1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy để sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcenscens SH1

Đồ án tốt nghiệp: Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy để sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcenscens SH1

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm tìm ra được môi trường nuôi cấy tốt nhất để tổng hợp prodigiosin nhiều nhất; thiết lập được điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất để tổng hợp prodigiosin nhiều nhất. Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH1 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 87

Ngày tạo 10/10/2021 11:58:37 PM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 1.49 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Thiết lập môi trường dinh dưỡng ... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH1 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện :TRẦN LÂM TÚ QUYÊN MSSV: 1051110139 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
  2. Đồ án tốt nghiệp LỞI CẢM ƠN Em xin được trân trọng cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm - Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt những kiến thức nền tảng, những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình học tập và làm đồ án tốt nghiệp. Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hoài Hương, người cô đáng kính, đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn cho em về nội dung cũng như các kỹ năng, phương pháp, cách thức tiến hành thí nghiệm để em có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình. Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp của em. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình đã luôn ủng hộ, thương yêu và dành cho con những điều tốt đẹp nhất trong suốt quá trình học tập cũng như trong cuộc sống. Xin chân thành cảm ơn! TP. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014 Sinh viện thực hiện
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả là trung thực. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung đồ án của mình. Trường Đại học Công Nghệ TP. HCM không liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện. TP.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện
  4. Đồ án tốt nghiệp Mở Đầu 1. Tính cấp thiết của đề tài Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn như thực vật, vi sinh vật, động vật có xương sống và không xương sống là những nguồn có giá trị của các hợp chất hoạt tính sinh học. Một số lượng lớn các loại thuốc đã được phát triển trong ngành y từ các sản phẩm tự nhiên (Amador và cộng sự. 2003). Kể từ khi phát hiện và thành công trong việc điều trị của peniciline, các vi sinh vật đã được sử dụng như một nguồn đặc biệt của các tác nhân hoạt tính sinh học có cấu trúc đa dạng. các ứng dụng điều trị của các chất chuyển hóa của vi sinh vật cung cấp cơ hội cho việc phát hiện ra kháng sinh (ví dụ peniciline, erythromycin…), ức chế miễn dịch trong cấy ghép, các tác nhân giảm cholesterol (ví dụ : lovastain và mevastatin) và tác nhân chống ung thư (ví dụ: doxorubicin, daunorubicin, bleomycin và pentostatin). Từ khi nền khoa học hiện đại bắt đầu, các hợp chất thứ cấp tự nhiên được chiết xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ cũng như từ vi sinh vật đã được sử dụng trong việc làm thuốc đông y, mỹ phẩm, thực phẩm ,... Nhưng sau đó, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đã được nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hóa học cũng như cách tổng hợp bằng phương pháp hóa học, bởi người ta cho rằng chúng bền hơn, có thể sản xuất trên quy mô lớn và chi phí sản xuất thấp. Tuy nhiên, các vấn đề ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe gây ra bởi các hợp chất tổng hợp hóa học đã bắt đầu được quan tâm. So với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh vật ngày càng được quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự nhiên và an toàn để sử dụng, sản xuất được quanh năm trong các điều kiện địa lý khác nhau và do sự tăng trưởng nhanh chóng của vi sinh vật nên sẽ làm giảm thời gian sản xuất xuống còn chỉ một vài ngày. So với các nguồn khác từ thực vật hoặc động vật thì hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật có thể dễ dàng được kiểm soát và dự đoán sản lượng (Francis, 1987; Taylor, 1984). Trong những sắc tố từ vi sinh vật thì hợp chất prodigiosin được biết đến với ý nghĩa quan trọng. 1
  5. Đồ án tốt nghiệp Một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia marcenscens có khả năng tổng hợp sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N3O = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996; Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005). Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút được nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật cũng như hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Dựa trên cơ sở lợi ích rất quan trọng của hợp chất prodigiosin được tách từ việc nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, đề tài “THIẾT LẬP MÔI TRƢỜNG DINH DƢỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN S. MARCESCENS SH1” được tiến hành nhằm tìm ra được môi trường và điều kiện nuôi cấy để tổng hợp ra prodigiosin cao nhất. 2. Mục tiêu của nghiên cứu Khảo sát các loại môi trường tổng hợp prodigiosin cao nhất. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tổng hợp prodigiosin cao nhất. 3. Ý nghĩa khoa học Tìm ra được môi trường nuôi cấy tốt nhất để tổng hợp prodigiosin nhiều nhất. Thiết lập được điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất để tổng hợp prodigiosin nhiều nhất. 4. Ý nhĩa thực tiễn Prodigiosin là hợp chất thứ cấp vi sinh vật được nghiên cứu phát triển dược phẩm nên được bán trên thị trường với giá rất cao. Thành công của đề tài sẽ góp phần vào việc tìm được môi trường tốt nhất và điều kiện nuôi cấy tối ưu để sản xuất và ứng dụng hợp chất prodigiosin. 2
  6. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 1.1.1. Hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp là chất được tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lượng phân tử nhỏ, thường được gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trường xung quanh. Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất được vi sinh vật tạo ra từ quá trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp 1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Vi sinh vật đã được sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử sinh học như thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn như hợp chất thứ cấp, được xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học như động vật, thực vật hoặc vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật được sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến cá, ví dụ như để tăng màu hồng của cá hồi nuôi. Hơn nữa, một số hợp chất tự nhiên có tiềm năng thương mại để sử dụng như chất chống oxy hóa. Ngành công nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh vật cung cấp một số lượng hợp chất rất lớn như: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009). Các loại hợp chất này có tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng như có thể dễ dàng tối ưu hóa quy trình công nghệ (Juailova và cộng sự, 1997). Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Williams và cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác như: Rhodotorula, Bacillus, Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số lượng lớn hợp 3
  7. Đồ án tốt nghiệp chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây chết hoặc kìm hãm vi sinh vật phát triển, được một số vi sinh vật (fungi, actmomycetes, bacteria) tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của mình. Bảng 1.1 tóm tắt về một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật. Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật Hợp chất thứ Vi sinh vật Ứng dụng Kiểu tác động ức chế cấp Penicillium notatum, Ức chế tụ cầu Ức chế tạo polymer Penicillium khuẩn, nhiễm vách tế bào vi khuẩn, chrysogenum Penicillin trùng kỵ khí, ức chế hấp thu amino giang mai, hen acid và protein, ức chế suyễn. tạo enzyme Streptomyces griceus Ức chế vi khuẩn Ức chế ghép nối một Gram âm và ram số amino acid vào dương. Trị bệnh protein, tác động lên Streptomycin lao, bệnh viêm hệ enzyme của vi màng não, ho gà khuẩn tham gia chuyển pyruvate vào chu trình Creb… Steptomyces Ức chế đối với Ức chế đặc hiệu sinh venezuelae bệnh lỵ, sốt cao, tổng hợp protein vi sốt phát ban khuẩn liên quan đến peptidyl transferase Chloramphenicol trong tiểu đơn vị Ribosome 50s, ngăn không cho tạo liên kết peptide 4
  8. Đồ án tốt nghiệp Streptomyces Ức chế phổ rộng Ức chế tổng hợp aureomycin Tetracilin vi khuẩn Gram protein âm, Gram dương Streptomyces Chữa bệnh do tụ ức chế vi khuẩn Gram erythraeus cầu khuẩn âm và Gram dương Erythromycin streptococcal gây ra Streptomyces fradiae Tác dụng vi Hơi độc Neomycin khuẩnn Gram âm và Gram dương Streptomyces Điều trị lao, ức Tác động giống như kanamycetius chế vi khuẩn streptomycin và Kanamycin Gram âm và neomycin Gram dương Streptomyces Điều trị bệnh lao Cản trở tổng hợp vách Cycloserine lavendulae tế bào 1.2. Tổng quan prodigiosin 1.2.1. Khái niệm về prodigiosin Prodigiosin là một tripyrrole được phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc trưng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin được tìm thấy ở dạng túi bên ngoài tế bào cũng như các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991). 5
  9. Đồ án tốt nghiệp Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp, được sản xuất bởi các vi khuẩn như Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous, Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra và các xạ khuẩn Gram dương, chẳng hạn Streptoverticillium rubrireticuli và Streptomyces longisporus (Khanafari và cộng sự, 2006). Hình 1.1 trình bày cấu trúc hóa học của các hợp chất đại diện của prodigiosin. Hình 1.1. Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodigiosin được tổng hợp bởi Serrattia marcescens mới được biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ ở những năm tiếp theo, mà cấu trúc của prodigiosin dần được nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000). 6
  10. Đồ án tốt nghiệp Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)- methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng lượng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006; Williamson và cộng sự, 2006). Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp với nhau, còn vòng thứ ba được gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và được miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008). Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan được trong nước. Prodigiosin có thể tan tương đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafari và cộng sự, 2006). Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Trọng lƣơng Danh pháp Loài Tên sắc tố phân tử và prodigiosin công thức 2-Methyl-3-amyl-6- 323,4 Da C20 Serratia marcescens Prodigiosin methoxy prodigiosene H25 N30 2-Methyl-3-amyl-6- 309,4 Da Serratia marcescens Norprodigiosin hydroxy-prodigiosene C10 H23N3O Nocardia 2-Nonly-6- 363,5 Da (Actinomadura) Nonylprodigiosin methoxyprodigiosene C23H31 N3O madurae 7
  11. Đồ án tốt nghiệp Nocardia 2,10-Nonano-6- 265,5 Da (Actinomadura) Cyclononylprodigiosin melhoxy-prodigiosene C23H33 N3O Madurae Nocardia Methylcyclodc 2,10-Nonano-6- 391,5 Da (Actinomadura) cyl-prodigiosin Methoxy-prodigiosene C25H33N3O pellctieri Streptomyces longisporusruber và 2-Undecyl-6- 393,6 Da Nocardia Undccylprodigiosin Rnethoxyprodigiosene C25 H35 N3O (Actinomadura) pelletieri 2,4-(9-Ethylnonano) Streplonlyces 391,6 Da Metacycloprodigiosin -6- longisporusruber C25H33N3O methoxyprodigiosene 1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin 1.2.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số loài vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng tế bào và khả năng ức chế các enzyme như DNA gyrase, topoisomerase IV,… dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trưởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009). Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng một số vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Bacillus subtilis, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus,... Tuy nhiên, hoạt động kháng khuẩn của prodigiosin 8
  12. Đồ án tốt nghiệp đối với các vi khuẩn Gram dương lại cao hơn so với các vi khuẩn Gram âm (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012). 1.2.3.2. Hoạt tính chống tế bào ung thư Prodigiosin có khả năng gây độc tế bào và có thể chống lại một loạt các dòng tế bào ung thư ở người, nhưng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và cộng sự,2009; Pérez-Tomás và Viñas, 2010). Vì khả năng gây độc chọn lọc này, prodigiosin hứa hẹn có nhiều triển vọng trong việc sản xuất thuốc chống ung thư. Các hoạt động chống ung thư trong cơ thể của prodigiosin được chứng minh lần đầu tiên bằng những tác dụng ức chế của cycloprodigiosin trên tế bào Huh-7 hepatocarcinoma xenografted (Yamamoto và cộng sự, 1999). Một mô hình khối u ác tính trên chuột cũng cho thấy prodigiosin có khả năng ức chế sự di căn, bằng cách nó đã giảm sự di căn trên tế bào ung thư phổi (Zhang và cộng sự, 2005), điều này đã cho thấy rằng prodigiosin ngăn quá trình phát triển của tế bào ung thư thông qua nhiều cơ chế. Các khả năng gây độc dẫn đến sự tự hủy của tế bào ác tính bởi prodigiosin chủ yếu là do ảnh hưởng từ proapoptotic của chúng chống lại các tế bào ác tính. Nhiều nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ con đường prodigiosin gây sự tự hủy của các tế bào (Chia-Che và cộng sự, 2011). Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin được mô tả cụ thể như sau: 9
  13. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự, 2011) Quá trình acid hóa pH trong tế bào (pHi) rõ ràng là một kích hoạt quan trọng của quá trình tự hủy trong tế bào (Lagadic-Gossmann và cộng sự, 2004). Acid hóa nội bào là cần thiết cho cycloprodigiosin kích thích quá trình tự hủy trong tế bào HL-60 (Yamamoto và cộng sự, 2000), cũng tương tự như prodigiosin gây ra sự tự hủy ở tế bào ung thư ruột (Castillo-Avila và cộng sự, 2005). Các kết cấu của BCL-2 rất quan trọng trong việc tiến hành con đường tự hủy của ty thể bằng cách điều hòa tính thấm của màng ty thể bên ngoài. Tăng tính thấm của màng ty thể bên ngoài sẽ dẫn đến việc hình thành cytosolic của cytochrome c, nhằm kích hoạt caspase-9 bắt đầu caspase để tạo ra quá trình tự hủy. Prodigiosin được biết là tác nhân gây ra sự kích thích quá trình tự hủy của protein BCL-2 BAX trong tế bào MCF-7 (Soto-Cerrato và cộng sự, 2004). Tương tự như vậy, các nghiên cứu cũng đã chứng minh trước đó undecylprodigiosin giảm sự ngăn chặn tự hủy BCL-XL nhưng nâng kích thích tự hủy BIK, BIM, MCL-1S và NOXA (Ho và cộng sự, 2007). Survivin và XIAP là chất ức chế nội sinh của caspase. Survivin hoặc XIAP cao sẽ tạo ra sự đề kháng, điều này rất phổ biến trong các tế bào ung thư (Schimmer và cộng sự, 2006; Altieri, 2008). Một nghiên cứu trước đó của các tác giả thấy rằng 10
  14. Đồ án tốt nghiệp cả survivin và XIAP đều được giảm đi bởi sự có mặt của undecylprodigiosin trong tế bào MCF-7 (Ho và cộng sự, 2007). Ngừng chu kỳ tế bào: bên cạnh việc gây sự tự hủy của các tế bào ung thư, prodigiosin cũng ngăn chặn sự phát triển ung thư bằng cách gây ra quá trình ngừng chu kỳ tế bào ở nồng độ không gây độc cho tế bào. Để làm điều này, undecylprodigiosin làm giảm sự phát triển của tế bào lympho T bằng cách ức chế CDK4 và CDK2 (Songia và cộng sự, 1997). Tương tự như vậy, prodigiosin gây ra ngừng tăng trưởng của các tế bào Jurkat tại quá trình chuyển đổi G1-S, bằng cách giảm phosphoryl hóa Rb thông qua sự ức chế hoạt động của kinase cyclin E-CDK2 và cyclin A-CDK2, cũng như bằng cách điều chỉnh p21CIP1/WAF1 và p27KIP1 (Pérez-Tomás, và Montaner, 2003). Một nghiên cứu gần đây của Soto- Cerrato và cộng sự (Soto-Cerrato và cộng sự, 2007) đã cung cấp một cái nhìn sâu sắc vào cách prodigiosin điều chỉnh p21CIP1/WAF1. Chống sự xâm nhập và chống sự di căn: di căn là một nguyên nhân hàng đầu dẫn đến sự tử vong do bệnh ung thư và làm tăng nhu cầu về thuốc chống di căn. Những lợi ích chữa bệnh của prodigiosin đã được chứng minh trong một mô hình khối u ác tính ở chuột, bằng cách giảm sự di căn phổi (Zhang và cộng sự, 2005). Cơ chế hoạt động chống di căn của prodigiosin có thể là do tác dụng ức chế của nó trên các tế bào di căn và xâm nhập, có thể thông qua quá trình down-regulation của RhoA và matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) (Zhang và cộng sự, 2005). Tiềm năng gây độc tế bào của prodigiosin cũng đã nghiên cứu trong 60 dòng tế bào tiêu chuẩn của các khối u ở người, có nguồn gốc từ phổi, ruột, thận, buồng trứng, ung thư não, các khối u ác tính và bệnh bạch cầu. Ức chế tăng sinh tế bào cũng như cảm ứng cho tế bào tự hủy đã được quan sát trong các dòng tế bào (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). 11
  15. Đồ án tốt nghiệp Ngoài ra, prodigiosin cũng được tìm thấy gây độc tế bào ung thư phổi và các tế bào biểu mô kháng doxorubicin và biểu hiện tốt lên các protein đa kháng thuốc (Lagostera và cộng sự, 2005). 1.2.3.3. Hoạt tính ức chế miễn dịch Hoạt động ức chế miễn dịch của prodigiosin lần đầu tiên được mô tả bởi Nakamura và cộng sự, họ đã cho thấy sự hiện diện của prodigiosin và metacycloprodigiosin trong canh trường nuôi cấy vi khuẩn Serratia và quan sát sự ức chế chọn lọc quá trình phát triên của các tế bào lympho T đa giá so với các tế bào lympho B (Han và cộng sự, 2001). Sau đó, hoạt động ức chế miễn dịch đã được chứng minh cho các chất tương tự prodigiosin khác như: undecylprodigiosin, cPrG, MAMPDM, nonylprodigiosin,… Bảng 1.3. Ảnh hưởng prodigiosin đến khả năng tồn tại của các tế bào miễn dịch (Hwanmook và cộng sự, 2003) Khả năng tồn tại (%) Prodigiosin Ngay thứ (nM) Ngày thứ hai Ngày thứ ba nhất Đồi chứng 0 93 79 77 3 96 86 79 10 89 82 79 30 89 70 81 100 82 70 70 Thử nghiệm 300 68 14 18 1000 74 14 14 3000 61 9 8 10 000 32 4 4 30 000 4 4 4 12
  16. Đồ án tốt nghiệp 1.3. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin 1.3.1. Điều kiện tổng hợp prodigiosin Helvia và cộng sự (2010), đã tối ưu hóa quá trình sản xuất proodigiosin bởi Serratia marcescens UCP 1549 bằng việc sử dụng 6% nước thải từ công nghiệp chế biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28oC và pH =7 trong 48 giờ. Kết quả cho thấy Serratia marcescens sản xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l. Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ưu hóa sản xuất prodigiosin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigiosin. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu cho việc sản xuất prodigiosin trong môi trường Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Và quá trình chiết xuất prodigiosin được thực hiện bằng ethanol: hydrochloric acid (9,5: 0,5) hoặc acetone: ethyl acetate (1:1). Ngoài ra, prodigiosin thu nhận được có tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng khuẩn như Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh như Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp., hơn nữa, prodigiosin có khả năng chống oxy hóa ở nồng độ 22,05 μg/ml và có tiềm năng nhuộm, cùng với việc không bị ảnh hưởng bởi acid, kiềm , chất tẩy rửa, mà có thể ứng dụng rộng rãi trong ngành dệt và các ngành công nghiệp trị liệu. Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành cải tiến quá trình sản xuất prodigiosin trong Serratia marcescens. Họ nhận thấy rằng trong số các môi trường dầu khác nhau thì dầu đậu phộng sản xuất prodigiosin cao nhất (2,72 mg/ml) và có thể sử dụng để nhuộm bông tạo ra màu đẹp. San và cộng sự (2012), đã sử dụng chất thải chế biến thủy sản như một nguồn carbon và nitơ để sản xuất prodigiosin từ Serratia marcescens TKU011. Hơn nữa, nghiên cứu của các tác giả này cũng cho thấy prodigiosin có khả năng diệt côn trùng. Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn như Alteromonas 13
  17. Đồ án tốt nghiệp sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 μg/ml và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 μg/ml. Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50 khoảng 50 μg/ml. 1.3.2. Cơ chế tổng hợp prodigiosin Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens, ATCC 274 (Sma 274) đã được báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001). Prodigiosin được hình thành qua hai giai đoạn: 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5-carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole, được gọi là 2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene. Có rất ít thông tin về con đường sinh tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC, ngoại trừ việc mô tả về phân tử proline kết hợp nguyên vẹn thành một trong những nhóm pyrrole của MBC. Quá trình tổng hợp sắc tố này cần có không khí và phân tử oxy (Williams và Qadri, 1980). Hình 1.3. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC 39.600, Sma 274 và các cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001). Prodigiosin là một chất rất dễ dàng để thực hiện thử nghiệm trong các chất chuyển hóa của Serratia marcescens và có thể hữu ích đối với việc nghiên cứu 14
  18. Đồ án tốt nghiệp một hệ thống mô hình các cơ chế biểu hiện của chất chuyển hóa thứ cấp trong vi khuẩn. Tách các phân tử tái tổ hợp mã hóa cho quá trình tổng hợp prodigiosin sẽ là một cách tiếp cận để xác định sản phẩm gene và sự hiểu biết về enzymology và di truyền học của quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. Việc tách trình tự của DNA mã hóa một phần trong quá trình tổng hợp prodigiosin bằng cách sử dụng hệ thống nhân bản vector ở Escherichia coli cosmid đã được báo cáo (Dauenhauer và cộng sự, 1984). Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 được biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp. carotovora (25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm), mặc dù nó đã không được biểu hiện trong một số chủng vi khuẩn khác thuộc Enterobacteriaceae, bao gồm cả Escherichia coli (Thomson và cộng sự, 2000). Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin được quy định bởi nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp. carotovora, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tín hiệu khác đã được thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000). Nhóm sắc tố Serratia được quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và Streptomyces coelicolor và được bố trí trong pigA đến pigN, trong đó có năm gene tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốn gene tổng hợp MAP (màu xanh), được mô tả ở hình 1.4. Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp, tuy nhiên, có một protein còn lại (PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp. Thứ tự gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích thước và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno và cộng sự, 2001). 1.3.3. Yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp prodigiosin Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp điển hình chỉ xuất hiện sau giai đoạn phát triển của vi khuẩn (Harris và cộng sự, 2004). Bản chất màu đỏ tươi 15
  19. Đồ án tốt nghiệp của prodigiosin giúp việc nghiên cứu hợp chất thứ cấp này dễ dàng hơn (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Nhiều yếu tố, chẳng hạn như: nhiệt độ, pH, độ oxy hòa tan, ánh sáng, phosphate vô cơ và thành phần môi trường ảnh hưởng đến quá trình sản xuất prodigiosin (Heinemann và cộng sự, 1970; Sole và cộng sự, 1994; Rjazantseva và cộng sự, 1995; Williamson và cộng sự, 2005). Quá trình sản xuất prodigiosin trong Serratia marcescens rất nhạy cảm với nhiệt độ và bị ức chế đáng kể ở nhiệt độ cao hơn 37°C (Giri và cộng sự, 2004). Hơn nữa, môi trường thông thường được sử dụng để sinh tổng hợp prodigiosin bởi các chủng Serratia marcescens là môi trường phức tạp và rất giàu dinh dưỡng (Yamashita và cộng sự, 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng sự, 2004). Một số chất dinh dưỡng như thiamine và acid sắt (Wei và Chen, 2005) đặc biệt quan trọng đối với sản xuất prodigiosin, trong khi phosphate (Witney và cộng sự, 1977), adenosine triphosphate và ribose (Lawanson và Sholeye, 1975) lại có tác dụng ức chế sản lượng prodigiosin. Hình 1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009) Giri và cộng sự (2004), đã so sánh sự phát triển của Serratia marcescens trên các môi trường khác nhau như: môi trường hạt mè, nutrient broth và peptone glycerol broth,... Các môi trường cũng được so sánh tốc độ tăng trưởng và khả năng xuất prodigiosin ở các nhiệt độ khác nhau. Các thí nghiệm này cũng giúp quan 16
  20. Đồ án tốt nghiệp sát vai trò của các acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều thành phần trong hạt có thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng hợp nhiều prodigiosin hơn. Trên môi trường peanut broth thì prodigiosin có thể tổng hợp ở nhiệt độ 37oC trong khi trên các môi trường như nutrient broth, peptone glycerol broth có hoặc không có bổ sung đường cũng không thể làm được điều này (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Quá trình sản xuất prodigiosin ở Serratia marcescens giảm bởi glucose và các loại đường metabolizable khác do sự giảm pH trong canh trường nuôi cấy Khanafari và cộng sự, 2006). Bên cạnh đó, có thể xét đến vai trò của nguồn carbon trong quá trình sản xuất sắc tố. Điểm đầu tiên là trong nutrient broth, về cơ bản là môi trường này không có nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glucose làm tăng cường việc sản xuất sắc tố, trong trường hợp sử dụng môi trường sesame broth thì nguồn carbon ở dạng các acid béo. Maltose và glucose được thêm vào nutrient broth làm tăng gấp đôi năng suất so với chỉ sử dụng môi trường nutrient broth hoặc peptone glycerol broth. Điểm thứ hai là sự sản xuất sắc tố được tăng cường trong môi trường peptone glycerol broth ở 30oC và trong nutrient broth ở 28oC, điều này có thể là do sự hiện diện của glycerol như là một nguồn carbon. Rõ ràng trong thực tế nguồn carbon giúp hỗ trợ tăng trưởng tế bào và sản xuất prodigiosin (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Ngoài ra, một báo cáo đã chứng minh việc bổ sung silicagel vào môi trường lỏng của Serratia marcescens cũng dẫn đến sự tăng trưởng tế bào, sản xuất prodigiosin và serrawettin (Yamashita và cộng sự, 2001). Hơn nữa, prodigiosin thường nằm trên màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn như SDS vào môi trường nuôi cấy cũng có thể nâng cao hiệu quả sản xuất prodigiosin (Feng và cộng sự, 1982; Wei và Chen, 2005). 17
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược