1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số Lactobacillus spp.

Đồ án tốt nghiệp: Phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số Lactobacillus spp.

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số Lactobacillus spp. Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TRONG KHOANG MIỆNG CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SỰ TẠO MÀNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ Lactobacillus spp. Ngành : Công nghệ sinh học Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương TS.

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 105

Ngày tạo 10/11/2021 12:22:26 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 4.73 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Phân lập vi khuẩn lactic trong k... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TRONG KHOANG MIỆNG CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SỰ TẠO MÀNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ Lactobacillus spp. Ngành : Công nghệ sinh học Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương TS. Nguyễn Hoàng Dũng Sinh viên thực hiện : Nguyễn Tuấn Anh MSSV: 1311100148 - Lớp: 13DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Người thực hiện đề tài: Nguyễn Tuấn Anh Sinh viên trường: Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Khoa: Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: 13DSH02 MSSV: 1311100148 Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Hoài Hương và TS. Nguyễn Hoàng Dũng, thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới và phòng thí nghiệm lầu 7 trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Những số liệu và kết quả phân tính trong đề tài này hoàn toàn trung thực, không sao chép từ bất kỳ nguồn tài liệu tham khảo nào khác dưới bất kỳ hình thức nào. Một số nội dung trong đồ án tốt nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu trích dẫn được công bố công khai trên các bài báo khoa học, website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ án. Nếu có bất cứ sự sao chép và không trung thực trong bài báo này, người thực hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường và trươc ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Ngày … tháng … năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Tuấn Anh i
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức em đã gặp phải không ít lần khó khăn nhưng nhờ có sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của TS. Nguyễn Hoài Hương, cùng những kiến thức và kỹ năng cần thiết Cô truyền dạy mà em có thể hoàn thành được tốt đồ án tốt nghiệp lần này. Từ tận đáy con tim, em xin chân thành cám ơn cô Hoài Hương. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Tiến sĩ Nguyễn Hoàng Dũng đã mở lòng nhận hướng dẫn em thực hiện đề tài tốt nghiệp tại Viện Sinh học Nhiệt đới (VSHND). Đây là một cơ hội cực kỳ quý báu mà thầy đã dành cho em, em xin cám ơn thầy Dũng rất nhiều. Ngoài ra, trên VSHND em còn nhận không ít sự giúp đỡ từ Thạc sĩ Lê Quỳnh Loan . Suốt thời gian làm việc và nghiên cứu tại VSHND, chị là người luôn bên cạnh và nhắc nhở em rất nhiều những điều cần thiết khi thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu. Em xin cám ơn chị Loan. Ngoài ra, con xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình, những người đã bên con và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Lời cuối cùng, em xin gửi lời chúc tới toàn thể quý thầy quý cô đang giảng dạy, nghiên cứu tại Viện Sinh học Nhiệt Đới cũng như tại Đại học thành phố Hồ Chí Minh, thật dồi dào sức khỏe, để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau. TP.HCM, ngày … tháng … năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Tuấn Anh ii
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................... i LỜI CÁM ƠN.................................................................................................... ii MỤC LỤC ...................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................v DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ..................................................................... vii MỞ ĐẦU ......................................................................................................10 CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN .............................................................................14 1.1. SÂU RĂNG .......................................................................................14 1.1.1. Bệnh học ........................................................................................14 1.1.2. Men răng ........................................................................................20 1.2. VI KHUẨN RĂNG MIỆNG .............................................................27 1.2.1. Streptococcus spp. ..........................................................................27 1.2.2. Lactobacillus spp............................................................................29 1.2.3. Vi khuẩn lactic ...............................................................................35 1.3. MÀNG SINH HỌC ...........................................................................36 1.3.1. Sự hình thành .................................................................................36 1.3.2. Thành phần .....................................................................................38 1.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành màng sinh học ..........40 1.3.4. Tính chất của màng sinh học .........................................................42 1.3.5. Phân bố ...........................................................................................43 1.3.6. Giả thuyết về cơ chế bảo vệ răng miệng của probiotic và LAB nói chung ........................................................................................................45 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ............................................................47 1.4.1. Ngoài nước .....................................................................................47 1.4.2. Trong nước .....................................................................................50 CHƯƠNG 2:PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ....................51 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .....................................................51 2.2. Vật liệu nghiên cứu ...........................................................................51 iii
  5. Đồ án tốt nghiệp 2.2.1. Dụng cụ và thiết bị .........................................................................51 2.2.2. Giống vi khuẩn ...............................................................................51 2.2.3. Hóa chất .........................................................................................51 2.2.4. Các phần mềm sử dụng ..................................................................54 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................55 2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu ...........................................................................55 2.3.2. Thu mẫu .........................................................................................56 2.3.3. Tăng sinh ........................................................................................58 2.3.4. Chọn lọc vi khuẩn lactic.................................................................59 2.3.5. Bảo quản ........................................................................................59 2.3.6. Chọn lọc các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh ...........59 2.3.7. Định danh các chủng BG ...............................................................60 2.3.8. Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của NBG ......................64 CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .........................................................65 3.1. Tình trạng răng miệng của các đối tượng thu mẫu............................65 3.2. Phân lập vi khuẩn Lactic ...................................................................65 3.3. Chọn lọc các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh ...............67 3.4. Định danh ..........................................................................................71 3.4.1. Ly trích, thu nhận DNA .................................................................71 3.4.2. Nhân sợi DNA bằng phương pháp PCR ........................................71 3.4.3. Xác định trình tự DNA – So sánh với ngân hàng dữ liệu gen NCBI. ........................................................................................................72 3.5. Khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của vi khuẩn NBG đối với L. fermentum ....................................................................................76 CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN .................................................................................82 4.1. Kết luận .............................................................................................82 4.2. Kiến nghị ...........................................................................................83 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................84 PHỤ LỤC BẢNG ...............................................................................................1 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH ......................................................................................7 iv
  6. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT EPS Extracellular polymeric substance DT Decayed teeth FT Filled teeth MT Missing teeth DFMT Decayed teeth, filled teeth, and missing teeths HA Hydroxyapatite LBS Lactobacillus Selection medium LAB Lactic acid batería MRS deMan, Rogosa and Sharpe LBM Lactobacillus biofilm medium OD600 Opical density at 600 nm BG Biofilm group NBG Non-biofilm group v
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Lactobacillus spp. phân lập được từ người lớn mắc bệnh sâu răng ...................................................................................................................................33 Bảng 1.2. Lactobacillus spp. phân lập được từ trẻ em 4-7 tuổi mắc bệnh sâu răng ............................................................................................................................34 Bảng 1.3. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ răng miệng . ...................................................................................................48 Bảng 2.1. Thành phần môi trường LBS (g/l) ...................................................52 Bảng 2.2. Thành phần môi trường MRS (g/l) ..................................................52 Bảng 2.3. Thành phần môi trường tạo màng sinh học của Lactobacillus spp. – Lactobacillus biofilm medium (LBM) ......................................................................52 Bảng 2.4. Thành phần môi trường thử khả năng lên men các nguồn carbohydrates khác nhau (g/l) ...................................................................................53 Bảng 2.5. Mô tả các nghiệm thức (NT) trong thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học ..............................................................................64 Bảng 3.1. Thông kê khảo sát tình trạng răng miệng của các đối tượng thu mẫu . ...................................................................................................................................65 Bảng 3.2. Danh sách các chủng vi khuẩn lactic phân lập được và hình thái tế bào của chúng ............................................................................................................66 Bảng 3.3. Kết quả định lượng khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn lactic ...............................................................................................................69 Bảng 3.5. So sánh kết quả thử khả năng lên men các nguồn carbonhydrates khác nhau của 3 chủng 1B, 12R2 và 30B2 với một số loài Lactobacillus có trong kết quả hiển thị khi so sánh DNA trên ngân hàng gen NCBI. ...............................................75 Bảng 3.4. So sánh độ tương đồng DNA của 3 chủng L. fermentum 1B, 12R2 và 30B2 (%) ...................................................................................................................76 vi
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng ...............15 Hình 1.2. Răng bị tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng ....................16 Hình 1.3. Giản đồ mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng .................................17 Hình 1.4. Cấu trúc của răng người ...........................................................................20 Hình 1.5. Các cấp kết cấu của men răng ..................................................................21 Hình 1.6. Mô phỏng cột tinh thể HA ........................................................................22 Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc lục giác của HA khi nhìn dọc theo hướng trục C. ............22 Hình 1.8. Hình chụp cột tinh thể dưới kính hiển vi điện tử [37] ..............................23 Hình 1.9. Hình vẽ mô tả hướng phát triển của các rod ............................................24 Hình 1.10. Mặt cắt dọc men răng .............................................................................24 Hình 1.11. Mô tả sự hình thành lỗ khóa bởi Rod và Interrod ..................................25 Hình 1.12. Các giai đoạn cột tinh thể HA bị bào mòn bởi acid A: cột tinh thể bình thường; B: giai đoạn đầu sự ăn mòn: C: bị ăn mòn hoàn toàn..................................26 Hình 1.13. Cơ chế bảo vệ răng của các ion F- ..........................................................26 Hình 1.14. Một số kiểu hình thái của Lactobacillus spp.. ........................................30 Hình 1.15. Tỷ lệ các Lactobacillus spp. phân lập được trong miệng của trẻ bị sâu răng và của người mẹ. .......................................................................................................34 Hình 1.16. Sự thay đổi về cấu trúc của màng sinh học khi bước qua giai đoạn phát tán. .............................................................................................................................37 Hình 1.17. Các giai đoạn hình thành màng sinh học. ...............................................38 Hình 1.18. Mô tả mạng lưới EPS ngoại bào và các lực tương tác giữa các polysaccharides. ........................................................................................................39 Hình 1.19. Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử ............................40 Hình 1.20. Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thông qua sự hình thành màng sinh học .............................................................................................................................44 vii
  9. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.21. Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong hồ nước nóng Mickey, Oregon .................................................................................44 Hình 1.22. Cơ chế tác động của Lactobacillus spp. lên những vi khuẩn trong khoang miệng .........................................................................................................................47 Hình 2.1. Mô tả phương pháp thu mẫu nước bọt .....................................................57 Hình 2.2. Một số vị trí lấy mẫu mảng bám răng. .....................................................58 Hình 2.3. Dùng lực chảy của dịch môi trường để tác động lên màng sinh học. ......60 Hình 2.4. Mô tả giai đoạn loại bỏ protein và tủa DNA ............................................62 Hình 2.5. Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA ........................................................63 Hình 3.1. Hình thái tế bào của một số chủng trong nhóm vi khuẩn lactic phân lập được dưới vật kính 100x. ..........................................................................................67 Hình 3.2. Mật độ màng sinh học hình thành dưới đáy giếng của của 3 chủng 1Ba, 12R2a, 30B2b nhiều hơn so với chủng 21B2i ............................................................68 Hình 3.3. Các ống giống khảo sát khả năng hình thành màng sinh học sau 24 giờ ủ: ...................................................................................................................................70 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn. Nhìn vệt màu kéo dài cho thấy hệ DNA của vi khuẩn đã bị gãy thành rất nhiều đoạn có kích thước khác nhau. ...............................................................................................71 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng vi khuẩn cho 1 vệt DNA đơn và rõ hơn hẳn kết quả điện di sản phẩm tách DNA. ......................................................72 Hình 3.6. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA của chủng 1B, 12R2 và 30B2 với một số các chủng khác trên ngân hàng gen NCBI. ...73 Hình 3.7. Hình thái tế bào của các chủng 1B, 12R2, 30B2 và L. fermentum YB5 .74 Hình 3.8. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L. fermentum 1B. 78 Hình 3.9. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L. fermentum 12R2 ...................................................................................................................................78 Hình 3.10. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L. fermentum 30B2 ...................................................................................................................................79 viii
  10. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.11. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên C.albicans.........79 Hình 3.12. Kết quả so sánh khả năng tạo màng sinh học của một số chủng NBG và BG ở thí nghiệm chọn lọc vi khuẩn lactic có khả năng tạo màng sinh học. .............80 Hình 3.13. Tổng hợp khả năng kháng sự tạo thành màng sinh học của các chủng NBG. .........................................................................................................................81 ix
  11. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh sâu răng là bệnh khá phổ biến, gây hậu quả ở nhiều mức độ về sức khoẻ răng miệng và sức khoẻ chung. Bệnh sâu răng được Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) xếp vào loại tai họa thứ ba của loài người sau bệnh ung thư và tim mạch. Tháng 5 năm 2007, tại hội nghị sức khỏe răng miệng thế giới lần thứ 60, các nước thành viên của Tổ chức Y tế Thế giới đã thông qua nghị quyết, đưa xúc tiến và phòng ngừa bệnh sâu răng vào quy hoạch phòng ngừa và điều trị tổng hợp bệnh mãn tính. Hiện nay, sức khỏe răng miệng là một trong 10 tiêu chuẩn lớn về sức khỏe theo xác định của Tổ chức Y tế Thế giới [1]. Vì vậy, việc chăm sóc, dự phòng bệnh sâu răng là một vấn đề lớn được chính phủ các nước quan tâm. Mối quan hệ giữa Lactobacillus spp. và sâu răng đã được xác định hơn một thế kỷ qua. Một số nhà khoa học cũng đã khảo sát và nhận thấy rằng mật độ Lactobacillus spp. trong khoan miệng sẽ tăng lên sau giai đoạn đầu của bệnh sâu răng [2]. Sigurjons và cộng sự xác định được tỷ lệ Lactobacillus spp. trong mảng bám răng miệng chiếm tới 62% [3]. Beighton và cộng sự cũng đã tiến hành một cuộc khảo sát răng miệng ở trẻ từ 3 - 4 tuổi, kết quả là tỷ lệ phân lập được Lactobacillus spp. trong trẻ sâu răng là 54%, trong khi ở trẻ không sâu răng chỉ chiếm 7% [4]. Ngoài ra Matee và cộng sự cũng đã nhận định trong kết quả nghiên cứu của họ rằng tỷ lệ Lactobacillus spp. trong miệng trẻ sâu răng cao gấp 100 lần trẻ không sâu răng [5]. Chủ yếu L. fermentum là loài chiếm đa số trong miệng của trẻ lẫn người lớn đang bị sâu răng [6] [7]. Mảng bám răng là một màng sinh học hình thành trong miệng, bao gồm nhiều loài vi sinh vật khác nhau và gắn kết với nhau bởi mạng lưới polysacchrides không tan. Vì khả năng tạo màng sinh học là một yếu tố chính quyết định sự hình thành mảng bám răng, nên các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu tìm ra các mối liên hệ giữa Lactobacillus spp. và sự hình thành mảng bám răng miệng. Wilcox và cộng sự đã phát hiện ra được 2/4 chủng L. salivarius và 2/3 chủng L. fermentum của họ có khả năng gắn kết màng sinh học với S. salivarius, S. gordonii, S. crista, S. sanguis (một 10
  12. Đồ án tốt nghiệp số loài trong chi Streptococcus có khả năng gây sâu răng) [8]. Filoche và cộng sự cũng đã phát hiện ra rằng, khả năng hình thành màng sinh học của các Lactobacillus spp. khi nuôi cấy đơn lẻ thì rất thấp, nhưng khi đồng nuôi cấy với một số loài Actinomyces thì lại tăng gấp 4 – 20 lần [9]. Năm 2001, Tổ chức lương nông thế giới (FAO) và Tổ chức y tế thế giới (WHO) đã đưa ra định nghĩa cho probiotic: “Probiotic những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng vừa đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của vật chủ”. Hầu hết các vi khuẩn probiotic thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium, chúng đã được ứng dụng trong gần 1 thế kỷ qua [10]. Trong những năm gần đây, ứng dụng vi khuẩn probiotic vào công cuộc chống sâu răng đang rất được chú trọng. Một số các thử nghiệm lâm sàng trên động vật đã khẳng định được khả năng bảo vệ răng miệng của probiotic [11]. Các phương thức bảo vệ răng miệng của probiotic được giả định bởi: khả năng tiết bacteriocin, cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh diện tích sống. Nhưng bản chất đối kháng thực sự với các vi khuẩn gây hại trong khoan miệng của probiotic vẫn chưa được thấu hiểu. Để góp phần tìm ra các chủng vi khuẩn tìềm năng mới có thể ứng dụng để phòng ngừa bệnh sâu răng, đồng thời khảo sát khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn chi Lactobacillus, nhóm thực hiện đồ án sẽ bước đầu phân lập một số vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của các Lactobacillus spp. có trong mảng bám răng miệng. 2. Tình hình nghiên cứu Nhiều năm qua, đã có nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro nhằm tìm ra tác động của vi khuẩn lactic trong khoang miệng. Các nhà khoa học cũng mong muốn khi vi khuẩn lactic được sử dụng dưới dạng probiotic sẽ có khả năng tồn tại một thời gian nhất định trong nước bọt. Năm 2006, Haukioja và cộng sự đã tìm được một số chủng probiotic có khả năng này [12], khiến cho việc ứng dụng vi khuẩn lactic nói chung và probiotic nói riêng để bảo vệ răng miệng trở nên khả quan hơn. 11
  13. Đồ án tốt nghiệp Bussher và cộng sự đã xác định được rằng L. acidophilus và L. casei có trong sữa chua đã làm giảm tỷ lệ của các Lactobacillus spp. khác và Streptococcus mutans trong nước bọt và mảng bám răng của các đối tượng nghiên cứu xuống sau một tuần sử dụng [13]. Ahola và cộng sự cũng khảo sát tương tự nhưng trong sản phẩm lên men pho – mát, LGG và Lactobacillus rhamnosus LC 705 có trong pho – mát có thể giảm được tỷ lệ sâu răng ở trẻ nhỏ [14]. Tại Việt Nam, hiện tại chỉ có duy nhất TS. Nguyễn Thị Mai Phương (Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam) là đang tập trung nghiên cứu về vấn đề bảo vệ răng miệng, nhưng chủ yếu là các hợp chất thứ cấp ức chế Streptococcus mutans như: Alpha-mangostin ức chế sự hình thành biofilm của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans UA159; Ethyl acetate extract from (Rhodomyrtus tomentosa (Aliton) Hassk) leaves inhibits acid production and biofilm formation by Streptcocccus mutans; H2O2 inhibits NADH oxidase activity purified from streptococcus mutans,... [15] [16]. 3. Mục đích nghiên cứu Phân lập các vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự hình màng sinh học của Lactobacillus spp. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát mức độ sâu răng ở một nhóm đối tượng - Phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng - Khảo sát khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn lactic trong răng miệng - Chọn ra các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh có khả năng là tác nhân gây sâu răng. Định danh các chủng, chọn ra chi Lactobacillus. - Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các vi khuẩn lactic lên các Lactobacillus spp. phân lập được 5. Phương pháp nghiên cứu - Thu mẫu răng miệng của 30 đối tượng từ 11 hộ gia đình. Bên cạnh đó ghi nhận tình trạng răng miệng của các đối tượng. 12
  14. Đồ án tốt nghiệp - Phân lập vi khuẩn lactic trên môi trường LBS thông qua việc quan sát hình thái tế bào, khuẩn lạc, các thử nghiệm sinh lý (khả năng di động, khả năng sinh bào tử) và các thử nghiệm sinh hóa (catalase). - Khảo sát khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp nuôi cấy trên đĩa 96 giếng, từ đó phân loại nhóm vi khuẩn lactic có khả năng tạo màng sinh học mạnh để chọn làm tác nhân gây sâu răng. - Tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn lactic nghi ngờ có khả năng gây sâu răng, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R. - Gửi mẫu giải trình tự DNA tại công ty Nam Khoa - Dựa vào hình thái kết hợp với kết quả thử nghiệm sinh hóa trước đó để định danh chính xác các chủng này. - Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của Lactobacillus spp. được thực hiện bằng phương pháp đồng nuôi cấy vi khuẩn lactic và Lactobacillus spp. trong môi trường LBM trên đĩa giếng 96. Màng sinh học trong các giếng sẽ được nhuộm bằng Crystal violet, và định lượng bằng phương pháp đo mức độ hấp thụ màu tím ở bước sóng 570 nm. 6. Các kết quả đạt được - Từ 60 mẫu thu răng miệng đã chọn lọc ra được 30 chủng vi khuẩn lactic. - Chọn lọc được 3 chủng lactic có khả năng tạo màng sinh học mạnh. - Kết quả định danh 3 chủng 1B, 12R2, 30B2 đều thuộc loài L. fermentum. - Chọn ra được 11 chủng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế ít nhất 1 trong 4 vi khuẩn gây sâu răng được khảo sát (3 chủng L. fermentum phân lập được và nấm Candida albicans) 7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Chương 1: Tổng quan Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 13
  15. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. SÂU RĂNG 1.1.1. Bệnh học 1.1.1.1. Định nghĩa Sâu răng là hiện tượng các tổ chức cứng của răng (men, ngà và cement) bị tổn thương, đặc trưng bởi sự khử khoáng ở men răng, ngà răng tạo thành các lỗ sâu và không hoàn nguyên được. Có nhiều định nghĩa về bệnh sâu răng, dựa trên những nghiên cứu và nhận xét khác nhau về nguyên nhân cũng như tiến trình của bệnh, sâu răng có thể được định nghĩa như sau: - Bệnh sâu răng là một quá trình động, diễn ra trong mảng bám vi khuẩn dính trên mặt răng, đưa đến mất cân bằng giữa mô răng với chất dịch xung quanh và theo thời gian, hậu quả là sự mất khoáng của mô răng [17]. - Là bệnh nhiễm trùng của mô răng biểu hiện đặc trưng bởi các giai đoạn mất và tái khoáng xen kẽ nhau [18]. 1.1.1.2. Lịch sử Sâu răng là một bệnh phổ biến trên toàn thế giới, xảy ra ở mọi lứa tuổi, giới tính, dân tộc. Bệnh đã có từ rất lâu đời, nhưng chỉ thực sự nghiêm trọng khi đồ ngọt trở thành thứ không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người. Trong các bệnh thường gặp ở trẻ em, sâu răng đứng thứ hai sau bệnh hen suyễn [19]. Suốt một thể kỷ qua người ta tin rằng mọi quần xã vi sinh vật có trong miệng đều có thể gây sâu răng và việc chữa trị duy nhất đó là đánh răng – loại bỏ các mảng bám vi khuẩn. Trong thế chiến thức I, II và chiến tranh Triều Tiên, lý do bị từ chối đi nghĩa vụ quân sự nhiều nhất đó là sâu răng. Cuối thế kỷ 19, với dự đoán : nếu một người sống đủ lâu thì sau này chắc chắn sẽ không còn răng, người ta đã phân ra nhánh mới riêng biệt trong nền y học lúc bấy giờ - nha khoa, với mức đầu tư 34 tỷ đô la (năm 1990). Tới những năm cuối thế kỷ 20 thì bệnh sâu răng có thể kiểm soát và phòng ngừa. Gần 50% trẻ nhỏ không bị sâu răng và tỷ lệ súng răng ở người cao tuổi giảm từ 50% xuống còn 20% [20]. 14
  16. Đồ án tốt nghiệp Dù không nguy hiểm đến tính mạng nhưng sự khó chịu khi sâu răng và chi phí cho việc chữa trị/phòng ngừa là không hề nhỏ (đứng thứ 3 sau tim mạch và ung thư). 1.1.1.3. Dấu hiệu và triệu chứng Dấu hiệu sớm nhất của bệnh là sự xuất hiện các đốm phấn trắng trên bề mặt răng, đây là vùng men răng đang bị khử khoáng [21]. Khi các thương tổn tiếp tục diễn ra thì lúc này vùng men sẽ chuyển sang màu nâu và bắt đầu lõm xuống, gọi là lỗ sâu. Ở giai đoạn đốm trắng, men răng vẫn có thể tái khoáng hóa bởi các ion Ca2+ có trong nước bọt. Ở giai đoạn hình thành lỗ sâu thì men răng hoàn toàn không có khả năng tái khoáng hóa nhưng quá trình khử khoáng vẫn có thể bị dừng lại [22]. Hình 1.1. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng Khi cả men răng và ngà răng đồng thời bị khử khoáng thì lỗ sâu càng dễ nhìn thấy bằng mắt thường, và không cứng chắc như trước. Lúc này tủy răng và mạch máu có thể bị hở ra, chịu tác động bởi lực bên ngoài nhiều hơn, dẫn đến các cảm giác đau nhói khi nhai hoặc tiếp xúc với đồ ăn nóng/lạnh và kể cả ngọt. 15
  17. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Giai đoạn tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng. Răng sâu còn là một trong những nguyên nhân gây hôi miệng. Trường hợp xấu hơn là nhiễm trùng lan sang vùng mô mềm (nướu). Biến chứng có thể xảy ra là nghẽn mạch hang xoang, viêm họng Ludwig, … đe dọa đến tính mạng của người bệnh. 1.1.1.4. Nguyên nhân Cần có bốn yếu tố chính đồng thời xuất hiện để gây nên triệu chứng sâu răng: men răng hoặc ngà răng, vi khuẩn gây sâu răng, nguồn carbohydrates (thường là sucrose) và thời gian [23]. Mức độ sâu răng thì lại phụ thuộc vào hình dáng của răng, thói quen vệ sinh răng miệng, thành phần nước bọt, … Sự sâu răng có thể xảy ra ở bất kỳ nơi nào trên răng. Sâu răng là do sự xuất hiện và phát triển của mảng bám (màng sinh học) trên răng. Các vi khuẩn trong mảng bám sinh acid khi có sự hiện diện của các nguồn carbohydrates khác nhau như sucrose, fructose và glucose. 16
  18. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng 1.1.1.4.1. Vi khuẩn Khoang miệng của người chứa vô số vi khuẩn, nhưng chỉ một số ít trong đó có khả năng gây sâu răng, đáng nói đến nhất là Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus và một số loài trong chi Lactobacillus. Đặc tính để quyết định rằng vi khuẩn có khả năng gây sâu răng hay không bao gồm: khả năng tạo nên màng sinh học trên bề mặt răng, sinh ra một lượng acid lactic cao khi lên men đường, khả năng sinh trưởng trong môi trường pH thấp [24]. Những vi khuẩn này đa số đều có mặt trong mảng bám răng miệng, nhưng chỉ với mật độ rất thấp, chưa đủ để gây nên sự khử khoáng men răng. Nhưng nếu không trực tiếp vệ sinh mảng bám thường xuyên hoặc lượng đường trong miệng liên tục cao, thì sẽ diễn ra sự mất cân bằng mật độ vi khuẩn trong mảng bám. Lúc này mật độ của những vi khuẩn gây sâu răng sẽ tăng cao, dẫn đến sự mất cân bằng pH trong khoang miệng và gây sâu răng. Mảng bám thường hình thành ở những nơi chịu ít tác động của quá trình nhai nghiền thức ăn và vệ sinh răng miệng. Những vi khuẩn gây sâu răng, thường lây từ người lớn sang trẻ nhỏ thông qua việc bú sữa mẹ, hành động móm ăn và hôn của người chăm sóc trẻ [25]. 17
  19. Đồ án tốt nghiệp 1.1.1.4.2. Nguồn carbohydrates Vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose, fructose và nhất là sucrose (đường ăn) thành acid (thường là acid lactic). Khi acid tiếp xúc với răng sẽ diễn ra quá trình khử khoáng, gây sâu răng. Dù vậy nhưng acid sinh ra bởi quá trình lên men đường của vi khuẩn có thể bị trung hòa bởi nước bọt hoặc nước súc miệng. Đối với môi trường có 2 nguồn đường glucose và fructose thì khả năng gây sâu răng không cao so với môi trường chỉ có một nguồn đường sucrose. Dù rằng sucrose là đường đôi được cấu thành từ 1 đơn vị đường đơn glucose và fructose. Lý do là vì vi khuẩn gây sâu răng cần sử dụng năng lượng của liên kết saccharide giữ glucose và fructose trong phân tử sucrose để tạo ra một hợp chất kết dính dextran polysaccharide bởi enzyme dextransucranase. n sucrose  (glucose)n + n fructose 1.1.1.4.3. Thời gian Thời gian răng bị phơi nhiễm trong môi trường acid sẽ quyết định sự sâu răng. Sau những bữa ăn, vi khuẩn sẽ bắt đầu lên men đường và sinh acid làm giảm pH. Trong khoảng thời gian nước bọt có thể trung hòa lại pH môi trường trong khoang miệng, thì một lượng khoáng trên men răng đã bị trung hòa. Vì thế sự khử khoáng gây sâu răng phụ thuộc khá nhiều vào tần suất phơi nhiễm trong môi trường pH thấp. 1.1.1.4.4. Răng Hàm lượng khoáng chiếm đến 96% trong men răng. Sự khử khoáng bắt đầu xảy ra khi pH môi trường đạt 5.5 [26]. Ngà và lớp cementum dễ bị tổn thương hơn vì chúng có hàm lượng khoáng thấp hơn men răng [27]. Có một số bệnh rối loạn ở răng nhất định ảnh hưởng đến mức độ gây sâu răng của cá thể. Bệnh hụt khoáng răng ngày càng phổ biến [28]. Nguyên nhân có thể là do yếu tố di truyền hoặc chế độ dinh dưỡng. Ngoài ra các trường hợp khác như nồng độ dioxins, polychlorinated biphenyl (PCB) cao trong sữa mẹ; trẻ sinh non, thiếu oxy trong lúc sinh; các rối loạn nhất định trong 3 năm đầu đời của trẻ như bệnh quai bị, bạch hầu, sốt xuất huyết, sởi, suy giáp, suy dinh dưỡng,… cũng ảnh hưởng đáng kể 18
  20. Đồ án tốt nghiệp đến mật độ khoáng của răng [29] [30]. Nhưng dù sao rối loạn do bệnh tật cũng không phải là nguyên chính gây sâu răng. Trường hợp thức ăn bị mắc lại trong các lỗ sâu, chân răng, kẽ răng cũng là nguyên nhân dẫn đến gây sâu răng. 1.1.1.4.5. Yếu tố khác Khả năng tiết nước bọt thấp sẽ tăng mức độ sâu răng, do tốc độ trung hòa pH trong môi trường khoang miệng diễn ra chậm. Một số hiệu thuốc lá không khói chứa hàm lượng đường cao, làm tăng khả năng gây sâu răng [31]. Việc hút thuốc có thể dẫn đến bệnh nha chu, khiến nướu co lại, để hở chân răng và tạo khoảng trống thuận lợi cho sự hình thành mảng bám. 1.1.1.5. Điều trị Nên kết hợp giữa đánh răng và dùng chỉ nha khoa thường xuyên để loại bỏ triệt để mảng bám vi khuẩn. Khám răng định kỳ mỗi 6 tháng để chuẩn đoán trạng thái của răng vì các dấu hiệu ban đầu của bệnh sâu răng rất khó nhận thấy. Hơn nữa chỉ có nha sĩ mới có đầy đủ phương tiện và khả năng chuyên môn để chẩn đoán, điều trị và đưa ra những lời khuyên cần thiết cho hàm răng của bạn. Nếu đợi đến khi răng đau rồi mới đi gặp nha sĩ thì việc điều trị sẽ trở nên phức tạp hơn, có khi phải chữa tủy răng, mỗ nướu răng hay phải nhổ răng vì đã quá muộn. Phương pháp phủ Sealant cũng nên được cân nhắc đến. Phương pháp này thường dành cho trẻ em và thanh thiếu niên, những chất liệu nha khoa phủ trên bề mặt nhai của răng che phủ đi tâm tinh thể HA, hạn chế được quá trình khử khoáng. Những nghiên cứu khoa học cho thấy ngoài việc Florua đóng vai trò ức chế sự khử khoáng của acid lên men răng, với một nồng độ cao nhất định Florua còn có khả năng diệt khuẩn [32]. Do vậy, Florua trong các sản phẩm răng miệng là một vũ khí vô cùng lợi hại trong việc phòng ngừa sâu răng. Chỉ nên đáp ứng nhu cầu năng lượng của cơ thể bằng những nguồn carbohydrates có trong trái cây, rau đậu, ngũ cốc, tinh bột. Hạn chế tối đa dùng những thực phẩm được chế biến từ sucrose (bánh kẹo, syrups, nước ngọt). Ngoài ra trái cây, 19
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược