1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Sản xuất nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu

Đồ án tốt nghiệp: Sản xuất nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm chọn môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp. và đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng của chế phẩm nấm Paecilomyces sp. Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SẢN XUẤT NẤM PAECILOMYCES SP. ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG MEILODOGYNE SP. GÂY HẠI TRÊN CÂY HỒ TIÊU. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn:

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 100

Ngày tạo 10/11/2021 12:18:04 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 3.40 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Sản xuất nấm Paecilomyces sp. để... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SẢN XUẤT NẤM PAECILOMYCES SP. ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG MEILODOGYNE SP. GÂY HẠI TRÊN CÂY HỒ TIÊU. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện : PHAN ÁNH NGÂN MSSV: 1211100132 Lớp: 12DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2016.
  2. LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân em dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai – giảng viên Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Đề tài được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Tất cả các số liệu, hình ảnh, các kết quả là nghiên cứu hoàn toàn trung thực. Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu có phát hiện sự gian lận em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tp. HCM, ngày 15 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện Phan Ánh Ngân i
  3. LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập tại trường đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường. Và đặc biệt, trong học kỳ này. Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của các thầy cô thì em nghĩ bài thu hoạch này của em rất khó có thể hoàn thiện được. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy. Bài báo cáo đồ án tốt nghiệp thực hiện trong khoảng thời gian 3 tháng. Bước đầu đi vào thực tế của em còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ. Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô và các bạn học cùng lớp để kiến thức của em trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn. Em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô của trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM, đặc biệt là TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường đã tạo điều kiện cho em để em có thể hoàn thành tốt bài báo cáo đồ án tốt nghiệp này. Và em cũng xin chân thành cám ơn các thầy cô ở phòng thí nghiệm, các anh chị, các bạn đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành báo cáo đồ án tốt nghiệp. Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, cũng như là trong quá trình làm bài báo cáo, khó tránh khỏi sai sót đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của Thầy/Cô để em học thêm được nhiều kinh nghiệm và áp dụng vào công việc sắp tới. Em xin chân thành cảm ơn ! ii
  4. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ..........................................................................................................i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. ii MỤC LỤC .................................................................................................................. iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................. vi DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. viii ĐẶT VẤN ĐỀ ..............................................................................................................1 MỤC ĐÍCH ..................................................................................................................2 NỘI DUNG...................................................................................................................2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................3 Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp. .....................................................................3 1.1.1. Phân loại khoa học .............................................................................................3 1.1.2. Đặc điểm hình thái .............................................................................................4 1.1.3. Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces..........................................................5 1.1.4. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng ..............................................................................................................................6 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. .................7 Tổng quan về tuyến trùng Meloidogyne sp. gây bệnh bướu rễ trên cây hồ tiêu 11 1.2.1. Tổng quan về tuyến trùng ký sinh thực vật .....................................................11 1.2.2. Phân loại khoa học ...........................................................................................14 Các nghiên cứu nước ngoài về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces sp. trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng...................................................................19 Các nghiên cứu trong nước về nhân nuôi và sử dụng Paecilomyces sp. trong phòng trừ tuyến trùng hại cây ....................................................................................22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................24 Thời gian và địa điểm nghiên cứu.......................................................................24 iii
  5. Vật liệu nghiên cứu, thiết bị và hóa chất ............................................................24 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................24 2.2.2. Thiết bị..............................................................................................................24 2.2.3. Các loại môi trường sử dụng ............................................................................25 Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................26 2.3.1. Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse sp. ...........................................................27 2.3.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng .....................................................28 2.3.3. Các phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật ...................................28 2.3.4. Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) 29 2.3.5. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các loại môi trường nhân sinh khối (theo Lê Hữu Phước, 2009) ...............................................................30 2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp..........................................................................................................30 2.3.7. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ................................................................................................................................31 2.3.8. Khảo sát khả năng kí sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne sp. của nấm Paecilomyces sp..........................................................................................................35 2.3.9. Đánh giá tác động của chế phẩm nấm Paecilomyces sp. trong việc phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. trên cây hồ tiêu ............................................................36 2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu..............................................................................37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................38 Kết quả hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp...................................................38 Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm, trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp..........................................................................................................39 iv
  6. 3.2.1. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp. .....................................................................................................................................39 3.2.2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của Paecilomyces sp. .....................................................................................................................................41 3.2.3. Khảo sát khả năng đồng sinh trưởng của nấm Trichoderma sp. và Paecilomyces sp..........................................................................................................43 Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển của nấm Pacilomyces sp. (môi trường lỏng) .............................................44 3.3.1. Khảo sát môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp..........................................................................................................44 3.3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển của nấm Paecilomyces sp. (môi trường rắn) ........................................49 Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces sp..........................................................................................................52 3.4.1. Trong điều kiện phòng thí nghiệm ...................................................................52 3.4.2. Trên đồng ruộng ...............................................................................................55 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................58 Kết luận................................................................................................................58 Kiến nghị .............................................................................................................58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................59 Tài liệu tiếng việt ........................................................................................................59 Tài liệu tiếng anh ........................................................................................................59 Tài liệu từ internet ......................................................................................................61 PHỤ LỤC .....................................................................................................................1 v
  7. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CDB: Czapeck – Dox. CMB: Complete Media NSC: ngày sau cấy. NT: nghiệm thức. PDA: Potato D – Glucose Agar SDAY1: Sabourand dextrose Yeast SDAY3: Sabourand dextrose Yeast bổ sung khoáng. vi
  8. DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................31 Bảng 2. 2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thuốc trừ sâu .......................................32 Bảng 2. 3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thuốc trừ nấm .............................................33 Bảng 2. 4. Bố trí thí nghiệm khả năng đồng sinh trưởng của Trichoderma sp. và Paecilomyces sp..........................................................................................................35 Bảng 2. 5. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Paecilomyces sp. .....37 Bảng 3. 1. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường trừ nấm. .40 Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp..........................................................................................................40 Bảng 3. 3. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. ....................................................41 Bảng 3. 4. Tỷ lệ khuẩn lạc bị ức chế ..........................................................................41 Bảng 3. 5. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. ....................................................43 Bảng 3. 6. Đường kính tản nấm Trichoderma sp. khi cấy đồng thời với nấm Paecilomyces sp..........................................................................................................43 Bảng 3. 7. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. sau thời gian nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc. ...........................................................................................................44 Bảng 3. 8. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. tính theo logarit ............................46 Bảng 3. 9. Số lượng bào tử sau 14 ngày nuôi cấy ....................................................51 Bảng 3. 10. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay ngô mảnh và gạo tấm........................................................................................................................52 Bảng 3. 11. Tỷ lệ phần trăm số tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị nấm Paecilomyces sp. ký sinh. ...........................................................................................53 Bảng 3. 12. Đánh giá cấp hại của tuyến trùng trên cây hồ tiêu. ................................55 vii
  9. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces sp. được nuôi nấy trên môi trường PDA. ........4 Hình 1.2. Nấm Paecilomyces sp, được chụp dưới kính hiển vi ..................................5 Hình 1.3. Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin) ........................................................6 Hình 1.4. Cấu tạo tuyến trùng ký sinh thực vật .........................................................15 Hình 1.5. Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp. .....................................................17 Hình 1.6. Một số chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp. phòng trừ tuyến trùng. .........22 Hình 3.1. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA. ...........................................38 Hình 3.2. Tản nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học. (A: Actara 25WG; B: Sherpa 25EC; C: Plutel 1,8 EC; D: Oshin 20WP; E: đối chứng) ..................................................................................................39 Hình 3.3. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học.. (A: Antracol 70WP; B: Cup 2,9 SL; C: Saizole 5SC; D: Carbenzin 50WP; E: đối chứng) ..................................................................................................42 Hình 3.4. Đĩa nấm khi cấy đồng thời Trichoderma sp. và Paecilomyces sp. ...........44 Hình 3.5. Dịch nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường. (A: Môi trường CDB; B: Môi trường CMB; C: Môi trường SDAY1; D: Môi trường SDAY3). .....................................................................................................................45 Hình 3.6. Mật độ bào tử tính theo logarit trên bốn loại môi trường lỏng. ................48 Hình 3.7. Hình nấm Paecilomyces sp. được nuôi cấy trên 4 loại môi trường rắn(A: môi trường ngô mảnh, B: môi trường gạo tấm, C: môi trường lúa, D: môi trường cám) ............................................................................................................................50 Hình 3.8. Mật độ tế bào sau 14 ngày lên men rắn trên 4 loại môi trường. ..............51 Hình 3.9. Nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay. .............................................52 Hình 3.10. Tỷ lệ tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị chết ở các ngày sau khi lây nhiễm. ........................................................................ Error! Bookmark not defined. Hình 3.11. Nấm Paecilomyces sp. tấn công con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne sp.; (A, B: con cái tuyến trùng trước khi lây nhiễm nấm; C, E: con cái tuyến trùng bị lây nhiễm nấm được soi dưới kính hiển vi; D, F: con cái và con cái viii
  10. mang túi trứng của tuyến trùng bị nhiễm nấm Paecilomyces sp. soi dưới kính hiển vi sau khi nhuộm Methylene blue). ............................................................................54 Hình 3.12. Người dân pha chế phẩm Paecilomyces sp. tưới vào gốc cây hồ tiêu ....56 Hình 3.13. Trước khi tưới. .........................................................................................57 Hình 3.14. Sau khi tưới. .............................................................................................57 ix
  11. Đồ án tốt nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực chính của Việt Nam. Hồ tiêu (piper nigrumL.) được xem là “vua của các loại gia vị” và trở thành sản phẩm nông nghiệp quan trọng nhất của Việt Nam. Năm 2015, mặc dù chưa có thống kê đầy đủ, nhưng dự báo diện tích hồ tiêu cả nước đã vượt con số 100.000 ha (Theo số liệu Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam, 2015). Tuy nhiên, cũng như các ngành nông nghiệp khác, ngành hồ tiêu cũng phải đối mặt với các vấn đề về thiệt hại năng suất gây nên do dịch hại. Do đó, bảo vệ thực vật là một trong những phần rất quan trọng trong việc nâng cao năng suất hồ tiêu vì dịch hại được xem như nguyên nhân chính làm giảm năng suất và chất lượng hồ tiêu (Trịnh Thị Thu Thủy và ctv, 2012). Bên cạn các loại bệnh hại, tuyến trùng là dịch hại nguy hiểm trên cây hồ tiêu. Theo kết quả điều tra của Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp miền Nam thì tuyến trùng xuất hiện phổ biến ở tất cả các vùng trồng tiêu trong cả nước với mức độ gây hại cao. Việc tìm ra giải pháp để kiếm soát tác nhân tuyến trùng gây hại rất quan trọng. Hiện nay, đa số nông dân thường sử dụng các loại thuốc hóa học để phòng trừ. Tuy có tác dụng nhanh và hiệu quả nhưng các loại thuốc hóa học lại gây ra tác động xấu đối với môi trường, để lại tồn dư trong nông sản, tăng tính kháng của sâu bệnh làm cho việc phòng trừ trở nên khó khăn hơn. Vì vậy, hiện nay, các tác nhân sinh học là một trong những hướng tiềm năng trong việc phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu. Trên thế giới hiện nay có rất nhiều nghiên cứu sử dụng tác nhân sinh học để phòng trừ tuyến trùng. Đặc biệt, nấm Paecilomyces sp. được xem là một trong những loài nấm diệt tuyến trùng giệu quả cao nhất (Burges H. D., 1998; Butt T. M và Copping L., 2000). Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm Paecilomyces vẫn còn hạn chế. Năm 2014, Phùng Lê Kim Yến thuộc trường đại học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, phân lập được chủng nấm Paecilomyces sp. và đã chứng minh chủng nấm này có hiệu lực trừ tuyến trùng tốt. Tuy nhiên, tác giả chưa đưa ra được môi trường sản xuất thích hợp đối với chủng nấm này để ứng dụng trên đồng ruộng. Vì vậy, sinh viên chọn đề tài: “Sản xuất nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu”. 1
  12. Đồ án tốt nghiệp MỤC ĐÍCH Chọn môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp. và đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng của chế phẩm nấm Paecilomyces sp. NỘI DUNG ❖ Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp. ❖ Khảo sát ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ❖ Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ❖ Đáng giá khả năng trừ tuyến trùng hại hồ tiêu trong điều kiện in vitro và trên đồng ruộng. 2
  13. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp. 1.1.1. Phân loại khoa học Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceace Chi: Paecylomyces Chi Paecilomyces do Bainier mô tả năm 1907, sau đó được nhiều tác giả chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới. Paecilomyces lilacinum đã được phân loại trong phần Isarioidea, mà trạng thái hoàn hảo vẫn chưa được tìm thấy. Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 31 loài và phân bố trên diện rộng trong đó có thể kể đến là Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseus, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces lilacinus (Dilip K. Arora, P. D. Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004). Nấm Paecilomyces sp. có rất nhiều loài, có phổ ký sinh tuyến trùng rất rộng, cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Nấm Paecilomyces spp. dễ dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thực vật. Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên. Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như: - Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết tuyến trùng - Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất - Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, tuyến trùng. - Paecilomyces lilacinus phân lập từ xác bã hữu cơ, đôi khi ở tuyến trùng chết, rừng cao su, đất trồng tiêu... (Crop Protection Compennium, 2002). 3
  14. Đồ án tốt nghiệp 1.1.2. Đặc điểm hình thái Paecilomyces sp. là loài nấm sợi được tìm thấy trong đất hay xác tuyến trùng. Khi được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo nấm thường phát triển khá chậm, có dạng thảm nhung, dạng bó sợi và thường lúc đầu có màu trắng sau đố khi bào tử phát triển thì chuyển sang màu hồng nhạt, màu tím hay màu lục nhạt (nên thường được gọi là nấm tím) tùy vào từng loài. Cũng có loài màu nâu hay vàng sẫm. Sợi nấm mềm, có vách, trong suốt và rộng từ 2,5 - 4 µm (Wikipedia). Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, mức độ phân nhánh của nấm Paecilomyces sp. thường lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium, gốc cuống dạng bình phình to, phía trên nhỏ và uốn cong. Cuống bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều. Bào tử phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Trần Văn Mão, 2002). Khuẩn lạc mọc theo đường tròn đồng tâm. Có thể phân biệt các loài khác nhau của Paecilomyces thông qua hình thái đại thể và vi thể. (Phùng Lê Kim Yến, 2014) Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces sp. được nuôi nấy trên môi trường PDA. (Nguồn:http://galleryhip.com/scopulariopsis.htm) Thể bình gồm một phần đuôi phình to, thon dần ở phần đầu như một cái cổ. Bào tử trong chuỗi có nhiều dạng từ elip đến hình thoi. Bào tử có thành trơn hoặc hơi nhám, không có bào tử chống chịu. 4
  15. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Nấm Paecilomyces sp, được chụp dưới kính hiển vi (Nguồn: http://www.wikiwand.com/de/Paecilomyces_variotii) 1.1.3. Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces Khi được nuôi cấy lên men chìm người ta đã chiết tách được hoạt chất sinh học có tên gọi là leucinostatins (còn gọi là paecilitoxin). Leucinostatins là một peptide trung tính với cấu trúc gồm: α - aminoisobutyric acid, L-leucine, β - alanine và theo sau bởi 3 acid amin bất thường (L – threo – β - hydroxy leucine, 2 – amino – 2 – hydroxy – 4 – methyl – 8 oxodecanoicacid và cis – 4 – methyl – L - proline (theo Mori et al. 1982). Leucinostatins có 6 loại đã được mô tả là A, B, C, D, E, F. Leucinostatins có khả năng kháng khuẩn, chống lại vi khuẩn Gram dương và nhiều loại nấm (theo Fukushima et al. 1983 a,b). Tuy nhiên trong cơ chế kiểm soát tuyến trùng không có sự tham gia của loại độc tố này. Tùy từng loài Paecilomyces khác nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriunbin, viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng. 5
  16. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin) 1.1.4. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng Nhiều loài vi nấm được phân lập từ trứng tuyến trùng sần rễ (Stirling và West, 1991). Được nghiên cứu nhiều nhất là Paecilomyces lilacinus và Paecilomyces chalmydosporia, chúng được xem là có khả năng ký sinh tuyến trùng hiệu quả nhất, có thể kí sinh cả trứng lẫn con cái (Siddiqui và Mahmood, 1996). Có hai rào cản đối với nấm kí sinh tuyến trùng khi xâm nhiễm kí chủ là lớp biểu bì ấu trùng tuổi 2 (J2) và vỏ trứng. Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình xâm nhiễm là khả năng tiết enzyme protease và chitinase, bởi vì vỏ trứng được cấu tạo bởi 3 lớp riêng biệt: lớp vitelline bên ngoài, một lớp chitin và một lớp lipoprotein bên trong. Theo Llorca và Claugher (1990), trong quá trình xâm nhiễm, ở giai đoạn đầu, một mạng lưới sợi nấm phân nhánh tiếp xúc với vỏ trứng, sau đó chúng tiết enzyme để phân hủy vỏ trứng dẫn đến sự tan rã của lớp vitellin, sự phân hủy lớp chitin và lipoprotein (Morton et al., 2004). Các loài nấm khác nhau có khả năng xâm nhiễm tuyến trùng và trứng theo các phương thức khác nhau. Ban đầu, các bào tử và sợi nấm tiếp xúc với vỏ trứng. Nấm kí sinh tuyến trùng sử dụng cả cách thức hóa học (tiết enzyme) và cơ học. Nấm tiết ra các enzyme làm mềm vỏ trứng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mộc mầm, thông qua lổ thủng đó mầm của bào tử nấm sẽ xâm nhập vào bên trong 6
  17. Đồ án tốt nghiệp trứng tuyến trùng (Perry và Starr, 2009). Khả năng tiết enzyme chitinase và protease đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập trứng tuyến trùng của các loài nấm (Tikhonov et al., 20002) do vỏ trứng được cấu tạo từ chitin và protein tạo thành một cấu trúc sợi nhỏ và vô định hình (Wharton, 1980). Sau khi xâm nhập vào bên trong chúng hoạt động, tiết ra các độc tố làm tê liệt và phá hủy bên trong cơ thể tuyến trùng, hút dinh dưỡng để sinh sản, tiêu diệt trứng, ấu trùng, làm thay đổi sự trao đổi chất, hoạt động sinh lý, dẫn đến cái chết của tuyến trùng. 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Các nhà khoa học cũng cho biết rằng nấm Paecilomyces spp. khi tấn công vào cơ thể tuyến trùng nếu gặp những điều kiện không thích hợp về nhiệt độ và ẩm độ, ánh sáng thì nấm sẽ tạo nên những thể chịu đựng (resistant structures) để đối phó lại với môi trường (Penland, 1982). 1.1.5.1 Nguồn dinh dưỡng Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces sp. cần nhiều dưỡng chất, nếu thiếu dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với tuyến trùng (theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). Carbon và Nitơ cùng với sự cân bằng giữa chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển cũng như sự hình thành bào tử của nấm Paecilomyces sp. (theo trích dẫn của Rayati và ctv, 2001). Các nghiên cứu cho biết, việc bổ sung nguồn đường có ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme của nấm (dẫn theo Rayati và ctv, 2001). Các tác giả còn cho biết sucrose là cơ chất tốt nhất (8,725 cm) cho sự tăng trưởng, tiếp theo là glucose (5,625 cm). Liang, K. (1981) đã cho biết nấm Paecilomyces tenuipes khi thiếu nguồn nitơ động vật tính gây bệnh giảm xuống rõ rệt (Hill, K. L, 1999, trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). 1.1.5.2 Nhiệt độ Nhiệt độ và độ ẩm tương đối được coi là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển, hình thành bào tử và lây nhiễm của các loài nấm kí sinh tuyến trùng (Ayyasamy và Baskaran, 2005). Nhiệt độ thích hợp cho nấm trong khoảng 20 – 25 0C, nhưng ở 25 0C nấm phát triển tốt nhất (Lee et al., 1999). Gần đây, Stather và 7
  18. Đồ án tốt nghiệp ctv đã công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. và xác định nấm Paecilomyces sp. thích hợp ở nhiệt độ 28 0C. Nếu nhiệt độ cao bào tử dễ bị chết hoặc không hình thành, khi tấn công tuyến trùng nếu gặp điều kiện nhiệt độ, ẩm độ hay ánh sáng không thích hợp thì nấm Paecilomyces sp. sẽ tạo nên những thể chịu đựng để đối phó lại môi trường (theo Penland, 1982). Khi nuôi nấm Paecilomyces farinosus ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau cho thấy nhiệt độ 15 0C có lợi cho sự hình thành bào tử hơn là nhiệt độ 24 0C. Khi nuôi nấm Paecilomyces papillata, nhiệt độ thích hợp nhất là 24 - 26 0C, nhưng ở nhiệt độ 18 0C tỷ lệ ký sinh cao hơn 18 % so với nhiệt độ 25 0C. Nguyên nhân có thể là do dưới nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình, dị hóa, làm tăng quá trình đồng hóa, từ đó làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần Văn Mão, 2002). Julio J. D và ctv. (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc không có bào tử nấm được tạo nên ở các nhiệt độ 12 0C, 16 0C và 30 0C. 1.1.5.3 Ẩm độ Nấm phát triển thích hợp ở ẩm độ 80 – 90% (Phạm Thị Thùy, 2004). Ẩm độ cao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, tuy nhiên ẩm độthấp sẽ có lợi cho duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm Paecilomyces sp. có khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0 – 34 % hơn là khi ẩm độ 75 %. 1.1.5.4 pH pH môi trường được quyết định bởi nồng độ ion H+, chính nồng độ ion H+ có ảnh hưởng đến hệ thống enzyme của tế bào và ảnh hưởng việc hấp thu khoáng, acid hữu cơ của tế bào nấm cho quá trình phát triển cũng như hình thành bào tử (Dasrupta, 1994). Nấm thường sống trong phạm vi pH = 3,5 – 8. Nhưng nấm tuyến trùng ưa pH hơi acid và nấm phát triển thích hợp ở pH = 5,5 – 6. Theo nghiên cứu của Sung Mi Shim et al., (2003), thì giá trị pH phù hợp cho sự phát triển của P. fumosoroseus nằm trong khoảng 6 – 9, còn P. japonica phát triển tối ưu ở pH 7 (Choi et al., 1999), P. sinclairii phát triển tối ưu ở pH 8 (Shim et al., 2003). 1.1.5.5 Ánh sáng 8
  19. Đồ án tốt nghiệp Các loài nấm ký sinh tuyến trùng, tuyến trùng rất cần ánh sáng cho sự phát triển và tạo bào tử. Ánh sáng là nhân tố không thể thiếu cho việc hình thành bào tử (theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). Ánh sáng cũng rất cần thiết cho quá trình sinh bào tử của nấm Paecilomyces spp. Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces spp. sẽ không tạo nhiều bào tử. 1.1.5.6 Độ thoáng khí Nấm tuyến trùng đa số đều thuộc loại hiếu khí. Khi nấm phát triển chúng đòi hỏi có lượng oxy thích hợp trong dụng cụ nhân nuôi hay trong cả biên độ rộng của không gian nuôi cấy, nếu phù hợp nấm sẽ phát triển tốt. 1.1.5.7 Môi trường nuôi cấy Năm 1986, tác giả Jeanne M. M. I. và CS. (1986) đã thử nghiệm nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. bằng phương pháp lên men chìm. Tác giả đã tiến hành thử nghiệm các điều kiện nhân sinh khối tạo bào tử chồi (Blastospore) bằng các nguồn nitơ và cacbon khác nhau. Kết quả cho thấy trong các nguồn nitơ thử nghiệm thì (NH4)2SO4 thích hợp nhất cho nấm Paecilomyces sp. phát triển, tạo bào tử chồi. nhiều nghiên cứu về sản xuất nấm Paecilomyces sp. trong điều kiện nuôi cấy lỏng đã chỉ ra rằng để tối ưu hóa cho sản xuất tối đa sinh khối sợi nấm và exo – polysaccharide của nấm Paecilomyces japonica. Kết quả cho thấy với thành phần glucose 30g, 20 g cao nấm men, 0,5g KH2PO4 và 0,1 g CuCl2.2H2O và 1 lít nước cất được cho là môi trường tối ưu để sản xuất nấm Paecilomyces japonica ở nhiệt độ 27 0C sẽ cho sinh khối sợi nấm và lượng polysaccharide lần lượt là 23,1 g / l và 2,5 g / l (Lee JS, Iung WC, Park SJ, Lee KE, Shin WC, Hong Ex, 2012). Nghiên cứu của Li Gao (2015) báo cáo về tác động của các yếu tố dinh dưỡng và môi trường ảnh hưởng đến sản xuất sinh khối và bào tử nấm Paecilomyces lilacunus IPC – P. Các yếu tố này bao gồm nguồn carbon và nitơ, tỷ lệ C / N, các khoáng chất và vitamin cùng với nguồn nước, nhiệt độ, chu kỳ sáng / tối và độ pH. Các bào tử đã được cấy trên môi trường cơ bản (sucrose 19.00 g / l, peptone đậu nành 4.06 g / l, K2HPO4 1,00 g / l, KCl 0.50 g / l, MgSO4 0.50 g / l, FeSO4 0,01 g / l, agar 13,00 g / l) trong 4 ngày, trước khi được cấy chuyền qua môi trường hình thành bào tử 9
  20. Đồ án tốt nghiệp (dextrin 2.27 g / l, urê 2.13 g / l, CaCl2 3,00 g / l, ZnSO4 · 7H2O 0,01 g / l, agar 13.00 g / l) cho thêm 4 ngày theo các điều kiện môi trường sau đây: -3,9 MPa / pH 7 / ánh sáng 24 h / nhiệt độ 29 °C; những điều kiện đã được thay đổi để -0,3 MPa / pH 6 / ánh sáng 24 h / nhiệt độ 23 ° C để có được số lượng sinh khối tốt hơn. Số liệu cung cấp thông tin về nhu cầu dinh dưỡng và môi trường của loại nấm này, đó sẽ là điều cần thiết cho việc sản xuất chế phẩm thương mại của nó. Môi trường nuôi cấy lỏng với nồng độ carbon khác nhau và tỷ lệ C / N đã được thử nghiệm để sản xuất bào tử chịu khô hạn của Paecilomyces fumosoroseus. Trong khi tất cả các môi trường được thử nghiệm hỗ trợ hình thành bào tử trong môi trường lỏng, nồng độ bào tử cao (5,8 × 108 bào tử / ml) được sản xuất trong môi trường có chứa 80 g glucose.l-1 và 13,2 g Casamino axit.l-1 (môi trường MS) và một tỷ lệ cao hơn đáng kể (79 %) của các bào tử sống sót không khí khô. có chứa nồng độ glucose trong môi trường lớn hơn 20 g / l và axit Casamino nồng độ từ 13,2 và 40 g / l hỗ trợ sản xuất tối đa của bào tử chịu khô hạn. Tất cả 23 chủng nấm P. fumosoroseus phân lập trong trong môi trường MS được sản xuất cho nồng độ cao của bào tử chịu khô hạn. Khi bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, hơn 60 % số bào tử đông khô được sản xuất trong môi trường MS vẫn còn hoạt tính sau khi bảo quản 7 tháng trong khi ít hơn 25 % của bào tử khô trong không khí sống sót sau 90 ngày lưu trữ. Hàng loạt các nghiên cứu về các loại cơ chất, thành phần môi trường để sản xuất sinh khối nấm Paecilomyces sp. đã được thực hiện. S. Prabhu, S.Kumar và S. Subranmanian (2008) nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Paecilomyces lilacinus trên môi trường lỏng để trừ trứng tuyến trùng. Thí nghiệm được thực hiện trên 4 loại môi trường Potato dextrose broth (PDB), môi trường Richards; 10 % Molasses và môi trường Semi chọn lọc. Kết quả thí nghiệm cho thấy khối lượng sợi nấm đạt cao nhất ở môi trường Semi chọn lọc (19,82g), tiếp theo là môi trường 10 % Molasses (16.85 g). Khối lượng sợi nấm đạt ít nhất ở môi trường PDB (10.5g). Sinh khối sợi nấm đạt cao nhất ở môi trường Semi chọn lọc (32.8 x 107 bào tử / g), tiếp theo là môi trường 10% Molasses (28.8 x 107 bào tử / g). Bào tử đạt ít nhất ở môi trường PDB (10.3 x 107 bào tử / g). Năm 2015, Zhen Yu, You – chi Zhang, Xiang 10
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược