1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men Pichia pastoris

Đồ án tốt nghiệp: Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men Pichia pastoris

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm thu nhận gen mã hóa endoglucanase D (CelD) từ Clostridium thermocellum bằng phản ứng PCR; tạo dòng tế bào E. coli DH5α mang plasmid nhân dòng tái tổ hợp chứa gen CelD; tạo dòng E. coli DH5α mang vector biểu hiện pPIC9K chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D. Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP CHỨA GEN MÃ HÓA ENZYME ENDOGLUCANASE D (CelD) TỪ V

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 94

Ngày tạo 10/10/2021 11:57:53 PM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 1.72 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP CHỨA GEN MÃ HÓA ENZYME ENDOGLUCANASE D (CelD) TỪ VI KHUẨN Clostridium thermocellum TRÊN HỆ THỐNG NẤM MEN Pichia pastoris Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Thạc sĩ Nguyễn Xuân Đồng Sinh viên thực hiện : Phan Vũ Hải Yến MSSV: 1051110247 Lớp: 10DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2014
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào trước đây. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện Phan Vũ Hải Yến
  3. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt 4 năm đại học. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến T.S Nguyễn Thị Hai người cô kính mến đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Th.S Nguyễn Xuân Đồng và K.S Lê Thị Huỳnh Trâm đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi về kiến thức chuyên môn và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Công nghệ Vi sinh - Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện và hỗ trợ tôi về kinh phí cũng như thiết bị để tôi có thể thực hiện đề tài. Tôi cũng cảm ơn các bạn trong nhóm ESS đã luôn cổ vũ và động viên tôi những lúc khó khăn để có thể vượt qua và hoàn thành tốt luận văn này. Và cuối cùng, hơn ai hết, từ đáy lòng con cảm ơn ba mẹ đã sinh ra con, nuôi dạy con khôn lớn, luôn bên con và là nguồn động viên to lớn của con, tạo mọi điều kiện tốt nhất cả về tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 7 năm 2014 Phan Vũ Hải Yến
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................ vi DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................................. vii DANH SÁCH CÁC BẢNG .............................................................................................. ix CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề: ......................................................................................................1 1.2. Mục đích nghiên cứu đề tài ............................................................................2 1.3. Nội dung nghiên cứuc.....................................................................................2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN.............................................................................................. 3 2.1. Cấu tạo lignocellulose ....................................................................................3 2.1.1. Cellulose ......................................................................................................... 4 2.1.2. Hemicellulose ................................................................................................ 6 2.1.3. Lignin .............................................................................................................. 7 2.2. Enzyme cellulase ............................................................................................8 2.2.1. Phân loại enzyme .............................................................................................. 8 2.2.2. Cơ chế tác dụng của cellulase ...................................................................... 9 2.2.3. Vi sinh vật sản xuất cellulase ..................................................................... 10 2.3. Phức hợp cellulosome trong vi khuẩn Clostridium thermocellum ..............11 2.3.1. Tổng quan về vi khuẩn Clostridium thermocellum..................................... 11 2.3.2. Đặc điểm của phức hệ cellulosome ........................................................... 12 2.4. Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris ..............................................................14 2.4.1. Đặc điểm hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris ...................................... 14 2.4.2. Tích hợp gen ngoại lai vào P. pastoris ......................................................... 14 2.4.3. Ưu điểm của hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris............................. 15 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tạo dòng các gen từ Clostridium thermocellum ...........................................................................................................16 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 19 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: ..................................................................19 3.1.1. Địa điểm nghiên cứu:...................................................................................... 19 3.1.2. Thời gian nghiên cứu: ..................................................................................... 19 3.2. Nguyên liệu ......................................................................................................19 3.2.1. Chủng vi sinh vật............................................................................................. 19 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ.......................................................................................... 19 3.2.3. Hóa chất ............................................................................................................ 20 3.2.4. Môi trường ....................................................................................................... 22 3.2.4.1. Môi trường LB (Luria-Bertani): .........................................................22 3.2.4.2. Môi trường MD (Minimal Dextrose): ................................................22 3.2.4.3. Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) ..........................22 3.2.4.4. Môi trường BMGY (Buffered Glycerol-complex): ...........................22 3.2.4.5. Môi trường BMMY (Buffered Methanol-complex) bổ sung CMC...23 3.2.5. Plasmid ............................................................................................................. 23 3.2.5.1. Plasmid pJET1.2/blunt ........................................................................23 3.2.5.2. Plasmid pPIC9K..................................................................................24 3.2.6. Các cặp mồi sử dụng ....................................................................................... 25 3.3. Phương pháp nghiên cứu: ................................................................................26 3.3.1. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD của Clostridium thermocellum......................................................................................... 26 3.3.1.1. Thiết kế mồi ....................................................................................26 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 3.3.1.2. Thu nhận gen CelD của vi khuẩn C. thermocellum bằng phản ứng PCR dựa vào cặp mồi đã thiết kế .....................................................................27 3.3.1.3. Quy trình tinh sạch gen theo MEGAquick – spin Total Fragment DNA Purification Kit – INTRON Biotechnololy............................................28 3.3.1.4. Phương pháp ghép nối gen vào vector nhân dòng pJET1.2/ Blunt ...28 3.3.1.5. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5α khả nạp ...............................................29 3.3.1.6. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp hóa biến nạp ............................................................................................................30 3.3.1.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc ....................................31 3.3.1.8. Phương pháp tách chiết plasmid từ tế bào E. coli ..............................32 3.3.1.9. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn ............................33 3.3.1.10. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự tương ứng trên GenBank ..................................................................................34 3.3.2.Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD ...................................................................................................................................... 34 3.3.2.1 Chuẩn bị dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn ..........................34 3.3.2.2. Quy trình tinh sạch gen và plasmid theo MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction System – INTRON ..........................................35 3.3.2.3. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD ...........................36 3.3.2.4. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5α khả nạp ...............................................36 3.3.2.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào E. coli DH5α ..........36 3.3.2.6. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc ....................37 3.3.2.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn ............................37 3.3.2.8. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự tương ứng trên GenBank ..................................................................................38 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp 3.3.3. Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 mang gen mã hóa enzyme endoglucanase D .......................................................................................... 38 3.3.3.1. Chuẩn bị tế bào Pichia pastoris GS115 khả nạp............................39 3.3.3.2. Phương pháp điện biến nạp.............................................................39 3.3.3.3. Chọn lọc các dòng Pichia pastoris mang nhiều bản sao của gen CelD và có khả năng năng tiết enzyme ngoại bào Endoglucanase D .............40 3.3.3.4. Phương pháp ly trích DNA tổng số ...............................................40 3.3.3.5. Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng phương pháp PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R ..........................................41 3.3.5. Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P. pastoris tái tổ hợp ........................................................................................................................... 42 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 43 4.1. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD của Clostridium thermocellum ......................................................................................43 4.1.1. Khuếch đại gen CelD bằng kĩ thuật PCR ................................................. 43 4.1.2. Tạo dòng E. coli mang plasmid nhân dòng chứa gen CelD ................... 44 4.1.3. Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc ............................................. 45 4.1.4. Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR và enzyme cắt giới hạn ................................................................... 46 4.1.5. Kiểm tra dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2-CelD bằng giải trình tự .................................................................................................................. 48 4.2.1. Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc ............................................. 52 4.2.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR và bằng enzyme cắt giới hạn SnaBI và EcoRI ............................ 53 4.2.3. Kiểm tra dòng E. coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K – CelD bằng giải trình tự ........................................................................................................ 55 iv
  8. Đồ án tốt nghiệp 4.3. Tạo dòng Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen CelD ......................57 4.3.1. Biến nạp plasmid pPIC9K – CelD vào chủng Pichia pastoris GS115 ...................................................................................................................................... 58 4.3.2. Sàng lọc tế bào nấm men mang gen mã hóa cho endoglucanase D ...... 59 4.3.3. Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng phương pháp PCR với mồi AOX1F/ AOX1R ..................................................................... 60 4.3.4. Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P. pastoris tái tổ hợp................................................................................................................................ 62 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 63 5.1. Kết luận .........................................................................................................65 5.2. Đề nghị ..........................................................................................................65 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................66 PHỤ LỤC v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT AOX Alcohol oxydase BMGY Buffered Glycerol-complex BMMY Buffered Methanol-complex bp Base pair CBD Cellulose binding domain CMC Carboxymethyl-cellulose dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid Kb kilo base LB Luria-Bertani MD Minimal Dextrose Mut Methanol Utilisation NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction Taq Thermus aquaticus TAE Tris – acetate – EDTA TE buffer Tris EDTA buffer YNB Yeast Nitrogen Base YPD Yeast Extract Peptone Dextrose vi
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Tỉ lệ các thành phần trong lignocellulose. ..................................................3 Hình 2.2. Lignocellulose .............................................................................................4 Hình 2.3. Cấu trúc phân tử Cellulose ..........................................................................5 Hình 2.4. Cấu trúc cellulose ........................................................................................6 Hình 2.5. Hemicellulose. .............................................................................................7 Hình 2.6. Lignin ...........................................................................................................7 Hình 2.7. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase. ..................................9 Hình 2.8. Clostridium thermocellum ........................................................................ 11 Hình 2.9. Cơ chế hoạt động của Cellulosome ...........................................................12 Hình 3.1. Thang DNA 1 Kb ......................................................................................21 Hình 3.2. Plasmid pJET 1.2 .......................................................................................24 Hình 3.3. Plasmid pPIC9K ........................................................................................25 Hình 3.4. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR ...............27 Hình 3.5. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R ................................................................................................................... 32 Hình 3.6. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/ AOX1R .......................................................................................................................37 Hình 3.7. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R ...........41 Hình 4.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CelD .....................43 Hình 4.2. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5𝛼 chứa plasmid tái tổ hợp pJET1.2- CelD trên môi trường LB/ Ampicillin (50 µg/ml) ...................................................444 Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli DH5α/pJET1.2-CelD với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R ...........................................45 Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm của cắt plasmid pJET1.2-CelD bằng enzyme SnaBI và EcoRI và sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR ....................................................................................................46 Hình 4.5. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5𝛼 chứa pPIC9K-CelD bằng môi trường LB/ ampicillin (50 µg/ml). .........................................................................................51 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli DH5α/pPIC9K-CelD với cặp mồi AOX1F/AOX1R. ................................................52 Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD với mồi CelDF/ CelDR và sản phẩm cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI. ....................53 Hình 4.8. Kết quả blast trình tự protein của trình tự trong plasmid pPIC9K-CelD trên NCBI .......................................................................................... 56 Hình 4.9. Sàng lọc thể biến nạp P. pastoris GS115 chứa pPIC9K-CelD .................58 Hình 4.10. Sàng lọc tế bào P. pastoris mang gen CelD trên môi trường YPD/ G418 .....................................................................................................................................60 Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự sát nhập của plasmid pPIC9K-CelD vào bộ gen P. pastoris GS115 .......................................................... 61 Hình 4.12. Vòng phân giải CMC của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp khi nhuộm với thuốc đỏ Congo ................................................................................................... 63 viii
  12. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1. Các cặp mồi được sử dụng có trình tự như sau: .......................................26 Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR ..........................27 Bảng 3.3. Thành phần phản ứng nối gen CelD vào plasmid pJET1.2 ......................29 Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R ...............31 Bảng 3.5. Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-CelD với SnaBI và EcoRI ................33 Bảng 3.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid pPIC9K và pJET1.2-CelD với SnaBI và EcoRI .....................................................................................................................35 Bảng 3.7. Thành phần phản ứng nối CelD vào vector biểu hiện pPIC9K ................36 Bảng 3.8. Thành phần phản ứng cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI..............38 Bảng 4.1. Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng P. pastoris tái tổ hợp .................................................................................................................................... 64 ix
  13. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề: Ethanol là một trong những dung môi quan trọng trong công nghiệp hóa học và công nghệ sản xuất thực phẩm. Gần đây, ethanol được coi là một nhiên liệu sạch có khả năng tái tạo, có thể thay thế một phần cho các nguồn nhiên liệu hoá thạch đang ngày càng cạn kiệt như than đá, dầu mỏ trong tương lai. Hiện nay 98% ethanol được sản xuất từ ngũ cốc hoặc nguyên liệu thực phẩm. Điều này sẽ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến tình hình an ninh lương thực trên thế giới. Trong khi đó, sản xuất nông nghiệp hàng năm sinh ra một lượng lớn phụ phế phẩm như rơm rạ, cám mì, trấu, bã mía,…Việc tận dụng được nguồn chất thải này để sản xuất ethanol sinh học không những giảm khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên đang dần cạn kiệt mà còn giảm ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên việc sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu tái sinh này vẫn còn gặp nhiều khó khăn khi sản xuất ở quy mô công nghiệp. Trong công nghệ sản xuất cồn sinh học, hai hướng chính để thủy phân cellulose là phương pháp hóa học và sinh học. Trong thủy phân hóa học, cellulose bị phân hủy thành đường đơn dưới tác dụng của H2SO4 ở nhiệt độ cao. Công nghệ này mặc dù có hiệu suất cao nhưng rất độc hại và phức tạp, ảnh hưởng xấu đến môi trường và con người. Chính vì vậy, hướng ứng dụng enzyme để thủy phân cellulose là một hướng nghiên cứu mới, hứa hẹn đem đến những đột phá về mặt công nghệ. Enzyme cellulase là enzyme ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thủy phân cellulose thành glucose – nguyên liệu chính trong sản xuất cồn sinh học. Tuy nhiên, việc sử dụng chúng vẫn còn hạn chế vì chi phí sản xuất enzyme cellulase cao và hiệu suất chuyển hóa cơ chất thấp. Nguyên nhân là do quá trình thu nhận enzyme trực tiếp từ vi sinh vật tốn nhiều thời gian và công sức, khó thực hiện ở quy mô công nghiệp, enzyme đôi khi không có đủ các đặc tính mong muốn. Chính vì thế, ứng dụng những tiến bộ của kỹ thuật di truyền vào việc sản xuất enzyme cellulase tái tổ hợp là một trong những hướng nghiên cứu tiềm năng để thu nhận enzyme với sản lượng lớn. 1
  14. Đồ án tốt nghiệp Hiện nay trên thế giới đã có những nghiên cứu về hệ enzyme phân hủy cellulose của cellulosome ở vi khuẩn kỵ khí ưa nhiệt Clostridium thermocellum. Hướng biểu hiện hệ cellulosome tái tổ hợp để thu nhận được số lượng lớn cellulosome có chức năng phân giải cellulose được coi là hướng có tiềm năng nhất trong công nghệ sản xuất cồn từ cellulose. Trên cơ sở đó đề tài: “Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men Pichia pastoris” được tiến hành. Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu tạo hỗn hợp enzyme cellulase phân hủy cellulose từ các nguồn phụ phế phẩm nông – lâm nghiệp và ứng dụng để sản xuất cồn sinh học với giá thành hợp lý. 1.2. Mục đích nghiên cứu đề tài Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme endoglucanase D từ vi khuẩn Clostridium thermocellum. 1.3. Nội dung nghiên cứu: - Thu nhận gen mã hóa endoglucanase D (CelD) từ Clostridium thermocellum bằng phản ứng PCR. - Tạo dòng tế bào E. coli DH5𝛼 mang plasmid nhân dòng tái tổ hợp chứa gen CelD - Tạo dòng E. coli DH5𝛼 mang vector biểu hiện pPIC9K chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D. - Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme endoglucanase D. 2
  15. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Cấu tạo lignocellulose Lignocellulose là một hợp chất hữu cơ phổ biến trong tự nhiên. Hàng năm sản lượng sinh khối thực vật trên Trái Đất khoảng 200 tỉ tấn, trong đó 90% là lignocellulose (Himmel và cộng sự, 2007). Việc chuyển hóa lignocellulose không chỉ quan trọng đối với vòng tuần hoàn vật chất mà còn ảnh hưởng đến việc tái hồi dinh dưỡng cho cây. Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và một số thực vật khác như cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, lignocellulose chủ yếu có trong phụ phế phẩm nông nghiệp, sản phẩm phụ của công nghiệp sản xuất giấy và các chất thải rắn,…Về thành phần cấu tạo, lignocellulose gồm cellulose, hemicellulose và lignin. Số lượng mỗi loại polymer thay đổi tùy loài, tuổi và từng bộ phận khác nhau của cây. Hình 2.1. Tỉ lệ các thành phần trong lignocellulose Nguồn: Pérez và cộng sự (2002) Với thành phần chính là cellulose, lignocellulose là một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất cồn sinh học. Tuy nhiên đây là một hợp chất khó phân hủy trong điều kiện tự nhiên vì nó có cấu trúc đa dạng và phức tạp, bao gồm các thành phần có độ polymer hóa cao và liên kết với nhau một cách chặt chẽ. Do đó muốn phân hủy được chúng, cần phải có một hệ enzyme chuyên biệt, đòi hỏi một hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp hệ enzyme để phân hủy chúng. (Himmel và cộng sự, 2007). 3
  16. Đồ án tốt nghiệp Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản, các sợi này gắn lại với nhau nhờ hemicellulose, tạo thành cấu trúc vi sợi. Hemicellulose và lignin bao bọc xung quanh các vi sợi, tạo nên một cấu trúc vững chắc, bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công của enzyme cũng như các hóa chất khác trong quá trình thủy phân (Charles E. Wyman, 1996). Hình 2.2. Lignocellulose Nguồn: Joseleau và cộng sự (1992) 2.1.1. Cellulose Cellulose là thành phần polymer phổ biến nhất trong tự nhiên, chiếm 50% lượng sinh khối thực vật, giúp mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi. Thành phần cellulose thường không đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật. Người ta thấy rằng, lượng cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây. Cellulose chiếm đến 90% trong sợi bông, 50% trong gỗ, 40 – 50% trong bã mía, 35 – 40% trong rơm lúa mỳ và lúa gạo (Sloneker, J. H., 1971; Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2012). Cellulose là chất rắn màu trắng, không mùi vị, có độ bền nhiệt cao, không tan trong nước và các dung môi thông thường (rượu, ete, benzen,…) nhưng tan trong dung dịch Schweitzer (dung dịch Cu(OH)2 trong NH3). Cellulose bị phân hủy mạnh dưới tác dụng của một số dung dịch axit vô cơ mạnh như: HCl, H2SO4,… và tương đối yếu với các axit hữu cơ (axit acetic, axit formic,…) nhưng bền vững dưới tác dụng của kiềm (Nguyễn Văn Lân, 2004). 4
  17. Đồ án tốt nghiệp Cellulose là polysaccharide có công thức cấu tạo (C6H10O5)n, trọng lượng phân tử khoảng từ 50.103 đến 2,5.106 Da, gồm từ 5000 đến 14000 gốc β - D glucose nối lại với nhau bằng liên kết 𝛽 – 1,4 glucoside tạo thành dạng chuỗi. Các phân tử cellulose liên kết với nhau nhờ lực hút Van der Waals và liên kết hidro tạo thành cấu trúc dạng sợi bền vững. Hình 2.3. Cấu trúc phân tử Cellulose Nguồn: Gardner và cộng sự (1974) Cellulose có cấu trúc sợi dài, đường kính khoảng 3 nm. Nhiều sợi liên kết song song với nhau thành chùm nhờ liên kết hidro giữa các nhóm OH, tạo thành vi sợi. Trong tự nhiên, các vi sợi không đồng nhất, chúng thường tồn tại ở 2 vùng: - Vùng kết tinh: có cấu trúc trật tự rất cao, chặt chẽ như tinh thể, chiếm khoảng ¾ cấu trúc cellulose (Taiz và cộng sự, 2006). Các mạch cellulose liên kết với nhau nhờ liên kết hidro giữa nhóm hydroxyl của mạch này với nhóm hydroxyl của mạch khác, tạo thành một mạng lưới liên kết hydro dày đặc, ngăn cản sự tác động của enzyme ở điều kiện bình thường. - Vùng vô định hình: các mạch liên kết với nhau nhờ lực Van der Waals do đó vùng này có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài (Charles E. Wyman, 1996). Khi gặp nước, chúng dễ bị trương lên, tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme cellulase tấn công dễ dàng, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng. Tuy vậy việc thủy phân cellulose chỉ có thể đạt hiệu quả cao khi tách cellulose khỏi các thành phần khác cùng cấu tạo nên màng tế bào thực vật (Tô Kim Anh và cộng sự, 2010). 5
  18. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4. Cấu trúc cellulose Nguồn: Hsu và cộng sự (1980) 2.1.2. Hemicellulose Hemicellulose là hợp chất polysaccharide chiếm tỷ lệ lớn trên thế giới sau cellulose. Đây là polysaccharide phức tạp, có phân tử khối nhỏ hơn nhiều so với cellulose. Chúng được cấu tạo từ các gốc đường khác nhau như arabinose, galactose, glucose, mannose và xylose. Các gốc đường này liên kết với nhau thông qua các liên kết 𝛽 – 1,4 glucoside, 𝛽 – 1,3 glucoside và 𝛽 – 1,6 glucoside tạo thành cấu trúc dạng mạch nhánh. Sự phân nhánh trong cấu trúc của hemicellulose cũng tạo điều kiện thuận lợi cho dung môi và các chất hóa học tấn công. Cấu trúc của hemicellulose không bền, dễ bị phân hủy bởi acid loãng hoặc kiềm. Khi bị phân hủy, hemicellulose tạo thành các monosaccharide (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2012). 6
  19. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.5. Hemicellulose Nguồn: Fengel và Wegener (1989) 2.1.3. Lignin Lignin là hợp chất cao phân tử có nhiều ở thực vật bậc cao (cả thực vật hạt trần và thực vật hạt kín). Hàm lượng và thành phần lignin thay đổi theo tế bào, mô và theo nhóm thực vật, ở cây gỗ, lignin chiếm từ 20 – 30%... Lignin có nhiệm vụ kết dính và tăng độ bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn chặn các độc tố và sự xâm nhiễm của các vi sinh vật đồng thời cản trở sự tiếp xúc của enzyme cellulase với cellulose (Odier và cộng sự, 1992; Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2012). Do vậy phân hủy lignin sẽ tạo điều kiện cho thủy phân hiệu quả cellulose. Các nghiên cứu đã cho thấy có sự tỉ lệ thuận giữa mức độ lignin bị phân hủy và mức độ thủy phân cellulose ( Kim và cộng sự, 2006). Hình 2.6. Lignin Nguồn: J. Pérez và cộng sự (2002) 7
  20. Đồ án tốt nghiệp Lignin có cấu tạo vô định hình, kị nước và bền với các tác nhân phân giải hóa học và sinh học. Dưới tác dụng của bisulfite natri và H2SO4, lignin bị phân giải tạo ra các hợp chất thơm. Đây là hợp chất được tạo thành từ sự ngưng tụ của các loại rượu khác nhau, trong đó có ba loại rượu cơ bản là conyferylic, synafilic và courmarylic. Các loại rượu này liên kết với nhau bằng liên kết C – C và C – O. 2.2. Enzyme cellulase 2.2.1. Phân loại enzyme Cellulase là enzyme được sinh ra từ nhiều sinh vật khác nhau như nấm mốc, vi khuẩn, thực vật,…có khả năng thủy phân cellulose. Cellulase có thể tồn tại dưới dạng enzyme đơn hoặc phức hệ enzyme còn gọi là cellulosome. Dựa vào cơ chế thủy phân cellulose, enzyme cellulase được Wood và Mc. Cral (1979) chia làm 3 nhóm chủ yếu : endoglucanase, exoglucanase và 𝛽 – glucosidase. - Endoglucanase hay 1,4 𝛽 – D – glucanohydrolase (EC 3.2.1.4): là enzyme tham gia phân giải liên kết 𝛽-1.4 glucoside trong cellulose. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose. Chúng tham gia tác động mạnh đến cấu trúc cellulose vô định hình và tác dụng yếu đến cấu trúc cellulose kết tinh. - Exoglucanase hay 1,4 𝛽 – D – glucan – cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91): cắt đầu không khử của chuỗi cellulose và giải phóng ra các cellobiose. Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose ở dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endoglucanase phân giải chúng. - 𝛽 – D – glucoside glucohydrolase hay 𝛽 – glucosidase (EC 3.2.1.21): enzyme này có tác dụng thủy phân cellobiose và cellodextrine tan tạo thành D – glucose. Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy. Ba enzym này xúc tác cho các giai đoạn nối tiếp nhau nhưng phụ thuộc lẫn nhau của quá trình thủy phân cellulose thành glucose (Cullen và cộng sự, 1992). 8
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược