1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH1

Đồ án tốt nghiệp: Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH1

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định phương pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens trong canh trường lên men; sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens SH1 phân lập từ tuyến trùng diệt sâu EPN bỏ qua quá trình trích ly prodigiosin, không còn chứa tế bào sống. Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO CHẾ PHẨM DIỆT SÂU KHOANG Spodoptera litura TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN Se

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 97

Ngày tạo 10/11/2021 12:19:51 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 2.08 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spo... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO CHẾ PHẨM DIỆT SÂU KHOANG Spodoptera litura TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN Serratia marcescens SH1 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN HOÀI HƢƠNG Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ NGỌC DUNG MSSV: 1211100056 Lớp: 12DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện luận văn Lê Thị Ngọc Dung
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trong suốt quãng đời con đi học, chƣa một ngày nào bố mẹ thôi lo lắng và chăm sóc cho con, nhƣng con không mấy khi biểu hiện hay đơn giản là câu nói “con thƣơng bố mẹ”. Nhân lúc này đây, con xin đƣợc ghi khắc công ơn dƣỡng dục của bố mẹ, có những lúc con vô tình làm bố mẹ buồn, nhƣng cả hai đã không bỏ mặc con với khó khăn mà đã luôn dõi theo, giúp đỡ và sát cánh bên con để con đƣợc trƣởng thành đến ngày hôm nay. Bố mẹ là chỗ dựa tinh thần vững chắc mỗi khi con gặp phải vấn đề khó khăn; là động lực để con đứng dậy sau mỗi lần vấp ngã; là bách khoa toàn thƣ giúp con giải quyết mọi vấn đề. Và sẽ luôn là nhƣ vậy cho đến mãi sau này. Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý thầy cô trƣờng đại học Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức quý giá ngay từ những ngày đầu em bƣớc vào giảng đƣờng đại học. Đặc biệt, em xin đƣợc chân thành biết ơn cô Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời thầy đáng kính, luôn quan tâm và tận tình chỉ dạy để em có thể hoàn thành đồ án. Và quan trọng hơn là cô đƣa ra những lời khuyên và chỉ dạy em cách đối mặt với những va chạm trong cuộc sống, và đó sẽ là những trang vàng trong hành trang sau này của em. Em cũng xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai đã quan tâm và có những hƣớng dẫn đúng lúc khi em đang tập nuôi sâu khoang và cô là ngƣời cho con nguồn nấm bệnh trong phòng thí nghiệm. Em cũng xin chân thành cảm ơn cô Đỗ Thị Tuyến đã hết lòng giúp đỡ, hỗ trợ em về địa điểm quét phổ UV – vis. Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành, thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm. Cảm ơn tất cả các bạn lớp 12DSH01 và 12DSH02 đã luôn động viên, giúp đỡ mình trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Cảm ơn anh Nguyễn Hoàng Anh Kha, anh Lê Quốc Vũ, bạn Vũ Hoàng Minh Ngọc, bạn Kiều Nguyễn Phƣơng Vy, bạn Phan Thị Gìn cùng các em Trƣơng Hoài Nguyên lớp 13DSH03, em Nguyễn Thị
  4. Đồ án tốt nghiệp Băng Khanh, em Nguyễn Trung Hậu, em Lê Thị Ngọc Hân đã cùng đồng hành và sát cánh trong suốt những ngày làm đồ án tố nghiệp. Xin chân thành cảm ơn! Tp.Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2016 SVTH: Lê Thị Ngọc Dung
  5. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................... i DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................v MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 Chƣơng 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................4 1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học ......................................................................4 1.1.1 Khái niệm về thuốc trừ sâu sinh học ................................................................4 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học hiện nay ...........................................4 1.1.3 Những mặt ƣu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học ............................5 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens. ............................................................7 1.2.1 Lịch sử phát hiện ................................................................................................7 1.2.2 Phân loại khoa học của Serratia marcescens. ....................................................8 1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens. ...................................................................8 1.2.3.1 Đặc điểm sinh lí ..............................................................................................9 1.2.3.2 Đặc điểm sinh hóa ...........................................................................................9 1.2.3.3 Đặc điểm phân bố..........................................................................................11 1.3 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens. ..................................11 1.3.1 Sắc tố ................................................................................................................11 1.3.2 Biosurfactants ...................................................................................................12 1.3.3 Acid béo ...........................................................................................................13 1.3.4 Enzyme .............................................................................................................13 1.3.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens. .........................................................13 1.4 Giới thiệu về Prodigiosin ....................................................................................14 1.4.1 Khái niệm về prodigiosin .................................................................................14 1.4.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin ..............................................................15 1.4.3 Hoạt động sinh học của prodigiosin .................................................................18 ______________________________i______________________________
  6. Đồ án tốt nghiệp 1.5 Tiềm năng tạo chế phẩm trừ sâu từ prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens. ...............................................................................................................19 1.6 Cơ chế tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens.......................................20 1.7 Một số nghiên cứu trên thế giới ..........................................................................25 1.7.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens .....................................................25 1.7.2 Tình hình nghiên cứu prodigiosin ....................................................................25 1.8 Khái quát về sâu khoang Spodoptera litura ........................................................27 1.8.1 Đặc điểm hình thái ...........................................................................................27 1.8.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái ........................................................................28 1.8.3 Thiên địch .........................................................................................................29 1.8.4 Biện pháp phòng trừ .........................................................................................29 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................30 2.1 Thời gian, địa điểm .............................................................................................30 2.1.1 Thời gian ..........................................................................................................30 2.1.2 Địa điểm ...........................................................................................................30 2.2 Vật liệu – thiết bị – hóa chất ..............................................................................30 2.2.1 Nguồn vi sinh vật .............................................................................................30 2.2.1.1 Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens ...........................................................30 2.2.1.2 Nguồn vi khuẩn chỉ thị ..................................................................................30 2.2.1.3 Nguồn nấm bệnh ...........................................................................................31 2.2.1.4 Nguồn sâu khoang Spodoptera litura ...........................................................31 2.2.2 Môi trƣờng nuôi cấy và hóa chất .....................................................................31 2.2.3 Dụng cụ, thiết bị ...............................................................................................31 2.3 Bố trí thí nghiệm .................................................................................................33 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm ......................................................37 2.4.1 Phƣơng pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm ...............................................37 2.4.2 Phƣơng pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens ..................................37 2.4.2.1 Phƣơng pháp xử lí acid .................................................................................37 2.4.2.2 Phƣơng pháp xử lí nhiệt ................................................................................38 ______________________________ii______________________________
  7. Đồ án tốt nghiệp 2.4.3 Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính sinh học.........................................................39 2.4.3.1 Phƣơng pháp định tính enzyme .....................................................................39 2.4.3.2 Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn ..............................................43 2.4.3.3 Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng nấm .................................................46 2.4.3.4 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phƣơng pháp quét lá ...................................48 2.4.4 Khảo sát thời gian bảo quản canh trƣờng lên men sau xử lí ............................49 2.4.5 Khảo sát hiệu lực diệt sâu invivo .....................................................................50 2.4.6 Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm ............................................................51 Chƣơng 3. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN ......................................................................53 3.1 Xác định thời gian, độ pH tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn Serratia marcescens từ phƣơng pháp xử lí acid HCl 1N ............................................................................53 3.2 Xác định thời gian, nhiệt độ tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn Serratia marcescens từ phƣơng pháp xử lí nhiệt độ ..................................................................................60 3.3 Khả năng tiết enzyme ngoại bào ........................................................................62 3.3.1 Khả năng giữ lại enzyme ngoại bào từ phƣơng pháp xử lí acid ......................62 3.3.2 Khả năng giữ lại enzyme ngoại bào từ phƣơng pháp xử lí nhiệt độ ................66 3.4 Khả năng kháng khuẩn ........................................................................................68 3.4.1 Khả năng kháng khuẩn của dịch canh trƣờng đã xử lí bằng phƣơng pháp xử lí acid ............................................................................................................................68 3.5 Hoạt tính kháng nấm ...........................................................................................69 3.5.1 Khả năng kháng nấm của dịch canh trƣờng đã xử lí bằng phƣơng pháp xử lí acid ............................................................................................................................69 3.6 Hiệu lực diệt sâu ..................................................................................................71 3.6.1 Hiệu lực diệt sâu từ canh trƣờng lên men đã qua xử lí ....................................71 3.6.2 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm .........................................................................73 3.7. Xác định thời gian bảo quan canh trƣờng đã xử lí .............................................75 3.8. Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm .............................................................79 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................83 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................85 ______________________________iii______________________________
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens .................................... 10 Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) ... ....................................................................................................................................... 17 Bảng 1.3. Một số bằng sáng chế về prodigiosin .......................................................... 26 Bảng 3.1 Prodigiosin unit/tế bào của chủng SH1. ........................................................ 60 Bảng 3.2. Khả năng bảo toàn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng đƣợc xử lí bằng phƣơng pháp xử lí acid. ........................................................................................ 64 Bảng 3.3. Khả năng bảo toàn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng đƣợc xử lí bằng phƣơng pháp xử lí nhiệt........................................................................................ 66 Bảng 3.4. Khả năng kháng khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus của hoạt chất prodigiosin trong canh trƣờng đã xử lí. ......................................................... 68 Bảng 3.5. Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp. của canh trƣờng đã xử lí ............................. 70 Bảng 3.6. Tỉ lệ tử vong của sâu khoang tuổi 3. ............................................................ 73 Bảng 3.7 Tỉ lệ tử vong của sâu khoang tuổi 3 .............................................................. 75 Bảng 3.8. Tỉ lệ prodigiosin còn lại sau 7 ngày bảo quản (%)....................................... 82 ______________________________iv______________________________
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens ......... 8 Hình 1.2 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) ................................................................................................................ 9 Hình 1.3. Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất prodigiosin (Krishna, 2008) ....... 16 Hình 1.4. Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) ........................................ 17 Hình 1.5. Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira,2009) ...... 19 Hình 1.6. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) .................................. 22 Hình 1.7. Quá trình sinh tổng hợp prodigiosin (Caspi R, 2014) .............................. 24 Hình 1.8. Vòng đời của sâu khoang Spodoptera litura ........................................... 28 Hình 2.1 Quy trình khảo sát khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn S.mercescens và hoạt tính diệt sâu của prodigiosin trong canh trƣờng đã xử lí. ............................... 34 Hình 2.2 Quy trình thử nghiệm khảo sát thời gian tiêu diệt tế bào vi khuẩn S.mercescens ............................................................................................................. 35 Hình 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học của canh trƣờng vi khuẩn sau khi xử lí acid ......................................................................................................................... 36 Hình 2.4 Quy trình khảo sát chế phẩm diệt sâu từ prodigiosin ................................ 36 Hình 2.5 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch môi trƣờng Lipit .......................... 40 Hình 2.6 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trƣờng Casein ......... 41 Hình 2.7 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trƣờng huyền phù chitin 1%. .................................................................................................................. 43 Hình 2.8 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức kháng khuẩn trên đĩa thạch môi trƣờng NA. ............................................................................................................................ 45 Hình 2.9 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA ............................ 47 Hình 3.1. Khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens SH1 tại các thời điểm 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ tại pH 1 và pH 2 ............................................................ 56 ______________________________v______________________________
  10. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Giá trị OD499 của prodigiosin trong canh trƣờng xử lí acid tại từng nghiệm thức ............................................................................................................... 57 Hình 3.3 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) trong từng nghiệm thức ............................................................................................................... 59 Hình 3.4 Canh trƣờng đã xử lí acid đƣợc trang trên đĩa môi trƣờng PGA, sau 24h ủ tối. .............................................................................................................................. 61 Hình 3.5. Khả năng bảo toàn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng S.marcescens đã xử lí ................................................................................................ 64 Hình 3.6. Khả năng bảo toàn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng lên men đã xử lí ........................................................................................................................... 66 Hình 3.7 Khả năng kháng khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus của hoạt chất prodigiosin trong canh trƣờng lên men đã xử lí. ....................................... 68 Hình 3.8 Khả năng kháng nấm Fusarium sp. của canh trƣờng đã xử lí so với đối chứng ......................................................................................................................... 70 Hình 3.9. Nồng độ pha loãng cho thí nghiệm hiệu lực diệt sâu: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. ................................................................................................................ 72 Hình 3.10 Tỉ lệ sâu chết bởi canh trƣờng đã xử lí acid ........................................... 72 Hình 3.11 Tỉ lệ sâu chết theo thời gian do prodigiosin trong canh trƣờng S.marcescens đã xử lí acid ........................................................................................ 73 Hình 3.12 Chế phẩm và các nồng độ pha loãng:10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và10-6 .... 74 Hình 3.13. Tỉ lệ sâu chết cho chế phẩm theo thời gian ............................................ 75 Hình 3.14. Tỉ lệ prodigiosin còn lại trong canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn S.marcescens đã xử lí ở môi trƣờng ngoài sáng........................................................ 76 Hình 3.15. Tỉ lệ prodigiosin còn lại trong canh trƣờng đã xử lí ở môi trƣờng tối ... 77 Hình 3.16. So sánh tỉ lệ prodigiosin còn lại sau 7 ngày bảo quản, ở nhiệt độ 2oC .. 78 Hình 3.17. So sánh tỉ lệ prodigiosin còn lại sau 7 ngày bảo quản, ở nhiệt độ phòng ................................................................................................................................... 78 Hình 3.18. So sánh tỉ lệ prodigiosin còn lại sau 7 ngày bảo quản, ở điều kiện ngoài trời ............................................................................................................................. 79 ______________________________vi______________________________
  11. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.19. Chế phẩm trƣớc và sau 7 ngày bảo quản. ............................................... 80 Hình 3.20. Trích ly lỏng – lỏng chế phẩm................................................................ 80 Hình 3.21. Tỉ lệ prodigiosin còn lại trong chế phẩm sau 7 ngày theo dõi ở các điều kiện môi trƣờng: -18oC, 2oC, nhiệt độ phòng, nhiệt độ ngoài trời và nhiệt độ cao (60oC) ........................................................................................................................ 82 ______________________________vii______________________________
  12. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Các sản phẩm xuất khẩu là mặt hàng nông nghiệp của Việt Nam đang dần có chỗ đứng trên thị trƣờng quốc tế, nhƣ: Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc. Tuy nhiên, việc sản xuất và thu hoạch các loại nông sản thiếu tính chuyên nghiệp và khoa học, lạm dụng các chất bảo vệ thực vật hóa học gây tồn đọng dƣ lƣợng thuốc trong sản phẩm – là lí do làm sản phẩm Việt khó có chỗ đứng ở các thị trƣờng lớn. Thêm vào đó là tình hình thời tiết những năm trở lại đây có chuyển biến phức tạp do hiện tƣợng thời tiết El Niño đã làm ảnh hƣởng đến sự phát triển của cây trồng và sự xuất hiện của các loài côn trùng gây hại. Để hạn chế sự tấn công của côn trùng lên rau màu, ngƣời nông dân đã dùng thuốc hóa học với liều lƣợng quá mức cho phép, vô tình tạo cho côn trùng khả năng kháng thuốc, làm cho tình hình sâu hại trở nên nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Trong đó, sâu khoang Spodoptera litura là loài sâu đa thực và gây hại nặng đến màu màng. Chúng có thể phá hại đến 290 loại cây trồng thuộc 99 họ thực vật bao gồm các loại rau đậu, cây thực phẩm, cây công nghiệp, cây lƣơng thực, cây phân xanh,... có khả năng kháng thuốc hóa học nếu ngƣời dùng lạm dụng quá nhiều thuốc trừ sâu hóa học không đúng cách. Vì vậy, xu hƣớng sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đã và đang trở nên rất hữu ích vì tiết kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, an toàn cho sức khỏe con ngƣời, đồng thời không gây ô nhiễm môi trƣờng. Trong các biện pháp sinh học đƣợc sử dụng hiện nay thì các loại thuốc phòng trừ sinh học có nguồn gốc từ hợp chất thứ cấp đang chiếm đƣợc sự chú ý của ngƣời dùng, vì khả năng tiêu diệt sâu bệnh mà không gây độc hại cho con ngƣời và môi trƣờng xung quanh. Tuy nhiên, các sản phẩm trên chƣa thật sự nổi bật. Những năm gần đây, việc trích ly đƣợc hợp chất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens có khả năng diệt sâu đã mở ra một triển vọng mới trong việc tạo chế phẩm trừ sâu sinh học là hợp chất thứ cấp của vi sinh vật. Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay chỉ có một vài đề tài nghiên cứu về hợp chất thứ cấp này mà chƣa có nghiên cứu nào về ứng dụng tạo chế ______________________________1______________________________
  13. Đồ án tốt nghiệp phẩm diệt sâu từ hợp chất prodigiosin. Vì những lợi ích của hợp chất thứ cấp prodigiosin, ngƣời tiến hành đề tài đã chọn hƣớng cho đồ án tốt nghiệp là: “Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH1”. 2. Mục đích nghiên cứu Sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu chứa prodigiosin. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Xác định phƣơng pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens trong canh trƣờng lên men Sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens SH1 phân lập từ tuyến trùng diệt sâu EPN bỏ qua quá trình trích ly prodigiosin, không còn chứa tế bào sống. 4. Các kết quả cần đạt đƣợc Khảo sát đƣợc khả năng sử dụng acid để diệt tế bào (ảnh hƣởng của chế độ xử lý acid lên tế bào, prodigiosin và enzyme trong dịch nuôi cấy) Khảo sát đƣợc khả năng xử lý nhiệt để diệt tế bào (ảnh hƣởng của chế độ xử lý acid lên tế bào, prodigiosin và enzyme trong dịch nuôi cấy). Chọn chế độ xử lý thích hợp (tế bào chết, nồng độ prodigiosin cao, còn giữ đƣợc hoạt tính enzyme). Khảo sát đƣợc hoạt tính của dịch nuôi cấy sau xử lý: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng sâu Spodoptera litura tuổi …) Khảo sát đƣợc hiệu lực diệt sâu của chế phẩm từ dịch nuôi cấy xử lý acid Khảo sát đƣợc sự ảnh hƣởng của các điều kiện bảo quản lên chế phẩm. 5. Kết cấu của đồ án Đồ án “Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH1 phân lập từ nguồn tuyến trùng EPN” đƣợc trình bày gồm 3 chƣơng: 1. Tổng quan tài liệu ______________________________2______________________________
  14. Đồ án tốt nghiệp Giới thiệu về định nghĩa thuốc trừ sâu sinh học, phân loại loài cũng nhƣ các đặc trƣng sinh hóa của vi khuẩn Serratia marcescens, tính chất đặc trƣng của hợp chất thứ cấp prodigiosin, giới thiệu về sâu khoang. 2. Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm Giới thiệu về các phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong quá trình làm đề tài. Cách bố trí các nghiệm thức trong từng thí nghiệm. 3. Kết quả thảo luận Trình bày chi tiết các kết quả đạt đƣợc của từng thí nghiệm đƣợc tiến hành. ______________________________3______________________________
  15. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học 1.1.1 Khái niệm về thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học là những chế phẩm có nguồn gốc sinh học, đƣợc làm từ những nguyên liệu rất dễ kiếm nhƣ gừng, tỏi, ớt, xả, các loại lá, các chủng nấm vi sinh, hợp chất thứ cấp của vi sinh vật có hiệu quả cao trong việc phòng trừ các loại sâu bệnh nhƣng lại rất an toàn với sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng đất. (Nguyễn Văn Tấn, 2004) 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học hiện nay trên thị trường Nhƣ chúng ta đã biết, các thuốc trừ sâu hóa học có ƣu điểm rõ rệt là hiệu quả diệt sâu nhanh nhƣng có nhƣợc điểm quan trọng là có độ độc cao với ngƣời và các động vật có ích (trong đó có các loài thiên địch), gây ô nhiễm môi trƣờng. Vì vậy, do yêu cầu bảo vệ sức khỏe con ngƣời và sự trong sạch của môi trƣờng, các thuốc trừ sâu hóa học cần đƣợc hạn chế sử dụng dần và thay vào đó là các thuốc trừ sâu sinh học. Hiện nay, trên thị trƣờng thuốc bảo vệ thực có có 7 loại thuốc trừ sâu sinh học: 1. NPV là chế phẩm trừ sâu hoạt lực cao, gồm 2 loại V- Ha và V- S1. Thuốc chuyên dùng để diệt trừ sâu xanh, sâu khoang, sâu xanh đốm trắng, sâu tơ trên các loại cây rau màu, cây công nghiệp, cây ăn quả với hiệu quả rất cao. NPV có nồng độ đặc hơn so với các loại thuốc khác, sử dụng tƣơng đối dễ dàng: chỉ cần hoà thuốc vào bình và phun bình thƣờng với liều lƣợng 1,0- 1,2 kg/ha. 2. Chế phẩm Bt: Gồm 2 loại: dạng sữa 4.000 IU/ml và dạng bột Biotox 16.000 IU/mg chuyên dùng trừ sâu tơ, sâu xanh hại rau, sâu kéo ra lá, các loại sâu thuộc họ Leptidopera. 3. Chế phẩm M&B có 2 loại: Metarhizium và Beauveria. Metarhizium anisopliae 1,6- 2,5 x 109Bt/gr bọ hại dừa. Thử nghiệm tại Đà Nẵng, Phú Yên đạt hiệu quả tới 86,5%. Dạng nấm xanh đƣợc dùng để trừ rầy, bọ xít trên lúa và cây ăn quả ______________________________4______________________________
  16. Đồ án tốt nghiệp đạt 70- 90%, dạng nấm trắng đạt 50- 85%. Chế phẩm Beauveria chuyên dùng để trị sâu róm thông và sâu đo nâu hại bồ đề với hiệu quả tiêu diệt sâu tới gần 87%. TS. Nguyễn Văn Vấn cho biết: “Loại thuốc này có thể sử dụng để tiêu diệt sâu róm hại thông đang xảy ra tại Nghệ An hiện nay”. 4. Chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma 3- 3,2 x 109Bt/gr trừ bệnh hại cây trồng nhƣ bệnh lở cổ rễ bắp cải, nấm đất đạt 41,5- 60%. 5. Chế phẩm tuyến trùng EPN Biostar 15- 20 x 106 IJs trừ sâu xám hại thuốc lá, đặc biệt là mía đạt hiệu quả khá cao. Hiện những sản phẩm đầu tiên đã đƣợc đƣa vào ứng dụng để diệt trừ sâu xám hại thuốc lá tại Ba Vì (Hà Tây), bọ hung hại mía tại Thạch Thành (Thanh Hoá). 6. Chế phẩm hoá sinh Momosertatin (MM) 2IU/lít trừ các loại sâu hại rau màu đạt 45- 50%. 7. Chế phẩm Ditacin 8% và Ketomium 1,5 x 106 Cfu/g, trừ bệnh hại trên cây ăn quả, cây lâu năm. (Nguyễn Văn Tấn, 2004) 1.1.3 Những mặt ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học. Nhìn chung, thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ vi sinh vật có nhiều ƣu điểm so với thuốc trừ sâu hóa học, nhƣ:  Ƣu điểm nổi bật nhất của thuốc trừ sâu sinh học là ít độc với ngƣời và môi trƣờng. Các chế phẩm vi sinh vật dùng trừ sâu và dầu thực vật hầu nhƣ không độc với ngƣời và các sinh vật có ích.  Ít độc với các loài thiên địch nên thuốc sinh học bảo vệ đƣợc sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu hại), ít gây tình trạng bùng phát sâu hại.  Ít độc với ngƣời và mau phân hủy trong tự nhiên, các thuốc sinh học ít để lại dƣ lƣợng độc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao nhƣ các loại rau, chè… Muốn có nông ______________________________5______________________________
  17. Đồ án tốt nghiệp sản sạch và an toàn, một biện pháp quan trọng là sử dụng các thuốc sinh học trừ sâu.  Ngoài ra, các yếu tố sinh học trừ sâu nhƣ các vi sinh vật và thực vật thƣờng có sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc, vì vậy nguồn khai thác rất dễ dàng và hầu nhƣ vô tận. Đồng thời với các chế phẩm đƣợc sản xuất theo quy mô công nghiệp, hiện nay ngƣời ta vẫn có thể dùng các phƣơng pháp chế biến thô sơ để sử dụng. Có thể ra đồng thu thập các sâu bị chết vì nấm bệnh, nghiền nát trong nƣớc rồi phun lên cây để trừ sâu. Các cây thuốc lá, thuốc lào, hạt xoan, rễ dây thuốc cá băm nhỏ và đập nát ngâm lọc trong nƣớc để phun cũng rất có hiệu quả. Bên cạnh những ƣu điểm vƣợt trội vừa nêu ở trên đây, thuốc trừ sâu bệnh hại sinh học vẫn còn những điểm hạn chế nhƣ:  Các thuốc vi sinh thƣờng thể hiện hiệu quả diệt sâu tƣơng đối chậm hơn so với thuốc hóa học.  Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thƣờng yêu cầu điều kiện cũng chặt chẽ hơn. Nhƣng so với các ƣu điểm to lớn thì các nhƣợc điểm trên đây của thuốc sinh học là rất nhỏ và hoàn toàn có thể khắc phục đƣợc. Vì vậy, thuốc trừ sâu sinh học ngày càng đƣợc khai thác sử dụng nhiều. Ở nƣớc ta, ngoài các chế phẩm Bt đã đƣợc biết đến tƣơng đối lâu, hiện nay có nhiều chế phẩm mới đã đƣợc đăng ký sử dụng. Yêu cầu ngày càng có nhiều nông sản và thực phẩm an toàn phục vụ đời sống cũng là điều kiện quan trọng thúc đẩy sự phát triển của các thuốc sinh học. ______________________________6______________________________
  18. Đồ án tốt nghiệp 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens 1.2.1 Lịch sử phát hiện Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm đƣợc nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trƣớc công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì. Sau đó, vào năm 332 trƣớc công nguyên, những ngƣời lính trong quân đội Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dƣờng nhƣ có “máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tƣợng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng. Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969), đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố nhƣ vậy đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch. Trong bóng tối và sự ẩm ƣớt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh đƣợc sử dụng trong Thánh lễ thƣờng xuyên bị nhiễm Serratia marcescens, tuy nhiên, điều này lại khiến nhiều ngƣời nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ (Gillen và Gibbs, 2011). Bizio, một dƣợc sĩ ở Padua (Italya), là ngƣời đầu tiên phát hiện và đặt tên Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để ở nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều đƣợc bao phủ bởi một lớp vi sinh vật màu đỏ. Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia, theo tên nhà vật lý nổi tiếng ngƣời Italya đã phát minh ra tàu hơi nƣớc là Serrati, tên loài marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta. Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens nhƣ một loại nấm, do ông nhìn thấy những đốm đỏ dƣới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà khoa học đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn. ______________________________7______________________________
  19. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2 Phân loại khoa học của Serratia marcescens. Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia là Serratia marcescens. Theo Bizio (1823), Serratia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau:  Giới: Bacteria  Ngành: Proteobacteria  Lớp: Gramma proteobacteria  Bộ: Enterobacteriales  Họ: Enterobacteriaceae  Chi: Serratia  Loài: Serratia marcescens 1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia marcescens có hình que, đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40oC và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). Hình 1.1. Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens ______________________________8______________________________
  20. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) 1.2.3.1 Đặc điểm sinh lí Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar đƣợc mô tả là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng chính là sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens thƣờng bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012). Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trƣờng thạch, tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5 – 30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học. 1.2.3.2 Đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trƣờng hiếu khí và kỵ khí. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lƣợng và nhờ có các enzyme nhƣ superoxide dismutase, calatas, peroxides,… bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi trƣờng oxy hóa. Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase (Giri và cộng sự, 2004). Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease, protease và haemolysin ______________________________9______________________________
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược