851110222 Lớp: 08DSH4
TP. Hồ Chí Minh, 2012
- Đồ án tốt nghiệp
LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Nghiên cứu về cộng đồng vi sinh vật trong các môi trường sống nhằm tìm
hiểu thêm đa dạng sinh học là một trong những mong muốn của các nhà khoa học
trên thế giới. Trước đây, để phân tích cộng đồng vi sinh vật trong các môi trường tự
nhiên, các nhà khoa học phải nuôi cấy và phân lập qua nhiều công đoạn khác nhau,
tốn thời gian và công sức nhưng lại không đem đến kết quả mong muốn.
Trong số tất cả các vi sinh vật trong tự nhiên, khoảng 99% không được phát
hiện bằng kỹ thuật nuôi cấy. Vì vậy, sinh học phân tử, phương pháp nhận biết độc
lập, khuếch đại và giải trình tự gen 16S rDNA, thường được sử dụng để có một dữ
liệu đầy đủ hơn về một cộng đồng sống trong một môi trường cụ thể, sinh học phân
tử ra đời đã khắc phục những khó khăn vẫn còn hạn chế của công nghệ sinh học,
nhằm góp phần xác định cộng đồng của vi sinh vật trong môi trường nhanh chóng
mà không phải qua nhiều giai đoạn nuôi cấy và phân lập, qua đó giúp các nhà khoa
học hiểu biết nhiều hơn về đa dạng sinh học, từ đó đưa vào các ứng dụng nhằm
phục vụ cho thực tiễn.
Áp dụng sinh học phân tử để nghiên cứu cộng đồng vi sinh có trong rơm rạ
ở giai đoạn trước và sau khi xử lý trong trồng nấm là rất cần thiết. Định danh hệ vi
sinh vật có trong mẫu rơm bằng việc ly trích và thu nhận DNA trực tiếp, so sánh sự
thay đổi hệ vi sinh trong mẫu rơm ở các giai đoạn tiền xử lý trước khi đưa vào
trồng nấm, từ đó có thể bổ sung hệ vi sinh phù hợp vào giai đoạn rơm tiền xử lý
nhằm rút ngắn thời gian ủ rơm trước khi đưa vào trồng nấm, đem lại hiệu quả kinh
tế cao hơn cho người dân. Đây cũng là bước khởi đầu quan trọng cho chúng ta có
thêm kiến thức về sự đa dạng sinh học trong nguồn cơ chất này, góp phần ứng dụng
cho các nghiên cứu tiếp theo.
1
- Đồ án tốt nghiệp
2. Tình hình nghiên cứu
Ly trích DNA của vi sinh vật trực tiếp từ rơm rạ để tìm hiểu cộng đồng vi
sinh vật đã được thực hiện tại một số phòng thí nghiệm về nông nghiệp các nước.
Tuy có những quy trình ly trích DNA khác nhau nhưng đều chung mục đích là thu
nhận DNA của nhóm vi khuẩn phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Ở Việt Nam, mặc dù rơm rạ là một nguồn năng lượng lớn nhưng vẫn chưa
được ứng dụng nhiều so với vai trò mà nó có thể mang lại. Rơm rạ nói riêng và từ
biomass nói chung không được sử dụng một cách hiệu quả. Phần lớn chúng được
đốt và bỏ trở lại ruộng sau khi thu hoạch, sử dụng làm chất đốt cho các hộ nhà
nông, làm cơ chất trồng nấm, làm thức ăn cho gia súc…gây lãng phí một nguồn
năng lượng tiềm năng. Việc ly trích và thu nhận trức tiếp DNA của nhóm vi khuẩn
từ rơm vẫn chưa được nghiên cứu và ứng dụng nhiều, chủ yếu là phân lập và ly
trích từ những chủng thuần vi sinh cho những mục đích nghiên cứu khác nhau.
3. Mục đích nghiên cứu
- Ly trích và thu nhận DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm trước và sau khi xử lý
trong trồng nấm.
- Xác định nhóm vi khuẩn trong rơm trước và sau khi xử lý trong trồng nấm
bằng phương pháp PCR và DGGE, giải mã trình tự đoạn gene vùng V3 của
đoạn 16S rDNA.
- Thành lập cây phân loài của nhóm vi khuẩn có trong rơm trước và sau xử lý.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh trực tiếp từ rơm xử lý trong trồng
nấm.
- Tiến hành tinh sạch và kiểm tra độ tinh sạch DNA của nhóm vi khuẩn.
- Sử dụng phương pháp khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của vi khuẩn. Điện di
và kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose.
- Xác định nhóm vi khuẩn trong rơm bằng phương pháp DGGE vùng V3 thuôc
đoạn gene 16S rDNA.
- Giải mã trình tự đoạn gene vùng V3 của đoạn 16S rDNA.
2
- Đồ án tốt nghiệp
- Hình thành cây phân loài của hệ vi khuẩn có trong rơm trước và sau khi xử lý.
5. Phương pháp nghiên cứu
- Hình thức thu mẫu: Thu mẫu rơm trước và sau khi xử lý trong trồng nấm.
- Ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh bằng phương pháp SDS.
- Tinh sạch DNA bằng bộ kit: GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit.
- Xác định nhóm vi khuẩn bằng phương pháp PCR khuếch đại đoạn gene 16S
rDNA dựa vào cặp mồi 27F 5’ – GA GTT TGA TCM TGG CTC AG – 3’ và
1492R 5’ – TAC GGG TAC CTT GTT CG ACT T – 3’, sau đó tinh sạch sản
phẩm PCR trước khi phân tích DGGE.
- Phương pháp DGGE được sử dụng để xác định hệ vi khuẩn trong mẫu:
+ PCR vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA của vi khuẩn được thực hiện với
cặp mồi chuyên biệt cho nhóm vi khuẩn là 517R 5’ – ATT AC GCG GCT
GCT CC – 3’ và 357F – GC 5’ – CGC CCG CGC GCG GGC GGG GGG
GGG GCA CGG GGG CCT ACG GGA GGC AGC AG – 3’.
+ Thực hiện phương pháp DGGE trên gel polyacrylamide.
+ PCR vùng V3 của đoạn gene 16S rDNA sau khi DGGE với cặp mồi 357F 5’
– CCT ACG GGA GGC AGC AG – 3’ và 517R 5’ – ATT ACC GCG GCT
GCT GG – 3’. Tinh sạch và thu nhận DNA từ gel polyacrylamide bằng bộ
Kit QIAEX II trước khi bước vào giải trình tự loài.
+ Giải trình tự đoạn gene vùng V3 thuộc đoạn 16S rDNA của vi khuẩn.
+ Kết quả giải trình tự được so chuỗi bằng chương trình BLAST trên ngân
hàng dữ liệu gene của NCBI.
6. Kết quả nghiên cứu
- Ly trích và thu nhận DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm trước và sau xử lý trong
trồng nấm rơm.
- Xác định nhóm vi khuẩn cần nghiên cứu dựa vào sự khuếch đại đoạn gene
16S rDNA bằng phản ứng PCR.
- Xác định nhóm vi khuẩn trong mẫu bằng phương pháp DGGE của vùng V3
thuộc đoạn gene 16S rDNA.
3
- Đồ án tốt nghiệp
- Giải mã được trình tự đoạn gene vùng V3 thuộc đoạn 16S rDNA của vi khuẩn.
- Hình thành cây phân loài của cộng đồng vi khuẩn có trong rơm trước và sau
xử lý
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:
- Chương 1: Tổng quan
- Chương 2: Vật liệu và phương pháp
- Chương 3: Kết quả và thảo luận
- Chương 4: Kết luận và kiến nghị
4
- Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về rơm rạ
1.1.1 Thành phần cấu tạo của rơm rạ
Cây lúa luôn giữ vị trí trung tâm trong nông nghiệp và kinh tế Việt Nam.
Hình ảnh đất Việt thường được mô tả như là một chiếc đòn gánh khổng lồ với hai
đầu là hai vựa thóc lớn là Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) và Đồng Bằng
Sông Hồng (ĐBSH). Khoảng 80% trong số 11 triệu hộ nông dân tham gia sản xuất
lúa gạo, chủ yếu dựa vào hình thức canh tác thủ công truyền thống. [8]
Việc sản xuất lúa gạo đã tạo ra một lượng lớn phế phẩm từ cây lúa bao gồm
rơm và trấu. Rơm và trấu là hai trong số nhiều nguồn biomass phổ biến và có tiềm
năng ở Việt Nam.
Rơm rạ là thành phần hỗn hợp của nhiều hợp chất hóa học khác nhau tạo
nên trong một thành phần cấu trúc cao phân tử gồm cacbonhydrate, một lượng nhỏ
protein và khoáng. Nghiên cứu tế bào qua kính hiển vi có thể cho thấy mô hình cấu
tạo phức tạp của rơm.
Các phần phân đoạn chính của thực vật nói chung và rơm rạ nói riêng gồm:
các đốt (mắt), lóng (thân) và lá. Tỷ lệ cấu trúc phân đoạn của các loài tương đối
khác nhau do nhiều yếu tố: Loài, vụ mùa, đất, điều kiện khí hậu…Như một hệ quả,
khi thành phần hóa học các phần phân đoạn của thực vật khác nhau thì cấu tạo của
mỗi loài cũng khác nhau. [17]
Thành phần hóa học của rơm rạ tính theo khối lượng khô gồm cellulose 60
%, lignin 14%, đạm hữu cơ (protein) 3,4%, chất béo (lipid) 1,9%. Nếu tính theo
nguyên tố thì cacbon (C) chiếm 44%, hydro (H) 5%, oxygen (O) 49%, N khoảng
0,92% , một lượng rất nhỏ photpho (P), lưu huỳnh (S) và kali (K).
5
- Đồ án tốt nghiệp
Bảng 1.1: Thành phần cấu tạo hóa học ở các phần phân đoạn của rơm ở 2 dạng lúa:
lúa ngắn ngày và lúa dài ngày (Antongiovanni và cộng sự, 1991). [17]
Lúa dài ngày Lúa ngắn ngày
Thành phần
Lóng Đốt (mắt) Lá Lóng Đốt (mắt) Lá
cấu tạo
g/kg DM
Nitơ tổng 34 70 38 26 39 35
Thành tế bào 782 737 787 766 773 800
Tro 100 162 211 184 182 193
Silica 28 26 103 29 55 67
Cellulose 411 327 323 433 332 364
Hemicellulose 245 286 256 242 331 283
Rơm rạ có hai đặc tính cơ bản là: Hàm lượng N thấp (< 1%), nghèo
khoáng và vitamin, chứa nhiều xơ thô nên tỷ lệ tiêu hóa thấp. Việc tiêu hóa xơ nhờ
hoạt động lên men của vi sinh vật trong đường tiêu hóa. Chất xơ trong rơm chủ yếu
là cellulose, hemicelluloses và lignin. Giữa chúng có các liên kết hóa học tạo nên
sự bền vững của màng tế bào thực vật. Cellulose gồm nhiều chuỗi thẳng ghép nhau
thành bó dài nhờ mạch nối hydrogen tạo thành các micell bền vững. Cellulose có
cấu tạo dạng sợi, có cấu trúc phân tử là một polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một
disaccharide gọi là cellobiose, có cấu trúc từ hai phân tử D – glucose. Cấu trúc bậc
2 và bậc 3 rất phức tạp thành cấu trúc dạng lớp gắn với nhau bằng lực liên kết
hydro. [2]
Lực liên kết hydro trùng hợp nhiều lần nên rất bền vững, một phân tử
cellulose gồm từ 7000 – 14000 đơn vị glucose tạo thành. Hemicellulose là những
heteropolysaccharide cùng với cellulose có ở màng tế bào thực vật. Hemicellulose
không hòa tan được trong nước nhưng hòa tan được trong dung dịch kiềm và bị
6
- Đồ án tốt nghiệp
thủy phân bởi acid dễ dàng hơn so với cellulose. Khi bị thủy phân, từ
hemicelluloses sẽ tạo ra glucose, fructose, mantose, galactose, cuabinose và xylose.
Thành phần thứ ba đáng chú ý trong xơ là lignin. Lignin luôn đi kèm với cellulose
và hemicellulose trong thành phần tế bào, không hòa tan trong nước, trong các
dung môi hữu cơ bình thường và rất bền vững bởi enzyme của hệ sinh vật dạ cỏ.
Nhưng dưới tác dụng của kiềm thì lignin một phần bị phân giải và chuyển vào dung
dịch. Trong dạ cỏ loài nhai lại có những vi khuẩn đặc biệt chứa enzyme cellulase
phân giải được cellulose. Cellulose và hemicellulose là những hợp chất có thể tiêu
hóa được. Nhưng phần lớn cellulose tham gia cấu tạo trong của vách tế bào rơm
nên enzyme của hệ vi sinh vật không dễ dàng tác động được. Lớp ngoài thành tế
bào được tạo thành chủ yếu từ các phức chất lignohemicellulose mà các enzyme vi
sinh dạ cỏ phân giải vô cùng chậm. Điều đó cản trở những lớp trong giàu cellulose
trước tác động của enzyme vi sinh vật, cũng như cản trở sự phân giải chất chứa tế
bào. Để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa của rơm rạ và các chất xơ khác, các nhà nghiên cứu
đã tiến hành xử lý rơm bằng nhiều phương pháp như: lý học, hóa học, vi sinh vật
học... [1]
1.1.2 Cộng đồng vi sinh vật phân giải cellulose
Rơm rạ có từ 400 - 430 g xơ trong 1 kg chất khô khó phân hủy. Về nguyên
tắc rơm rạ có thể được hệ vi sinh dạ cỏ phân giải, tuy nhiên do bị lignin hóa cao
nên khả năng tiêu hóa thực tế bị hạn chế. Sự liên kết chặt chẽ giữa lignin với
cacbonhydrate tạo thành các phức hợp lingo – hemicellulose/cellulose ở vách tế
bào thực vật. Liên kết này có lợi cho thực vật nhưng lại bất lợi cho quá trình lên
men của vi sinh vật, làm cản trở tác động của enzyme vi sinh vật. Các biện pháp xử
lý nhằm làm thay đổi một số tính chất hóa lý của rơm để làm tăng khả năng phân
giải của vi sinh vật với thành phần xơ.
Cellulose là thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật. Hàng ngày, hàng
giờ, một lượng lớn cellulose được tích lũy lại trong đất do các sản phẩm tổng hợp
của thực vật thải ra, cây cối chết đi, cành lá rụng xuống. Một phần không nhỏ do
con người thải ra dưới dạng rác thải, giấy vụn, phôi bào, mùn cưa… Nếu không có
7
- Đồ án tốt nghiệp
quá trình phân giải của sinh vật thì lượng chất hữu cơ khổng lồ này sẽ tràn ngập trái
đất.
Cellulose rất khó phân giải, bởi vậy vi sinh vật phân hủy cellulose phải có
một hệ enzyme gọi là cellulase bao gồm 4 enzyme khác nhau. Enzyme C1 có tác
dụng cắt đứt liên kết hydro, biến dạng cellulose tự nhiên có cấu hình không gian
thành dạng cellulose vô định hình, enzyme này gọi là cellobiohydrolase.
Enzyme thứ hai là endoglucanase có khả năng cắt đứt các liên kết β-1, 4 bên
trong phân tử tạo thành những chuỗi dài. Enzyme thứ 3 là exo – gluconase tiến
hành phân giải các chuỗi trên thành Disaccharide gọi là Cellobiose. Cả hai loại
enzyme endo và exo – gluconase được gọi là Cx. Enzyme thứ 4 là β – glucosidase
tiến hành thủy phân cellobiose thành glucose. [2]
C1 CX Β - glucosidase
Cellulose tự nhiên cellulose vô định hình cellobiose glucose
Trong thiên nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose
nhờ có hệ cellulase ngoại bào.
Cellulase được tổng hợp từ nhiều chủng vi sinh khác nhau:
+ Cellulase từ vi khuẩn: Bacillus megaterium, Pseudomonas fluorenscens,
Acetobacter Xylium, vi khuẩn dạ cỏ, Clostridium…
+ Cellulase từ xạ khuẩn: Các loài Actinomyces, Streptomyces…
+ Cellulase từ nấm: Aspergylus niger, Aspergylus Oryzae, Tricoderma,
Mucor pusillus. [22]
Trong đó vi nấm là nhóm có khả năng phân giải mạnh vì nó tiết ra môi
trường một lượng lớn enzyme đầy đủ các thành phần. Các nấm mốc có hoạt tính
phân giải cellulose đáng chú ý là Tricoderma. Hầu hết các loài thuộc chi
Tricoderma sống hoại sinh trong đất và đều có khả năng phân hủy cellulose. Chúng
tiến hành phân hủy các tàn dư của thực vật để lại trong đất, góp phần chuyển hóa
một lượng chất hữu cơ khổng lồ. Tricoderma còn sống trên tre, nứa, gỗ tạo thành
lớp mốc màu xanh phá hủy các vật liệu trên. Trong nhóm vi nấm, ngoài
8
- Đồ án tốt nghiệp
Tricoderma còn có nhiều giống khác có khả năng phân giải cellulose như
Aspergillus, Fusarium, Mucor…
Nhiều loài vi khuẩn cũng có khả năng phân hủy cellulose. Thường ở trong
đất có ít loài vi khuẩn có khả năng tiết ra đầy đủ 4 loại enzyme, trong hệ enzyme
cellulase. Nhóm này tiết ra một loại enzyme trong hệ enzyme cellulase. Nhóm này
tiết ra một loại enzyme này, nhóm khác tiết ra loại khác, chúng phối hợp với nhau
để phân giải cơ chất trong mối quan hệ hỗ sinh.
Nhóm vi khuẩn hiếu khí gồm Pseudomonas, Cellulomonase,
Achromobacter.
Nhóm vi khuẩn kỵ khí bao gồm Clostridium và đặc biệt là nhóm vi khuẩn
sống trong dạ cỏ của động vật nhai lại. Chính nhờ nhóm vi khuẩn này mà trâu bò có
thể sử dụng cellulose có trong cỏ, rơm rạ làm thức ăn. Đó là những cầu khuẩn
thuộc chi Rumonococcus có khả năng phân hủy cellulose thành đường và các acid
hữu cơ.
Ngoài vi nấm và vi khuẩn, xạ khuẩn và niêm vi khuẩn cũng có khả năng
phân hủy cellulose. Người ta thường sử dụng xạ khuẩn, đặc biệt là chi
Streptomyces trong việc phân hủy rác thải sinh hoạt. Những xạ khuẩn này thường
thuộc nhóm ưa nóng, sinh trưởng, phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 45 – 50 0C rất thích
hợp với quá trình ủ rác thải. [2]
Nhìn chung, hệ vi sinh vật trong rơm rạ rất đa dạng về cả mặt phân loại và
chức năng. Tổng cộng có 259 chủng vi khuẩn và 45 loài nấm đã được phân lập với
các đặc tính chức năng khác nhau. Sự đa dạng cộng đồng vi sinh vật trong rơm rạ
được đánh giá bằng việc giải trình tự 16S rDNA đã cho kết luận rằng có 17 họ vi
khuẩn và 9 họ nấm có trong rơm. Bacillaceace, Burkholderiaceae,
Enterobacteraceae và Pseudomonadaceae là các họ phổ biến nhất. Hoạt động phân
giải cellulose được phát hiện ở Bacilliaceae, Enterobacteriaceae, Flexibateraceae,
Microbacteriaceae và Paenibacillaceae. Hoạt tính phân giải chitin phổ biến ở các
loài Flexibacterceae, Burkholderiaceae, Enterobacteriaceae, Oxalobacteriaceae,
Staphylococcaeae và Xanthomonadaceae. Các tác nhân gây bệnh ở lúa tiềm năng là
9
- Đồ án tốt nghiệp
họ Nectriaceae và Trichocomaceae được phát hiện từ việc phân lập rơm. Các loài
nấm và vi khuẩn đóng góp đáng kể vào sự phân hủy rơm rạ. [8]
Hệ vi sinh vật phân giải cellulose có thể lên men kỵ khí hoặc hiếu khí, bình
nhiệt hoặc ái nhiệt, bao gồm nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn được tìm thấy nhiều trong
đất, nước, đường tiêu hóa của một số động vật…nơi cung cấp lượng cellulose dồi
dào để vi sinh vật phân giải và phát triển.
1.2 Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số
1.2.1 Nguyên tắc và yêu cầu
Ly trích và thu nhận DNA tổng số là nhu cầu cần thiết bởi các thực nghiệm
của công nghệ gene đều tiến hành với DNA (hay RNA).
DNA cần phải đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc để có
thể thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo. Có rất nhiều phương pháp ly
trích và thu nhận DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn
các phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số cho phù hợp.
DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó trong thao tác cần tránh mọi tác
nhân cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt hay gãy phân tử này. [20]
1.2.2 Một số phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số
Mọi nghiên cứu và ứng dụng trong sinh học phân tử đều phải bắt nguồn từ
DNA. Do đó cần phải tách chiết được một lượng DNA đủ lớn và tinh sạch. Để ức
chế hoạt động của enzyme nội bào thì các phân tử DNA phải được tách chiết trong
điều kiện nhiệt độ thấp. Một số phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số:
1.2.2.1 Phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh vật trong môi
trường tự nhiên
Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay
đổi theo từng môi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn
hoặc là những tập đoàn vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi
sinh vật được đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có
mặt của những bộ gene hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá. [15]
10
- Đồ án tốt nghiệp
Sự ra đời kỹ thuật dựa trên phân tử acid nucleic đã dẫn tới sự thay đổi lớn
trong việc phát hiện vi sinh vật trong môi trường tự nhiên (Liesack và cộng sự,
1992; Ward và cộng sự, 1990). Với những kỹ thuật này đã phát hiện một số thay
đổi lớn về việc tìm hiểu cấu trúc và sự vận động của các vi sinh vật cộng đồng
trong môi trường tự nhiên (Lionet và cộng sự, 2003). Mặc dù các phương pháp
trong kỹ thuật dựa trên phân tử acid nucleic này đã phá vỡ những hạn chế trong
việc chọn lọc và tính chất đặc trưng trong việc ly trích DNA (Head và cộng sự,
1998). Sự phục hồi tính đa dạng của vi khuẩn chịu ảnh hưởng của việc ly trích
DNA, độ tinh khiết của DNA từ môi trường có đạt yêu cầu hay không? Sự hiện
diện của các thành phần khác trong môi trường sẽ làm ảnh hưởng và cản trở sự phát
hiện DNA thể hiện qua kết quả ly trích và tinh sạch. Vì vậy việc lựa chọn các
phương pháp ly trích và tinh sạch là rất quan trọng cho DNA của vi sinh vật từ môi
trường tự nhiên. [10]
Ly trích DNA thường bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như không ly trích hoàn
toàn tế bào vi khuẩn hoặc DNA bị hư hỏng (Miller và cộng sự, 1999). Rõ ràng việc
áp dụng một quy trình ly trích DNA phù hợp với các mẫu cụ thể là rất cần thiết cho
việc đánh giá đúng đa dạng vi sinh vật. Phương pháp ly trích DNA cần phải đơn
giản, nhanh chóng và hiệu quả. Chất lượng DNA là rất quan trọng ảnh hưởng đến
hiệu quả khuếch đại DNA về sau. Do đó ly trích DNA được coi như một bước phân
tích độc lập trong phân tích đa dạng vi sinh vật (Abriouel và cộng sự, 2006; Cankar
và cộng sự, 2006). Việc ly trích thường kết hợp với các chất tẩy, các tác nhân vật
lý, các dung môi và enzyme để thu được nucleic acid (Sokollek và cộng sự, 1998;
Nanda và cộng sự, 2001; Gonzaslez và cộng sự, 2004; Gullo và cộng sự, 2006;
Haruta và cộng sự, 2006; Ndoye và cộng sự, 2006). [6]
Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên
thường được sử dụng:
Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): Đây được xem là phương pháp
thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật với
hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo. J Zhou và cộng sự (1996)
11
- Đồ án tốt nghiệp
đã sử dụng phương pháp ly trích với nồng độ muối cao (1,5 M NaCl) và ủ mẫu
trong 2 – 3 giờ trong sự hiện diện của Sodium dodecyl sulfate (SDS),
hexadecyltrimethylammonium bromide, và proteinase K. [9]
Phương pháp Cetyl – Trimetyl – Ammoniumbromide (CTAB) ly trích DNA:
Đây là phương pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB
là một dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được
dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic. Ly trích DNA của
vi khuẩn sử dụng phương pháp CTAB được mô tả bởi Ausubel và cộng sự
(1992). Ly trích DNA cần phải có cả hai yếu tố là hiệu suất và độ tinh khiết.
Phương pháp ly trích DNA cho hiệu suất cao thường chứa các tạp chất ảnh
hưởng đến quá trình thí nghiệm về sau, còn phương pháp cho độ tinh khiết cao
lại tỷ lệ nghịch với hiệu suất (Zimmermann và cộng sự, 1998). Trong nghiên
cứu của Jara C. (2008), phương pháp ly trích tốt nhất là phương pháp CTAB.
[6]
Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương đối hiệu
quả. Nó có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia nhiệt đến 650 C.
Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh chóng và mang lại kết quả khá
cao. Phương pháp này được Zhu và cộng sự (1993) sử dụng để ly trích DNA của
cả thực vật, nấm và vi khuẩn. [21]
Phương pháp đóng băng và tan băng: Đây là phương pháp do Ellingsue và cộng
sự (2002). Phương pháp này sử dụng kỹ thuật đóng băng và tan băng ở - 650C
trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ vách tế bào, giải phóng các thành phần
bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly trích DNA tổng số vi sinh
vật từ môi trường tự nhiên. [9]
Một sự so sánh và kết hợp về các phương pháp ly trích DNA trực tiếp từ
cộng đồng vi sinh vật được Juria R. (2004) báo cáo. Lựa chọn và ứng dụng một quy
trình vào thử nghiệm ly trích DNA rất quan trọng. Có hai hướng chính: (1) là ly
trích từ tế bào vi sinh đã được phân lập và (2) là ly trích trực tiếp từ mẫu ban đầu
mà không qua phân lập chủng vi sinh (Saano và cộng sự, 1995). Trong cả hai
12
- Đồ án tốt nghiệp
hướng trên, một số phương pháp khác nhau được sử dụng trong ly trích DNA gồm
các chu kỳ đóng băng và tan băng, đun sôi, dùng nitơ lỏng, nghiền nhỏ, thẩm thấu,
SDS, Lysozyme và một số cách khác (Sorensen và cộng sự, 2002). Ở đây, sử dụng
phương pháp ly trích DNA trực tiếp từ đất theo Ogram và cộng sự (1987) và có sửa
đổi để phù hợp hơn. [11]
1.2.2.2 Phương pháp ly trích và thu nhận DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm rạ
Để thu nhận DNA vi khuẩn đảm bảo về độ tinh sạch thì cần loại bỏ hết
những thành phần tạp nhiễm, trong đó quan trọng nhất là protein. Sự ly trích DNA
dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau trong hai pha
không hòa tan (phenol, chloroform/nước). Mục đích cuối cùng vẫn là thu nhận
được DNA ở trạng thái còn nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân
cơ học hay hóa học. Việc thu nhận DNA cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt
độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào. Sau công đoạn tách chiết,
DNA sẽ được tinh sạch. Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận DNA dưới
dạng cặn tủa dể bảo quản và khi cần có thể hòa tan trong nước khử ion hoặc trong
dung dịch TE theo nồng độ mong muốn.
Một số phương pháp ly trích DNA vi khuẩn từ rơm rạ:
Rơm rạ là thành phần chính trong sản xuất methanol, một khí gây hiệu ứng
nhà kính, rơm là nguồn phế phẩm của ngành nông nghiệp. Cộng đồng vi sinh phân
giải rơm rạ trong điều kiện hiếu khí đang được các nhà khoa học nghiên cứu bằng
phương pháp sinh học phân tử. Việc ủ rơm và phân tích ở các giai đoạn khác nhau
sẽ cho ra các kết quả về cộng đồng vi sinh khác nhau qua PCR và điện di mẫu
(Sabine Weber và cộng sự, 2011). [19]
Ngoài ra, cộng đồng vi sinh cũng có sự đa dạng khác nhau trên các nguồn
rơm rạ ở các pH khác nhau. Cộng đồng vi sinh trong rơm dưới những điều kiện pH
khác nhau đã được kiểm tra bằng cách sử dụng phương pháp in – vitro với một số
sửa đổi của Sung và cộng sự (2006). DNA vi khuẩn được ly trích từ rơm theo
phương pháp được mô tả bởi Purdy và cộng sự (1996). [12]
13
- Đồ án tốt nghiệp
Các mẫu lá và thân rơm sử dụng 0,5 g trọng lượng tươi để phân tích DNA
tổng số vi khuẩn. Việc ly trích được thực hiện theo phương pháp tan băng theo
Zhou và cộng sự (1996), Tun và cộng sự (2002). [5]
Một nghiên cứu khác về ly trích DNA của vi sinh vật phân giải cellulose
bằng phương pháp Benzyl Chloride (Zhu và cộng sự, 1993), sau đó để loại bỏ
thành phần tạp có trong mẫu chiết xuất bằng cách sử dụng Geneclean spin kit
(BIO101, Carlsbad, Calif.) ở giai đoạn tinh sạch. [18]
1.2.2.3 Phương pháp ly trích và thu nhận DNA vi khuẩn từ dịch khuẩn nuôi cấy
Để ly trích DNA vi khuẩn từ dịch khuẩn nuôi cấy, Ghazanfar và cộng sự
(2010) đã sử dụng quy trình của Roger S. và cộng sự (1994) quy trình cải tiến
CTAB.
Sau khi ly trích, DNA tổng số được điện di trên gel agarose 1% ở điện thế
100 Volts trong 5 phút và đo Nanodrop để xác định nồng độ và độ tinh sạch.
Phương pháp này sử dụng CTAB nóng, đây là một dung môi có khả năng hòa tan
cao acid nucleic. Ở nhiệt độ cao, CTAB còn có tác dụng làm rách thêm màng tế
bào và màng nhân để giải phóng tối đa lượng acid nucleic ra dung dịch làm biến
tính một số protein, đặc biệt là enzyme thủy phân acid nucleic. Giúp cho việc ly
trích DNA đạt hiệu quả tốt nhất. [15]
1.3 Phương pháp PCR và ứng dụng
1.3.1 Phương pháp PCR
Phương pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985, là
một cuộc cách mạng trong sinh học phân tử.
PCR là phương pháp dùng enzyme khuếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo
luật số mũ. Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzyme ADN chịu nhiệt, hai
mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP). Mỗi một
chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước: Bước 1 là biến tính ADN, có tác dụng
tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép. Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn
của khuôn. Bước 3 là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều 5’-3’ với quá trình trùng hợp
gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ
14
- Đồ án tốt nghiệp
sung. Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp
theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản
sợi khuôn trong vài giờ.
Mồi cho phản ứng là các đoạn DNA có kích thước 20 – 30 nucleotice được
thiết kế theo trình tự của đoạn gene cần khuếch đại dựa theo dữ liệu có sẵn. Mỗi
cặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình trong toàn bộ phản ứng, tức là chúng
phải bám đặc hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ như vậy là do nếu
chúng không bám vào vị trí đặc hiệu thì không thể khuếch đại được đoạn gene đích.
Với các gene như rDNA thì khi cặp mồi được thiết kế thì chúng có thể nhân được
gene từ nhiều đối tượng. Ngược lại, trong nhiều trường hợp dùng mồi không đặc
hiệu thì có thể nhân được các sản phẩm PCR không đặc hiệu. Tuy nhiên, cả hai kết
quả trên đều được dùng cho xác định loại vi sinh vật.
Thí nghiệm phản ứng PCR lần đầu tiên dùng mảnh Klenow của enzym DNA
polymerase I từ E.coli. Tuy nhiên, enzyme này bị biến tính tại 94 oC và như vậy
cần phải bổ sung enzyme mới sau mỗi chu kỳ phản ứng. Đến nay quá trình này đã
được cải thiện do dùng enzyme Taq DNA polymerase (Taq = Thermus
aquaticus) chịu nhiệt. Enzyme này được tách ra từ vi khuẩn sống ở suối nước nóng.
Tốc độ xúc tác cho phản ứng của enzyme này rất nhanh, có thể đạt khoảng 8000
bp/phút tại 755 oC. Hoạt tính enzyme giảm một nửa khi xử lý tại 92,5 oC trong 230
phút hoặc 40 phút tại 95 oC. Như vậy khi dùng enzyme này thì không cần bổ sung
enzyme mới sau mỗi chu kỳ phản ứng.
Phản ứng PCR sử dụng enzyme chịu nhiệt tạo ra nhiều phiên bản theo hàm
số mũ. Một sợi DNA ban đầu sau vài giờ có thể nhân lên 1011 phiên bản DNA. Sau
khi thực hiện phản ứng PCR cần tiến hành một số kỹ thuật để xác định sản phẩm
như điện di và xác định kích thước sản phẩm PCR. Phương pháp PCR nhanh chóng
được chú ý và trở nên phổ biến trong nghiên cứu phát hiện vi khuẩn hay virus ở
nồng độ thấp trong các mẫu môi trường và bệnh phẩm. Một số ứng dụng kỹ thuật
PCR phát hiện các đối tượng vi sinh vật khác nhau được trình bày trong tạp chí
15
- Đồ án tốt nghiệp
chuyên ngành như Journal of Clinical Microbiology, Applied Environmental
Microbiology. [23]
1.3.2 Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình xác định loài vi sinh vật
Kỹ thuật PCR đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu xác định DNA
nhiều đối tượng vi sinh vật. Nguồn DNA đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi tiến
hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy không thể thực
hiện được với nhiều loài vi sinh vật hoặc virus hoặc trong trường hợp khác là cần
thời gian nuôi cấy vi sinh vật để có đủ DNA cho việc lai hoặc xác định loài. PCR ra
đời đã khắc phục được những khó khăn này.
Từ khi có sự ra đời của kỹ thuật PCR thì kỹ thuật giải trình tự cũng có
những tiến bộ vượt bậc. Chỉ cần dùng PCR là có thể nhân bản đoạn gen muốn giải
trình tự thành hàng tỷ bản sao hoàn toàn giống hệt nhau và sản phẩm khuếch đại
này có thể đưa vào giải trình tự trực tiếp mà không cần phải chèn một plasmid giải
trình tự nữa. Sự phát minh ra kỹ thuật nhân bản DNA trong ống nghiệm bằng PCR
cũng giúp cho việc cải tiến phản ứng giải trình tự kém hiệu quả trước đây trở nên
hiệu quả hơn nhờ áp dụng enzyme polymerase giải trình tự bền với nhiệt độ để
phản ứng giải trình tự được thực hiện qua các chu kỳ giống hệt PCR, mà ngày nay
chúng ta gọi là phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự. Với phản ứng chu kỳ nhiệt giải
trình tự thì hiệu quả phản ứng tốt hơn rất nhiều, đồng thời tối ưu hóa các thành
phần của phản ứng cũng dễ dàng hơn rất nhiều. Có thể nói chính sự ra đời và hoàn
thiện kỹ thuật PCR đã giúp tăng tốc giải trình tự không những trong vấn đề hoàn
thiện nó mà cả trong vấn đề phạm vi áp dụng. [25]
Tiến hành PCR khuếch đại những đoạn gene đặc trưng của các loài vi sinh
vật nghiên cứu dựa trên những cặp mồi đặc trưng của từng loài vi sinh vật. Mỗi vi
sinh vật đều có những cặp mồi chuyên biệt để có thể dựa vào đó chúng ta có thể dễ
dàng xác định được chúng.
Sử dụng phương pháp PCR để xác định giống Lactobacillus được thực hiện
thông qua việc sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho giống Lactobacillus gồm: Lac 1 và
Lac 2, trình tự các cặp mồi này như sau:
16
- Đồ án tốt nghiệp
Lac 1 5’ – AGC AGT AGG GAA TCT TCC A – 3’
Lac 2 5’ – ATT CCA CCG CTA CAC ATG – 3’
Phản ứng khuếch đại đoạn gene 16S rDNA được thực hiện với hai mồi
chuyên biệt cho giống Lactobacillus gồm Lac 3 và Lac 4, trình tự các mồi như sau:
Lac 3 5’ – GGA AAC AGA TGC TAA TAC CG – 3’
Lac 4 5’ – CAC CGC TAC ACA TGG AG – 3’
Sử dụng phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene D1/D2 26S rDNA và đoạn gene
ITS 5,8S rDNA đặc trưng cho nấm men. [4]
Các cặp mồi được sử dụng khuếch đại đoạn gene D1/D2 26S rDNA, ITS
5,8S rDNA đặc trưng cho nấm men.
Trình tự cặp mồi NL và ITS:
Cặp NL: NL4 5’ – GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG – 3’
NL4 5’ – GGT CCG TGT TTC AAG ACG G – 3’
Cặp ITS: ITS1 5’ – TCC GTA GGT GAA CCT GCG G – 3’
ITS4 5’ – TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC – 3’
Bảng 1.2: Một số vi sinh vật được nghiên cứu bằng phương pháp PCR. [23]
Vi sinh vật Tài liệu
Clostridium difficile Gumerlock et al (1991)
Escherichia coli Jackson (1992)
Helicobacter pylori Claton et al (1992)
Litsteria monocytogenees Niederhauser et al (1992)
Mycobacterium tuberculosis Altamirano et al (1992)
Salmonella spp Rahn et al (1992)
Staphylococcus spp Murakami et al (1991)
Yersinia Nakajima et al (1992)
17
- Đồ án tốt nghiệp
1.3.3 Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình xác định loài vi khuẩn
Phương pháp PCR là một phương pháp được ứng dụng rộng rãi trong việc
xác định loài vi sinh vật. Đối với các loài vi khuẩn cũng vậy, người ta sử dụng
phương pháp PCR để khuếch đại những đoạn gene của vi khuẩn. Kết quả thu được
từ những phản ứng PCR là thu nhận những đoạn gene với kích thước như mong
muốn.
Mỗi loài vi khuẩn đều có những cặp mồi chuyên biệt, dựa trên những cặp
mồi chuyên biệt này kết hợp với những yếu tố cần thiết trong phản ứng PCR thì
việc xác định loài vi khuẩn trở nên đơn giản hơn. Ví dụ mồi cho vi khuẩn
Haemophilus influenza (gene bexA):
Hib 1: GCG AAA GTG ACC TCT TAT CTC TC
Hib 2: GCT TAC GCT TCT ATC TCG GTG AA
Các vi khuẩn khó nuôi cấy thường có mặt ngoài môi trường tự nhiên có thể
xác định trực tiếp bằng PCR, ví dụ như các Legionella, Samonella, Shigella và
Vibrio cholera. Chỉ cần từ 10 – 1000 tế bào vi khuẩn tùy theo kỹ thuật là đủ để thực
hiện phản ứng PCR. Nhờ khuếch đại những đoạn gene 16S rDNA đặc trưng của vi
khuẩn với những cặp mồi chuyên biệt, người ta có thể so sánh mối quan hệ gần hay
xa giữa các vi khuẩn, góp phần phân loại vi khuẩn chi tiết và chính xác hơn. [24]
1.4 Ứng dụng DGGE trong xác định cộng đồng vi sinh
1.4.1. Phương pháp DGGE
Điện di gel gradient biến tính (DGGE) là một phương pháp hữu hiệu để xác
định đột biến và đa dạng vi sinh vật. DGGE có hai yếu tố cơ bản như sau: (1) Sự
biến tính DNA bằng nhiệt độ đặc biệt thay đối với trình tự nucleotide và sự cặp đôi;
(2) Sự biến tính từng phần của sợi kép DNA làm chậm lại quá trình di chuyển của
nó trong gel polyacrylamide. [3]
DGGE là một kỹ thuật được sử dụng trong sinh học phân tử và trở thành
một phương pháp chính yếu để xác định đặc tính về mật độ kết cấu và động học.
Đây là một phương pháp mới, có thể cung cấp nhanh chóng đặc tính, xác định sự
đa dạng và thành phần cấu trúc hệ vi sinh vật. DGGE còn ứng dụng trong lĩnh vực
18
- Đồ án tốt nghiệp
y học để phát hiện các đột biến, gồm các đoạn đơn nucleotide đa hình (SNPs). Khi
phân tích DGGE, cần có một số lượng ý nghĩa DNA để phát hiện, phản ứng chuỗi
PCR được sử dụng để khuếch đại đoạn gen trước. Tất cả các vấn đề về đặc tính
mẫu, ly trích DNA (hoặc RNA), sao chép ngược (nếu dung dịch chiết RNA), thiết
kế mồi PCR, điều kiện cho phản ứng PCR, tinh sạch PCR trước khi sử dụng kỹ
thuật DGGE.
Phương pháp DGGE là một trong những phương pháp có độ nhạy cao, có
thể nhanh chóng cung cấp đầy đủ những đặc tính đặc trưng của sự đa dạng về thành
phần của cộng đồng vi sinh. Đồng thời sự thay đổi của cộng đồng vi sinh vật cũng
có thể dễ dàng được chứng minh.
Phân tích DGGE được sử dụng cho việc phân tách các mảnh DNA sợi đôi
giống hệt nhau về chiều dài, nhưng khác nhau về trình tự. Trong thực tế, điều này
đề cập đến việc phân tách các đoạn gene mong muốn bằng phương pháp PCR. Kỹ
thuật khai thác (trong số những yếu tố khác) sự khác biệt trong kết nối ổn định G -
C (3 liên kết hydro trong mỗi kết nối) trái ngược với kết nối A – T (2 liên kết
hydro). Một hỗn hợp gồm các đoạn DNA khác nhau của trình tự khác nhau được
điện di trong một môi trường polyacrylamide các sợi đôi đoạn DNA di chuyển tốt
hơn, trong khi các phân tử DNA biến tính lại trở nên ít hiệu quả hơn hoặc không di
chuyển trong gel. Nói chung, các đoạn DNA G – C sẽ ổn định hơn và vẫn còn sợi
đôi cho đến khi đạt đến nồng độ cao hơn nồng độ ban đầu. Như vậy, các đoạn DNA
của chuỗi khác nhau có thể được tách ra trong gel polyacrylamide. [20]
1.4.2. Các ứng dụng của DGGE trong xác định loài vi sinh vật
Việc sử dụng kỹ thuật PCR và DGGE đã giúp cho các nhà khoa học tìm hiểu
được sự đa dạng sinh học của vi sinh vật trong quần thề sinh vật (Muyzer và cộng
sự, 1996). DGGE được sử dụng cho việc nghiên cứu đa dạng và sinh thái vi sinh
vật trong các mẫu nguyên thủy hay còn gọi là mẫu môi trường (Heure và cộng sự,
1997). Thêm vào đó phương pháp này còn cho phép phân tích cả những đoạn gen
có kích thước lớn như 16S rRNA thường được nhân bởi cặp mồi thông dụng. Trên
19
nguon tai.lieu . vn
