1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu

Đồ án tốt nghiệp: Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm tuyển chọn chủng Serratia marcescens sinh tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào, thiết lập môi trường nhân giống để thu được sinh khối nhiều nhất, thiết lập môi trường lên men để thu prodigiosin nhiều nhất. Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUY TRÌNH LÊN MEN VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DIỆT SÂU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 121

Ngày tạo 10/11/2021 12:28:00 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 3.46 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Thiết lập quy trình lên men vi k... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUY TRÌNH LÊN MEN VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DIỆT SÂU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn :T.S NGUYỄN HOÀI HƢƠNG Sinh viên thực hiện : CAO THỊ THANH THÚY MSSV: 1311101044 Lớp: 13DSH05 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của TS Nguyễn Hoài Hƣơng. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. TP. HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện Cao Thị Thanh Thúy
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho con xin gởi tất cả lòng biết ơn sâu sắc nhất đến cha mẹ, là ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng, giáo dục, động viên... là chỗ vựa tinh thần vững chắc cho con, là ngƣời giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã để con có đƣợc nhƣ ngày hôm nay. Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin gửi lời cám ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc tới tập thể quý thầy cô giáo trong trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM nói chung và các thầy cô giáo trong khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm-Môi Trƣờng, bộ môn Công Nghệ Sinh Học nói riêng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báo trong suốt thời gian qua. Đặc biệt, em xin đƣợc chân thành biết ơn cô TS. Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời thầy đáng kinh, cô đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp chỉ bảo, hƣớng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh, anh Nguyễn Trần Thiện Đức đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng, trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. Cảm ơn tất cả các bạn đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thời gian học tập tại trƣờng. Cảm ơn chị Vũ Hoàng Minh Ngọc, bạn Trƣơng Hoài Nguyên, bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, bạn Lê Thị Thu đã đồng hành chia sẻ buồn vui cùng em trong suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp. Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc! TP. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện Cao Thị Thanh Thúy
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC .................................................................................................................i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................iv DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................... vii MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 1. Tính cấp thiết của đề tài................................................................................ 1 2. Mục đích của nghiên cứu .............................................................................. 1 3. Nhiệm vụ của nghiên cứu.............................................................................. 2 4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài ................................................................... 2 5. Kết cấu của đồ án .......................................................................................... 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1.1. Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật .............................................. 3 1.1.1. Hợp chất thứ cấp ..................................................................................... 3 1.1.2. Triển vọng và tiếm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật ........ 3 1.2. Giới thiệu về Prodigiosin ........................................................................... 5 1.2.1. Khái niệm về Prodigiosin ..................................................................... 5 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin ................................................. 6 1.2.3. Hoạt động sinh học của Prodigiosin.................................................... 9 1.2.4. Cơ chế tổng hợp Prodigiosin của Serratia marcescens ..................... 10 1.3. Giới thiệu về Serratia marcescens .......................................................... 14 1.3.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................ 14 1.3.2. Phân loại khoa học của Serratia marcescens .................................... 15 1.3.3. Đặc điểm của Serratia marcescens .................................................... 15 1.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens ........................ 19 1.4.1. Sắc tố .................................................................................................. 19 1.4.2. Biosurfactant ...................................................................................... 20 1.4.3. Acid béo .............................................................................................. 20 1.4.4. Enzyme................................................................................................ 20 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.4.5. Yếu tố động lực của Serratia marcescens .......................................... 21 1.5. Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens ............................................ 22 1.6. Điều kiện tối ƣu cho sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens 24 1.7. Thu nhận và tinh sạch prodigiosin ......................................................... 27 1.8. Một số nghiên cứu trên thế giới .............................................................. 30 1.8.1. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens ...................................... 30 1.8.2. Tình hình nghiên cứu prodigiosin ..................................................... 30 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 33 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................... 34 2.1.1. Thời gian. ........................................................................................... 34 2.1.2. Địa điểm.............................................................................................. 34 2.2. Vật liệu – hóa chất – thiết bị .................................................................... 34 2.2.1. Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens ................................................ 34 2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất. ...................................................... 34 2.2.3. Dụng cụ, thiết bị ................................................................................. 35 2.3. Phƣơng pháp thí nghiệm ......................................................................... 36 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu......................................................................... 41 2.4.1. Phương pháp chọn lọc chủng Serratie marsescens có khả năng tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào mạnh nhất. ......................................... 41 2.4.2. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường nhân giống .................. 44 2.4.3. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men và chế độ lên men 44 2.4.4. Phương pháp phân tích ...................................................................... 47 Mục đích ........................................................................................................... 47 Nội dung ........................................................................................................... 47 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 48 3.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và prodigiosin cao nhất .................................................................... 48 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào ........................................................ 48 3.1.2. Trích ly thu prodigiosin ...................................................................... 52 3.1.3. So sánh hình thái, sinh lý, khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4 với chủng SH1 (ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013) ............ 54 3.2. Thiết lập môi trƣờng nhân giống ............................................................ 56 3.3. Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men................................... 58 3.3.1. Thiết lập môi trường lên men ............................................................ 58 3.3.2. Thiết lập chế độ lên men .................................................................... 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................... 70 1. Kết luận ........................................................................................................ 70 2. Kiến nghị ...................................................................................................... 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 70 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 76 A. PHỤ LỤC 1. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG, THUỐC THỬ, PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................................................................... 76 B. PHỤ LỤC 2. HÌNH ẢNH ........................................................................ 82 C. PHỤ LỤC 3. SỐ LIỆU THỐNG KÊ ...................................................... 87 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT EPN: Entomopathogenic nematodes OD: mật độ quang (Optical Density) λmax : bƣớc sóng hấp thụ cực đại LMTL: lên men tiếp liệu PG: peptone glycerol PGTL: peptone glycerol tiếp liệu MT1: môi trƣờng 1 MT2: môi trƣờng 2 iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008) .......... 6 Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) ........................................... 7 Hình 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira, 2009) ............ 9 Hình 1.4 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) ................................. 11 Hình 1.5 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. .......... 13 Hình 1.6 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens. ....... 16 Hình 1.7 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) ............................................................................................................ 16 Hình 1.8 Cơ chế gây bệnh của enzyme Serralysin metalloprotease của S.marcescens đối với ấu trùng tằm (K Ishii et al; 2014). ......................................... 23 Hình 1.9 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens đƣợc ghi nhận bởi Sundaramoorthy và cộng sự (2009) .......... 27 Hình 1.10 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodiosin bởi Serratia sp. BTWJ8 đƣợc ghi nhận bởi Krishna (2008) .......................................... 27 Hình 2.1 Quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm prodigiosin thô. ....................................................................................................... 37 Hình 2.2 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật. ....................................................... 38 Hình 2.3 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống vi khuẩn Serratia marcescens SH4 ...................................................................................................... 39 Hình 2.4 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng lên men vi khuẩn Serratia marcescens SH4 ...................................................................................................... 40 Hình 2.5. Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men vi khuẩn .................... 43 Hình 2.6 Quy trình tiếp liệu glycerol ....................................................................... 46 Hình 3.1 Khả năng tiết ezyme protease của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB ........................................................................................................................... 49 Hình 3.2 Khả năng tiết ezyme lipase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB ................................................................................................................................ 50 Hình 3.3 Khả năng tiết ezyme chitinase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. .......................................................................................................................... 51 Hình 3.4 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. ................................................................... 53 Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc của chủng SH4 và SH1 ............................................. 54 Hình 3.6 Kết quả nhuộm Gram hai chủng SH1 và SH4 .......................................... 55 Hình 3.7 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của hai chủng SH4 và SH1 ................... 55 Hình 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 theo thời gian trên các môi trƣờng nhân giống khác nhau. ..................................................... 57 Hình 3.9 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian. ....... 60 v
  9. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............ 61 Hình 3.11 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............ 63 Hình 3.12 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. ............... 65 Hình 3.13 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh và OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men peptone glycerol tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. ..................................................................................... 67 Hình 3.14 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499 nm) của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men PG ở các nồng độ tiếp liệu tại 48h. (số liệu thô xem ở bảng 5 - phụ lục A và hình 9 - phụ lục B) ....................................... 68 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chât thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật ............ 4 Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) . 8 Bảng 1.3 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens ................................. 17 Bảng 1.4 So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các môi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). ..... 25 Bảng 1.5 Một số bằng sáng chế về prodigiosin ....................................................... 32 Bảng 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. ..................................................................................................................... 51 Bảng 3.2 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm) , tế bào (OD620nm) sau xử lý acid và (OD535nm) sắc tố sau trích ly của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. ................................................................................................................................ 53 Bảng 3.3 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4 và SH1......................... 56 Bảng 3.4 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng nhân giống theo thời gian. .................................................................... 57 Bảng 3.5 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian. ........ 59 Bảng 3.6 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............ 61 Bảng 3.7 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............ 62 Bảng 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. ............... 65 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Prodigiosin là một sắc tố đỏ có bản chất là một alkaloid, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút đƣợc nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật cũng nhƣ hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Prodigiosin đƣợc tìm thấy trong quá trình lên men của một số loài vi sinh vật nhƣ Alteromonas rubra Moss, 2002 ; Rugamonas rubra Gerber, 1975; Serratia rubidaea Moss, 2002; Streptoverticillium rubrireticuli Gerber, 1975 Vibrio gazogenes Moss, 2002 và một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia mar- censcens có khả năng tổng hợp sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3- amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N3O = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996; Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005). Serratia marcescens đƣợc phân lập từ tuyến trùng EPN và đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng peptone glycerol, nutrient broth, môi trƣờng đậu phộng, môi trƣờng hạt mè,.... Một số nghiên cứu thu prodigiosin từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens thông thƣờng cần trích ly lỏng rắn bằng ethanol/methanol, sau đó trích ly lỏng lỏng bằng dung môi kém phân cực hơn để đƣợc prodigiosin tinh sạch một phần. Việc thu hồi prodigisin và tinh sạch một phần prodigiosin cho mục đích sản xuất thuốc trừ sâu rất tốn kém vì vậy một số nghiên cứu đã sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy (canh trƣờng) Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu.. Với mục tiêu tìm ra môi trƣờng nuôi cấy và điều kiện để sinh tổng hợp prodigiosin trong môi trƣờng bằng nuôi cấy lỏng ngƣời thực hiện đề tài đã chọn hƣớng cho đồ án tốt nghiệp là “ Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu”. 2. Mục tiêu của nghiên cứu 1
  12. Đồ án tốt nghiệp Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu. 3. Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn chủng Serratia marcescens sinh tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào. Thiết lập môi trƣờng nhân giống để thu đƣợc sinh khối nhiều nhất. Thiết lập môi trƣờng lên men để thu prodigiosin nhiều nhất. 4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài Chọn lọc đƣợc chủng S.marcescens sinh tổng hợp prodigiosin, enzyme ngoại bào protease và lipase cao nhất. Khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống thu đƣợc sinh khối nhiều nhất. Khảo sát thiết lập đƣợc môi trƣờng lên men thu đƣợc prodigiosin cao nhất. Khảo sát thiết lập đƣợc chế độ lên men thu đƣợc prodigiosin cao nhất. 5. Kết cấu của đồ án Đồ án “ Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu” đƣợc trình bày gồm 3 chƣơng: 1. Tổng quan tài liệu Giới thiệu về prodigiosin các tính chất đặc trƣng của hợp chất thứ cấp prodigiosin, phân loại loài cũng nhƣ các đặc trƣng sinh hóa của vi khuẩn Serratia marcescens. 2. Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm Giới thiệu về các phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong quá trình làm đồ án. Cách bố trí các nghiệm thức trong từng thí nghiệm. 3. Kết quả và thảo luận Trình bày chi tiết các kết quả đạt đƣợc của từng thí nghiệm đƣợc tiến hành. 2
  13. Đồ án tốt nghiệp Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 1.1.1. Hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp là chất đƣợc tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lƣợng phân tử nhỏ, thƣờng đƣợc gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trƣờng xung quanh. Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất đƣợc vi sinh vật tạo ra từ quá trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp. 1.1.2. Triển vọng và tiếm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Vi sinh vật đã đƣợc sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử sinh học nhƣ thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn nhƣ hợp chất thứ cấp, đƣợc xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học nhƣ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến cá, ví dụ nhƣ để tăng màu hồng của cá hồi nuôi. Hơn nữa, một số hợp chất tự nhiên có tiềm năng thƣơng mại để sử dụng nhƣ chất chống oxy hóa. Ngành công nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh vật cung cấp một số lƣợng hợp chất rất lớn nhƣ: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009). Các loại hợp chất này có tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng nhƣ có thể dễ dàng tối ƣu hóa quy trình công nghệ (Juailova và cộng sự, 1997. Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Willliams và cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác nhƣ: Rhodotorula, 3
  14. Đồ án tốt nghiệp Bacillus, Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số lƣợng lớn hợp chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây chết hoặc kiềm hãm vi sinh vật phát triển, đƣợc một số vi sinh vật (fungi, acmomycetes, bacteria) tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của mình. Bảng 1.1 tóm tắt về một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vât. Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chât thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật Vi sinh vật Hợp chất thứ Ứng dụng Kiểu tác động cấp ức chế Penicillium Penicilin Ức chế tụ cầu Ức chế tạo notatum, khuẩn, nhiễm polymer vách tế Penicillium trùng kỵ khí, bào vi khuẩn, ức chrysogenum giang mai, hen chế hấp thụ suyễn. amini acid và protein, ứ chế tạo enzyme. Streptomyces Streptomycin Ức chế vi Ức chế ghép nối griceus khuẩn Gram âm một số amino và Gram acid vào dƣơng. Trị bệnh protein, tác lao, bệnh viêm động lên hệ màng não, ho enzyme cả vi gà. khuẩn tham gia chuyển pyruvate vào chu trình Creb, ... Streptomyces Chloranphenicol Ức chế đối với Ức chế đặc hiệu venezuelas bệnh lỵ, sốt sinh tổng hợp 4
  15. Đồ án tốt nghiệp cao, sốt phát protein vi khuẩn ban. liên quan đến peptidyl transferase trong tiểu đơn vị Ribosome 50s, ngăn không cho tạo liên kết peptide. Streptomyces Tetracilin Ức chế phổ Ức chế tổng aureomycin rộng vi khuẩn hợp protein Gram âm, Gram dƣơng Streptomyces Erythromycin Chữa bệnh do Ức chế vi khuẩn erythraeus tụ cầu khuẩn Gram âm và Streptococcal Gram dƣơng gây ra Sttreptomyces Neomycin Tác dụng vi Hơi độc fradiae khuẩn Gram âm và Gram dƣơng Streptomyces Kanamycin Điều trị lao, ức Tác động giống kanamycetius chế vi khuẩn nhƣ Gram âm và Streptomycin và Gram dƣơng Neomycin Streptomyces Cycloserine Điều trị bệnh Cản trở tổng lavendulae lao hơp vách tế bào 1.2. Giới thiệu về Prodigiosin 1.2.1. Khái niệm về Prodigiosin 5
  16. Đồ án tốt nghiệp Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng túi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991). Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn Serratia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG-HCl), uncedylprodigiosin, meta- cycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochlo- ride (cPrG-HCl). 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)- methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006; Wil- liamson và cộng sự, 2006). Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo thành bộ khung pyrrolypyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp với nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methane (Qadri và Wil- liams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và đƣợc miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008). Hình 1.1 Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008) 6
  17. Đồ án tốt nghiệp Các sắc tố màu đỏ của S.marcescens đã đƣợc phân lập và đặt tên là “prodigio- sine” bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodi- giosin tổng hợp bởi S.marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ trong những năm tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có một loạt các chất đều mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thế alkyl khác nhau (Wasserman và cộng sự, 1969). Những nhóm thế thƣờng gắn trở lại để tạo thành vòng tròn hoặc macrocycles, nhƣ thể hiện trong hình 1.4, Furstner (2003) cho rằng danh pháp truyền thống là rất phù hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin” để chỉ tất cả. Đƣợc phân lập và đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902). Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan trong nƣớc. Prodigiosin có thể tan tƣơng đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform, 7
  18. Đồ án tốt nghiệp methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar và cộng sự, 2006). Hầu hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một bƣớc sóng nhất định và sự biểu hiện sắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ. Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Trọng lƣợng Loài Tên sắc tố Danh pháp phân tử và công prodigiosin thức Serratia Prodigiosine 2-Methyl- 3- marcescens amyl-6-methoxy- 323,4 Da prodigiosene C20H25N3O Serratia Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl- marcescens 6-hydroxy- 309,4 Da prodigiosene C10H23N3O Serratia Dipyrrolyl- 2-(2-pyrryl)-4-6- marcescens dipyrromelhenr dimethoxypy- 334,4 Da prodigiosin prodigiosene C19H18N4O2 Nocardia Nonylprodigiosin 2-Nonly-6- 363,5 Da (Actinomadura) methoxy- C23H31N3O madurae prodigiosene Nocardia Cyclononyl- 2,10-Nonano-6- 265,5 Da (Actinomadura) prodigiosin melhoxy- C23H33N3O madurae prodigiosene Nocadia Methylcyclodccyl- 2,10-Nonano-6- (Actinomadura) prodigiosin Methoxy- 391,5 Da pellctieri prodigiosene C25H33N3O Streptomyces Undccyl- 2-Undecyl-6- 393,6 Da longisporusruber prodigiosin Rnethoxy- C25H35N3O và Nocardia prodigiosene 8
  19. Đồ án tốt nghiệp (Actonomadura) pelletieri Streptomyces Metacyclo- 2,4-(9- 391,6 Da longisporusber prodigiosin Ethylnonano)-6- C25H33N3O methoxy- prodigiosene 1.2.3. Hoạt động sinh học của Prodigiosin Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số loại vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ DNA gyrase, topoisomerase IV,... dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009). Hình 1.2 Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira, 2009) A. Đối kháng với Staphylococcus aureus B. Đối kháng với Echerichia Ecoli Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng một số loài vi khuẩn nhƣ: Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus. (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012). 9
  20. Đồ án tốt nghiệp Ngoài ra, hoạt chất prodigiosin còn có khả chống ung thƣ (Pandey và cộng sự, 2009; Pe1rez – Tomás và Vias, 2010) và ức chế miễn dịch (Pandey và cộng sự, 2007). 1.2.4. Cơ chế tổng hợp Prodigiosin của Serratia marcescens Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274) đã đƣợc báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001). Nhiều chủng Serrtia marcescens sản xuất sắc tố thông qua con đƣờng ngƣng tụ enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và enzyme 4-methoxy-2, 2’-bipyrrile-5- caboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole, đƣợc gọi là 2-methyl-3-amyl- 6-methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin (Williams và Qadri, 1980). Dauenhauer và cộng sự (1984) đã phân lập đƣợc một chủng Serratia marcescens có khả năng tạo MAP và MBC, để hình thành prodigiosin. Tuy nhiên, không có tài liệu nào về trình tự của dòng tế bào này đƣợc báo cáo. Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 đƣợc biểu hiện trong Erwinia carotovora subsp. Carotovora (ECC; 25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm). trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin đƣợc quy định bởi nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong ECC, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tính hiệu khác đã đƣợc thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000). Nhóm sắc tố Serratia đƣợc quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và Streptomyces coelicolor và đƣợc bố trí từ pigA đến pigN, trong đó có năm gene tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốn gene tổng hợp MAP (màu xanh), đƣợc mô tả ở hình 1.4. Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp, tuy nhiên, có một protein còn lại (PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp. 10
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược