- Trang Chủ
- Công nghệ - Môi trường
- Đồ án tốt nghiệp: Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Trichoderma koningii và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel
Xem mẫu
- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG SINH TỔNG HỢP
ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC TRICHODERMA
KONINGII VÀ TINH SẠCH BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : CN. ĐỖ THỊ TUYẾN
Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ YẾN NHI
MSSV: 1151110242 Lớp: 11DSH03
TP. Hồ Chí Minh, 2015
- Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của cá nhân em. Những kết quả và
số liệu trong báo cáo tốt nghiệp được thực hiện tại Viện sinh học nhiệt đới và phòng
thí nghiệm trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, không sao chép bất kỳ
nguồn nào khác. Em hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan
này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 08 năm 2015
Sinh viên
Trần Thị Yến Nhi
- Đồ án tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Kỹ
Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học
– Thực phẩm – Môi trường cùng tất cả quý thầy cô đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt
những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình học tập tại
trường. Đó là những hành trang quý giá giúp em hòa nhập tốt vào xã hội, góp một
phần sức lực nhỏ bé của mình vào công cuộc xây dựng đất nước.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đỗ Thị Tuyến – người đã tạo
điều kiện tốt nhất, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian
nghiên cứu và hoàn thành đồ án tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. HCM và các anh chị phụ trách
phòng các hoạt chất có hoạt tính sinh học đã tạo điều kiện và hướng dẫn em hoàn
thành một số thí nghiệm trong quá trình nghiên cứu tại đây.
Chân thành cảm ơn các thầy phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và tất cả
các bạn trong phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ trong lúc thực hiện đề
tài này.
Con xin gửi tình thương yêu và lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, mọi người
trong gia đình và những người luôn bên cạnh luôn sẵn sàng ủng hộ, chăm sóc, động
viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con trong mọi bước đường đi.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2015
Sinh viên
Trần Thị Yến Nhi
- Đồ án tốt nghiệp
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG................................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH...................................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ....................................................................................x
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU ..............................................................................................1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài ..............................................................................1
1.2. Tình hình nghiên cứu ..................................................................................2
1.3. Mục đích nghiên cứu ...................................................................................3
1.4. Nhiệm vụ nghiên cứu ...................................................................................3
1.5. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................3
1.6. Các kết quả đạt được của đề tài .................................................................3
1.7. Kết cấu của đồ án.........................................................................................4
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................5
2.1. Khái quát chung về enzyme ...........................................................................5
2.1.1. Sơ lược về enzyme .....................................................................................5
2.1.2. Tính chất của enzyme................................................................................6
2.1.2.1. Bản chất sinh học .................................................................................6
2.1.2.2. Bản chất hóa học ..................................................................................7
2.2. Giới thiệu sơ lược về cellulose........................................................................7
2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme cellulase ..........................................................9
2.3.1. Định nghĩa .................................................................................................9
2.3.2. Phân loại ..................................................................................................10
2.3.3. Tính chất ..................................................................................................10
i
- Đồ án tốt nghiệp
2.3.3.1. Tính đặc hiệu......................................................................................10
2.3.3.2. Đặc tính vật lý và hóa học..................................................................10
2.3.3.3. Các chất ức chế ..................................................................................10
2.3.4. Cơ chế tác động của enzyme ...................................................................11
2.3.4.1. Cơ chế 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) ..................11
2.3.4.2. Cơ chế 1,4-β-D-glucanohydrolase (EC 3.2.1.14) ..............................11
2.3.4.3. Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) ........................12
2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase .12
2.3.5.1. Thành phần môi trường nuôi cấy .......................................................12
2.3.5.2. Nhiệt độ nuôi cấy ...............................................................................13
2.3.5.3. pH môi trường ....................................................................................14
2.3.5.4. Độ ẩm .................................................................................................14
2.3.5.5. Môi trường không khí ........................................................................14
2.3.6. Ứng dụng của enzyme cellulase .............................................................14
2.3.6.1. Cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc ...............................14
2.3.6.2. Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật ...................15
2.3.6.3. Thủy phân gỗ và các phế liệu giàu cellulose .....................................15
2.4. Vi sinh vật tổng hợp cellulase ......................................................................15
2.4.1. Nấm sợi ....................................................................................................15
2.4.2. Nấm mốc Trichoderma koningii .............................................................16
2.5. Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase .....................17
2.5.1. Bã mía ......................................................................................................17
2.5.2. Cám gạo ...................................................................................................17
2.6. Phương pháp lên men bề mặt ......................................................................19
ii
- Đồ án tốt nghiệp
2.7. Giới thiệu sơ lược về phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme ........20
2.8. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase ..................................................22
2.8.1. Xác định hoạt tính exoglucanase ...........................................................23
2.8.2. Xác định hoạt tính endoglucanase .........................................................23
2.9. Sơ lược về sắc ký lọc gel ...............................................................................24
2.9.1. Bản chất của phương pháp .....................................................................24
2.9.2. Đặc tính của gel .......................................................................................25
2.10. Sơ lược về phân tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamide .....26
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................28
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...............................................................28
3.2. Vật liệu ...........................................................................................................28
3.2.1. Nguồn vi sinh vật .....................................................................................28
3.2.2. Cơ chất .....................................................................................................28
3.2.3. Hóa chất ...................................................................................................28
3.3. Thiết bị và dụng cụ .......................................................................................29
3.3.1. Thiết bị .....................................................................................................29
3.3.2. Dụng cụ ....................................................................................................30
3.4. Môi trường.....................................................................................................31
3.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ........................................................31
3.5.1. Phương pháp phân tích độ ẩm cơ chất ..................................................31
3.5.2. Phương pháp tính độ ẩm bổ sung môi trường nuôi cấy........................32
3.5.3. Nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii..............................................32
3.5.3.1. Cấy giống trên môi trường thạch nghiêng PGA ................................32
3.5.3.2. Nhân giống trên môi trường lúa .........................................................33
iii
- Đồ án tốt nghiệp
3.5.3.3. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận cellulase .........................34
3.5.4. Phương pháp mô tả hình thái T. koningii..............................................35
3.5.5. Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu
............................................................................................................................36
3.5.6. Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô ................................................36
3.5.7. Khảo sát khả năng phân hủy cellulose...................................................36
3.5.8. Xác định hàm lượng proteintheo phương pháp Bradford ....................37
3.5.9. Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) ...........40
3.5.10. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp enzyme cellulase ........42
3.5.10.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất ...............................................43
3.5.10.2. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường ban đầu .......................43
3.5.10.3.Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu ................................................44
3.5.10.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng .................................45
3.5.10.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy .....................................45
3.5.10.6. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống.................................................45
3.5.11. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm .................................................46
3.5.12. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dịch enzyme và dung môi tủa enzyme.47
3.5.12.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa dịch enzyme và dung môi tủa ..47
3.5.12.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi tủa enzyme ........................48
3.5.13. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase.........48
3.5.13.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme cellulase ....48
3.5.13.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme cellulase
.........................................................................................................................48
3.5.13.3. Hoạt tính enzyme cellulase của dịch chiết thô .................................48
iv
- Đồ án tốt nghiệp
3.5.14. Phương pháp tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc ký lọc gel ............49
3.5.14.1. Nguyên tắc .......................................................................................49
3.5.14.2. Hóa chất và dụng cụ .........................................................................49
3.5.14.3. Tiến hành thí nghiệm .......................................................................49
3.5.15. Phương pháp điện di phân tách protein trên gel polyacrylamide .......51
3.5.16. Phương pháp bố trí và xử lý số liệu......................................................55
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................56
4.1. Khảo sát hình thái đại thể và vi thể của chủng T.koningii ........................56
4.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào phân hủy cellulose trên đĩa thạch ......57
4.3. Kết quả định lượng mốc giống bằng buồng đếm hồng cầu ......................57
4.4. Kết quả xác định độ ẩm cơ chất ..................................................................58
4.5. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase trên môi trường lên men bán rắn .......................................................59
4.5.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ BM:CG đến khả năng sinh tổng hợp cellulase ...59
4.5.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
............................................................................................................................60
4.5.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu khả năng sinh tổng hợp cellulase ...........61
4.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase..............................................................................................................62
4.5.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase..............................................................................................................64
4.5.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp cellulase.......65
4.6. Quy hoạch thực nghiệm ...............................................................................66
4.7. Khảo sát tỷ lệ tủa và chọn ra loại dung môi tủa enzyme cellulase tốt nhất
...............................................................................................................................71
v
- Đồ án tốt nghiệp
4.7.1. Khảo sát tỷ lệ tủa giữa dịch chiết enzyme và dung môi ethanol ...........71
4.7.2. Khảo sát tỷ lệ tủa giữa dịch chiết enzyme và dung môi acetone ...........73
4.7.3. Khảo sát chọn ra dung môi tủa enzyme tối ưu ......................................74
4.8. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase ..75
4.8.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase ...............75
4.8.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase.......76
4.9. Tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc lọc gel...............................................77
4.10. Kết quả phân tách hệ cellulase bằng phương pháp điện di trên gel SDS
– PAGE .................................................................................................................79
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..........................................................82
5.1. Kết luận..........................................................................................................82
5.2. Kiến nghị........................................................................................................82
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................83
PHỤ LỤC
vi
- Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
BM:CG : Bã mía và cám gạo
CBB : Coomasie brilliant blue
CMC : Carboxymethyl cellulose
CMCase : Carboxymethyl cellulase
DNS : 3,5-dinitrosalicylic acid
DTT : Dithiothreitol
EC : Enzyme commission number (tiểu ban về enzyme)
FPA : Filter paper activity (hoạt tính giấy lọc)
HEC : Hydroxyethyl cellulose
HL : Hàm lượng protein (mg)
HT : Hoạt tính enzyme (U)
HTR : Hoạt tính riêng (U/mg)
MT : Môi trường
MW : Molecular weight (trọng lượng phân tử)
NĐC : Nồng độ chuẩn
OD : Optical density (trị số mật độ quang)
PGA : Potato glucose agar
SDS – PAGE: Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel
Electrophoresis
T. koningii : Trichoderma koningii
TEMED : N, N, N’, N’ – Tetramethyl – ethylenediamine
U : Đơn vị hoạt tính enzyme
VSV : Vi sinh vật
vii
- Đồ án tốt nghiệp
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Hàm lượng các chất trong cám gạo .......................................................... 18
Bảng 2.2. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase ................................................ 22
Bảng 3.1. Thành phần các chất trong môi trường Czapek ....................................... 31
Bảng 3.2. Môi trường xác định khả năng sinh enzyme cellulase của vi sinh vật ..... 37
Bảng 3.3. Thí nghiệm dựng đường chuẩn Albumine ............................................... 39
Bảng 3.4. Thí nghiệm dựng đường chuẩn glucose ................................................... 41
Bảng 3.5. Bảng bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính CMCase ................................. 42
Bảng 3.6. Bảng bố trí thí nghiệm tỷ lệ cơ chất ......................................................... 43
Bảng 3.7. Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường ......... 44
Bảng 3.8. Khảo sát tỷ lệ giữa dung môi tủa và dịch enzyme ................................... 47
Bảng 3.9. Thành phần các chất trong gel phân tách ................................................. 53
Bảng 3.10. Thành phần các chất trong gel gom ....................................................... 54
Bảng 4.1. Kết quả đo độ ẩm cơ chất BM:CG ........................................................... 59
Bảng 4.2. Các giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase của T. koningii trước quy hoạch thực nghiệm............................................ 66
Bảng 4.3. Mã hóa các biến số ................................................................................... 66
Bảng 4.4. Ma trận kế hoạch hóa ............................................................................... 67
Bảng 4.5. Kết quả hoạt tính CMCase theo thực nghiệm và theo phương trình hồi quy
............................................................................................................................................. 68
Bảng 4.6. Kết quả 𝑏𝑗 và 𝑏𝑖𝑗 ....................................................................................... 69
Bảng 4.7. Giá trị trung bình của 3 thí nghiệm trung tâm.......................................... 69
Bảng 4.8. Giá trị hoạt tính CMCase và hàm lượng protein tối ưu của enzyme cellulase
khi tủa bằng dung môi ethanol 960 và dung môi acetone ......................................... 74
Bảng 4.9. Kết quả tinh sạch bằng sắc ký lọc gel ...................................................... 78
Bảng 4.10. Giá trị 𝑅𝑓 và log của các protein trong thang chuẩn .............................. 79
Bảng 4.11. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 2 .................. 81
Bảng 4.12. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 3 .................. 81
Bảng 4.13. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 4 .................. 81
viii
- Đồ án tốt nghiệp
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose ................................................................ 7
Hình 2.2. Cấu trúc của enzyme cellulase ................................................................... 9
Hình 2.3. Cơ chế hoạt động của exoglucanase ......................................................... 11
Hình 2.4. Cơ chế hoạt động của endoglucanase ....................................................... 11
Hình 2.5. Cơ chế hoạt động của cellobiase .............................................................. 12
Hình 2.6. Hình thái nấm Trichoderma koningii ....................................................... 16
Hình 2.7. Bã mía ....................................................................................................... 17
Hình 2.8. Cám gạo .................................................................................................... 17
Hình 2.9. Quá trình tách các phân tử bằng sắc ký lọc gel ........................................ 24
Hình 4.1. Nấm mốc T. koningii sau khi nuôi cấy 2 ngày (hình a) và 4 ngày (hình
b)................................................................................................................................ 56
Hình 4.2. Nấm mốc T. koningii chụp ở vật kính 40X bằng kính hiển vi (hình c) và
kính hiển vi điện tử (hình d) ...................................................................................... 56
Hình 4.3. Vòng phân giải CMC của nấm mốc T. koningii 18 mm sau 24 giờ (hình
e), 25 mm sau 32 giờ (hình f) và 35 mm sau 48 giờ (hình g) ................................... 57
Hình 4.4. Bào tử nấm T. koningii được quan sát dưới kính hiển vi ......................... 58
Hình 4.5. Sắc ký đồ tinh sạch enzyme cellulase ...................................................... 78
Hình 4.6. Kết quả điện di.......................................................................................... 79
ix
- Đồ án tốt nghiệp
DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T.
koningii có tỷ lệ cơ chất BM:CG khác nhau ............................................................. 59
Đồ thị 4.2. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T.
koningii có độ ẩm ban đầu khác nhau ....................................................................... 61
Đồ thị 4.3. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T.
koningii có pH ban đầu khác nhau ............................................................................ 62
Đồ thị 4.4. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T.
koningii có nồng độ dinh dưỡng khác nhau .............................................................. 63
Đồ thị 4.5. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T.
koningii có thời gian nuôi cấy khác nhau.................................................................. 64
Đồ thị 4.6. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T.
koningii có tỷ lệ giống khác nhau ............................................................................. 65
Đồ thị 4.7. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của các tỷ lệ tủa giữa dịch
chiết enzyme cellulase với dung môi ethanol ........................................................... 72
Đồ thị 4.8. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của các tỷ lệ tủa giữa dịch
chiết enzyme cellulase với dung môi acetone ........................................................... 73
Đồ thị 4.9. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein tối ưu của enzyme cellulase
khi được tủa bằng dung môi ethanol 96° và dung môi acetone ................................ 74
Đồ thị 4.10. Hoạt tính CMCase của enzyme cellulase ở những pH khác nhau ....... 75
Đồ thị 4.11. Hoạt tính CMCase của enzyme cellulase ở những nhiệt độ khác nhau76
Đồ thị 4.12. Sự tương quan giữa log (trọng lượng phân tử) của những protein trong
thang chuẩn với 𝑅𝑓 .................................................................................................... 80
x
- Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, cuộc sống hiện đại với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật,
các ngành khoa học ứng dụng ngày càng được áp dụng nhiều hơn vào thực tế góp
phần giúp cho đời sống con người ngày càng được nâng cao và hoàn thiện. Trong đó,
ngành công nghệ sinh học là có nhiều ứng dụng và nghiên cứu triển vọng, đặc biệt là
trong lĩnh vực sản xuất và nghiên cứu về enzyme.
Nhân tố quan trọng để thúc đẩy ngành công nghiệp enzyme phát triển là khả
năng to lớn của vi sinh vật. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh chóng,
do đó có khả năng đáp ứng được mọi nhu cầu của con người, đồng thời enzyme do
vi sinh vật tạo ra có hoạt lực cao. Bên cạnh đó, môi trường nuôi cấy vi sinh vật cho
phép chúng ta có thể tận dụng được các phế thải của các ngành khác.
Nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy chế biến thực phẩm thải ra là rất lớn
như: rơm rạ, trấu, bã mía, agar,…Các phế thải này có thành phần chính là cellulose.
Cellulose có thể bị phân hủy bằng phương pháp vật lý và hóa học nhưng việc này rất
phức tạp. Trong khi đó, nếu sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật
bằng công nghệ sinh học để xử lý các chất thải hữu cơ sẽ có nhiều điểm ưu việt hơn
kể cả về mặt kỹ thuật, môi trường cũng như về kinh tế.
Hằng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn những nguồn enzyme
cellulase để giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ô nhiễm môi trường. Mặt khác, số
lượng loài vi sinh vật tham gia tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên
rất phong phú như nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn,…Nấm Trichoderma spp hiện diện
gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống khác với mật độ
cao. Các nhà khoa học phân lập thành công chủng nấm mốc Trichoderma koningii để
tổng hợp nên enzyme cellulase một cách có hiệu quả và giá thành lại rẻ. Bên cạnh đó,
celluase được ứng dụng rộng rãi trong các ngành và lĩnh vực khác nhau như công
nghiệp, nông nghiệp, y học,…Vì vậy, việc sản xuất được một lượng lớn enzyme
cellulase với chi phí thấp là một điều rất cần thiết. Và để thu nhận được enzyme
cellulase một cách hiệu quả nhất thì ta cần khảo sát các điều kiện, yếu tố ảnh hưởng
1
- Đồ án tốt nghiệp
đến môi trường sinh tổng hợp tối ưu của enzyme này nhằm tạo ra sản phẩm sinh học
có giá trị cao trong ứng dụng.
1.2. Tình hình nghiên cứu
Hiện tại ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về khả năng sinh tổng hợp
enzyme cellulase từ Trichoderma koningii (T. koningii), nhưng trên thế giới đã có
nhiều đề tài nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme của T. koningii.
Theo Cui Fumian và cộng sự (1995), thí nghiệm khảo sát khả năng sinh tổng
hợp enzyme cenllulase đã được thực hiện bằng cách phát triển các giống đột biến trên
môi trường bán rắn bao gồm 3 g bột rơm, 2 g cám lúa mì và 10 ml ammonium sulfate
1% trong 250 ml bình ở 280C, 72 giờ tại pH ban đầu là 6,0. Với hiệu suất tổng hợp
enzyme cellulase là 4880 U/g carboxymethyl cellulose – Na và 480 U/g trên sợi bông.
Hoạt tính enzyme cellulase từ chủng đột biến là gấp 3 lần so với chủng mẹ. Các điều
kiện tối ưu cho hoạt động enzyme trên bông là pH 4,5 – 5,0 và 45 – 500C. Enzyme
ổn định ở mức pH 3,5 – 6,5 ở 450C trong 4 giờ. Sau khi ủ men ở 600C trong 1 giờ,
vẫn còn 20% hoạt tính của enzyme cellulase.
Theo Liu Xiao-jie và cộng sự (2003), khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase
của T. koningii trên môi trường bột rơm đã có tác động tốt, trong khi môi trường
(NH4)2SO4 có tác động tiêu cực đến sinh tổng hợp enzyme cellulase. Hoạt tính mạnh
nhất của enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase), hoạt tính giấy lọc (FPA) và β –
glucosidase lần lượt là 765,8 U/ml, 155,3 U/ml và 39,54 U/ml, tương ứng với môi
trường nuôi cấy tối ưu hóa sau 6 ngày.
Theo Zou Shui – yang và cộng sự (2011), điều kiện nuôi cấy được tối ưu cho
nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme cellulase từ T. koningii đã được thiết lập như sau:
tỷ lệ rơm : cám là 3 : 2 (w/w), tỷ lệ dinh dưỡng môi trường là 1:1,5 (w/v), pH ban đầu
là 5,5 và nuôi cấy trong 120 giờ ở 28,50C. Với điều kiện tối ưu trên, hoạt tính giấy
lọc, β – glucosidase và xylanase lần lượt là 13,1 U/g chất khô, 12,2 U/g chất khô và
994,7 U/g chất khô.
Theo Wang S và cộng sự (2013), các gen sản sinh enzyme cellulase và
xylanase của nấm Trichoderma tồn tại dưới dạng sợi carbon catabolite áp trung gian
2
- Đồ án tốt nghiệp
bởi các hoạt hóa dị hóa carbon (CRE1). Việc sản xuất enzyme có thể được cải thiện
hơn nữa bằng cách bất hoạt gen CRE1. Việc bất hoạt gene CRE1, dẫn đến thay đổi
biểu hiện gen sinh enzyme cellulase trong nuôi cấy cơ bản trên đường. Kết quả là
hoạt tính giấy lọc, hoạt tính β – 1,4 – exoglucanase, hoạt tính β – 1,4 – edoglucanase
và hoạt tính xylanase đã thay đổi trên lần lượt là 2,1, 1,4, 0,8 và 0,8 lần. Việc can
thiệp vào RNA là một phương pháp khả thi để phân tích các cơ chế quản lý biểu hiện
gen và cải thiện năng suất sinh enzyme xylanase và enzyme cellulase trong T.
koningii.
1.3. Mục đích nghiên cứu
Làm cơ sở nghiên cứu để sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trichoderma
koningii một cách tối ưu nhất.
1.4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Quan sát đại thể và vi thể hình thái của nấm mốc Trichoderma koningii.
- Thu nhận enzyme cellulase từ việc nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii
trên môi trường bán rắn.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase
của Trichoderma koningii.
- Khảo sát tỷ lệ tủa và chọn ra dung môi tủa enzyme cellulase tốt nhất.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase.
- Tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc ký lọc gel.
- Phân tách hệ enzyme cellulase bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE.
1.5. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm.
- Phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2010 và
stagraphic plus.
1.6. Các kết quả đạt được của đề tài
- Thu được enzyme cellulase.
- Có được các thông số tối ưu quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase của
Trichoderma koningii.
3
- Đồ án tốt nghiệp
- Bước đầu tạo chế phẩm enzyme cellulase bằng phương pháp kết tủa.
- Tinh sạch được enzyme cellulase.
1.7. Kết cấu của đồ án
Đồ án tốt nghiệp gồm 5 chương:
Chương 1: Mở đầu.
Chương 2: Tổng quan tài liệu.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.
Chương 4: Kết quả và thảo luận.
Chương 5: Kết luận và kiến nghị.
4
- Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát chung về enzyme
2.1.1. Sơ lược về enzyme (Lê Minh Trí, 2011)
Enzyme hay còn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme
có trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng
hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (invivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng
ngoài tế bào (invitro). Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi
là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học
khác.
Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra
trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay
kiềm mạnh,…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp
nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng
(370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh,…).
Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu là khả
năng xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một
kiểu phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất.
Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Do đó muốn thu nhận
enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể vi sinh vật. Tất cả các tế bào
động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa nhiều enzyme thì hoàn toàn khác nhau.
Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản:
- Động vật (hạn chế)
- Thực vật (hạn chế)
- Vi sinh vật (phổ biến)
Việc khai thác enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp vì nguồn nguyên liệu
thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hạn chế.
5
- Đồ án tốt nghiệp
Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật có những ưu điểm như sau:
- Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn.
- Hệ enzyme có vi sinh vật vô cùng phong phú.
- Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng
tổng hợp ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện một cách dễ dàng
trong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng môi trường của vi sinh vật là
rất cao.
- Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh.
- Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng nên có thể
tận dụng những phụ phế liệu công nông nghiệp để sản xuất enzyme và có thể
dễ dàng điều khiển các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để có thể thu
được hiệu suất cao trong sản xuất.
- Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo quy mô công
nghiệp.
2.1.2. Tính chất của enzyme (Nguyễn Văn Mùi, 2011)
2.1.2.1. Bản chất sinh học
Enzyme được tạo ra bên trong tế bào và chịu sự điều khiển của gen.
Phản ứng của enzyme ít hao tốn năng lượng và có khả năng tham gia phản ứng
cả trong và ngoài tế bào. Một gen một enzyme một phản ứng.
Enzyme có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn nguyên liệu khác nhau từ sinh
vật, các enzyme thu nhận từ nguồn sinh vật như rau quả thông dụng không có tính
chất gây độc.
Đa số các enzyme hoạt động xúc tác trong các phản ứng sinh học ở điều kiện
nhiệt độ 20 – 450C, 1 atm, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính.
Mỗi enzyme tham gia xúc tác đặc hiệu với một cơ chất nhất định, vận tốc phản
ứng tăng gấp nhiều lần so với chất xúc tác sinh học, vì vậy enzyme cần dùng với
lượng rất nhỏ. Có thể điều chỉnh hay ngừng phản ứng bằng nhiệt độ, pH, …
6
- Đồ án tốt nghiệp
2.1.2.2. Bản chất hóa học
Gồm hai nhóm:
- Nhóm enzyme đơn cấu tử: enzyme chỉ được cấu tạo bởi một thành phần duy
nhất là protein.
- Nhóm enzyme đa cấu tử: là những loại enzyme mà được cấu tạo bởi hai thành
gồm: một thành phần là protein và thành phần còn lại không phải protein.
Thành phần này là những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình
xúc tác.
2.2. Giới thiệu sơ lược về cellulose.
Hằng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp ra nhờ
quá trình quang hợp. Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần
chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40 – 50% trong gỗ (Lê
Ngọc Tú và cộng sự, 1982).
Hình 2.1. Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose
(http://bio1151.nicerweb.com/Locked/media/ch05/cellulose.html)
Ligno – cellulose là thành phần cấu trúc chính của cây gỗ và cây thân mềm
(cỏ, rơm rạ) gồm cellulose, hemicellulose và lignin (Hamelinck và cộng sự, 2003).
Cellulose (40 – 60% trọng lượng khô) là polymer thẳng của các đơn vị β-D-1,4-
7
nguon tai.lieu . vn
