Xem mẫu
- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP BACILLUS SUBTILIS TỪ RUỘT CÁ
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : T.S NGUYỄN THỊ HAI
Sinh viên thực hiện : HỒNG SẾCH HẾNH
MSSV: 1211100074 Lớp: 12DSH02
TP. Hồ Chí Minh, 2016
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự
hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực
phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.
Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án
tốt nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ
án tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ
án của mình.
TP. HCM, ngày 19 tháng 08 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Hồng Sếch Hếnh
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án này em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn
Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian xây dựng đề cương,
thực hiện và hoàn thành đồ án này.
Em xin cám ơn đến thầy Huỳnh Văn Thành đã giúp đỡ, hỗ trợ tạo điều kiện
tốt nhất trong suốt quá trình em thực hiện đồ án.
Em xin gửi lời cảm ơn đến quý Thầy, Cô khoa công nghệ Sinh học - Thực
phẩm - Môi trường đã tận tình chỉ bảo truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá
trình học tập để vận dụng kiến thức nền tảng ấy vào thực hiện đồ án này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình đã chăm sóc, dạy dỗ và làm chỗ
dựa tinh thần động viên, hỗ trợ kinh tế cho em trong suốt những năm qua và trong
quá trình thực hiện đồ án này.
Em cũng xin cám ơn đến các bạn cùng thực hiện đề tài trong phòng thí
nghiệm đã quan tâm, hỗ trợ em làm đồ án tốt nghiệp này.
Cuối cùng em xin cám ơn các Thầy Cô trong Hội đồng phản biện đã dành
thời gian đọc và nhận xét đồ án này.
Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cô.
Tp Hồ Chí Minh, 19 tháng 8 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Hồng Sếch Hếnh
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................1
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................2
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu ........................................................................................2
2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................ 2
2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................ 3
3. Mục đích nghiên cứu ...........................................................................................3
4. Nhiệm vụ nghiên cứu .........................................................................................3
5. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................3
6. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .......................................................................4
7. Ý nghĩa đề tài khoa học ......................................................................................4
8. Các kết quả đạt được của đề tài..........................................................................4
9. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp ...............................................................................5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................6
1. Đại cương về Bacillus subtilis ........................................................................6
1.1.Lịch sử phát hiện .................................................................................. 6
1.2.Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis ....... 6
1.2.1.Đặc điểm phân loại ............................................................................ 6
1.2.2.Phân bố .............................................................................................. 7
1.3.Đặc điểm hình thái [36] ........................................................................ 7
1.4.Đặc điểm phân lập, nuôi cấy ................................................................ 7
1.4.1.Đặc điểm phân lập. ............................................................................ 7
1.4.2.Đặc điểm sinh hóa ............................................................................. 8
1.5.Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử ............................................. 9
1.5.1.Đặc điểm tế bào ................................................................................. 9
1.5.2.Cấu tạo bào tử .................................................................................. 10
1.6.Tính đối kháng và khả năng sinh bacteriocin ..................................... 11
1.7.Ứng dụng của Bacillus trong sản xuất và đời sống [9] ...................... 11
i
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.8.Giới thiệu enzyme amylase và protease của tế bào ............................ 12
1.8.1.Enzyme amylase [12] ...................................................................... 12
1.8.2.Enzyme protease .............................................................................. 15
1.9.Một số enzyme ở cá ............................................................................ 19
1.10.1.Thành phần cá, phụ phế phẩm cá .................................................. 20
1.10.2.Tình hình đánh bắt, sản xuất ở Việt Nam ...................................... 21
1.11.Phân bón có nguồn gốc từ cá ............................................................ 23
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................24
2.1.Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................................24
2.1.1.Địa điểm nghiên cứu:....................................................................... 24
2.1.2.Thời gian nghiên cứu ....................................................................... 24
2.2.Vật liệu nghiên cứu: ........................................................................................24
2.2.3.Thiết bị và dụng cụ .......................................................................... 25
2.3.Bố trí thí nghiệm .............................................................................................26
2.3.1.Bố trí thí nghiệm chung ................................................................... 26
2.3.2.Bố trí thí nghiệm chi tiết .................................................................. 26
2.4.Phương pháp nghiên cứu.................................................................................30
2.4.1.Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu ................................................ 30
2.4.2.Phương pháp tăng sinh .................................................................... 30
2.4.3.Phương pháp pha loãng mẫu ........................................................... 30
2.4.4.Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải protein [14]
31
2.4.5.Phương pháp định tính khả năng sinh protease của 8 chủng vi khuẩn
phân lập được............................................................................................ 31
2.4.6.Kiểm tra độ thuần khiết của giống : ................................................ 32
2.4.8.Phương pháp cấy chuyền [38] ......................................................... 32
2.4.9.Phương pháp bảo quản lạnh sâu : .................................................... 32
2.4.10.Các phương pháp xác định đặc điểm hình thái ............................. 33
2.4.11.Các thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng vi khuẩn phân lập nghi
ngờ là Bacillus subtilis.............................................................................. 34
ii
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
2.4.12.Phương pháp đục lỗ thạch ............................................................. 37
2.4.13.Phương pháp nghiên cứu khả năng phân giải tinh bột, protein. .... 38
2.4.14.Phương pháp xử lý số liệu thống kê .............................................. 38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................39
3.1.Kết quả phân lập và lựa chọn các chủng có khả năng là Bacillus subtilis ......39
3.2.Kết quả thử nghiệm sinh hóa ..........................................................................42
3.2.1.Kết quả test catalase......................................................................... 42
3.2.2.Nhuộm gram .................................................................................... 42
3.2.3.Nhuộm bào tử .................................................................................. 44
3.2.4.Kết quả thử nghiệm Citrate ............................................................. 45
3.2.5.Kết quả thử nghiệm Nitrate ............................................................. 46
3.2.6.Thử nghiệm MR - VP ...................................................................... 47
3.2.7.Thử nghiệm indole........................................................................... 49
3.2.8.Thử nghiệm di động......................................................................... 50
3.2.9.Thử nghiệm lên men Carbohydrate ................................................. 51
3.2.10.Khảo sát khả năng sinh enzyme protease và amylase ngoại bào của
các chủng vi khuẩn đề tài phân lập được .................................................. 52
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................58
4.1.Kết luận ...........................................................................................................58
4.2.Đề nghị ............................................................................................................58
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................59
iii
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1 Kết quả định danh Bacillus subtiblis ..........................................................9
Bảng 1. 2 Phân loại protease theo Barret, 1984 ........................................................18
Bảng 1. 3 Thành phần khối lượng cá tra và một số loài cá khác ..............................22
Bảng 3. 1 Đặc điểm hình thái cụ thể của 8 chủng vi khuẩn đồ án phân lập được. ...39
Bảng 3. 2 Kết quả định tính enzyme ngoại bào amylase và protease của 8 chủng vi
khuẩn phân lập được. ................................................................................................53
Bảng 3. 3 Kết quả định danh sơ bộ bằng test sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân
lập từ ruột cá. .............................................................................................................55
iv
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1 Tế bào Bacillus subtilis ...............................................................................6
Hình 1. 2 Sản lượng khai thác và nuôi trồng thủy sản của Việt Nam từ 1995 - 2015
...................................................................................................................................22
Hình 2. 1 Sơ đồ bố trí các bước thí nghiệm ..............................................................26
Hình 2. 2 Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis có trong ruột cá .......27
Hình 2. 3 Quy trình dịnh danh sơ bộ các chủng phân lập được ................................29
Hình 3. 1 Kết quả thử nghiệm catalase .....................................................................42
Hình 3. 2 Hình thái tế bào các chủng vi khuẩn phân lập khi nhuộm Gram ..............44
Hình 3. 3 Kết quả nhuộm soi bào tử của chủng phân lập được ................................45
Hình 3. 4.Thử nghiệm Citrate đối với các chủng phân lập được ..............................46
Hình 3.5 Kết quả khảo sát khả năng khử nitrate của chủng vi khuẩn phân lập được.
...................................................................................................................................47
Hình 3. 6 Hình ảnh test Methyl red của các chủng phân lập được. ..........................48
Hình 3.7 Kết quả phản ứng VP của 8 chủng vi khuẩn phân lập được ......................49
Hình 3. 8 Phản ứng test indol ở các chủng được phân lập ........................................50
Hình 3. 9 Khả năng di động của 8 chủng phân lập được ..........................................51
Hình 3. 10 Hình ảnh đặc trưng của môi trường trong khảo sát khả năng lên men
đường.........................................................................................................................52
Hình 3. 11 Khảo sát định tính protease trên Casein agar với thuốc thử là TCA 10 %
...................................................................................................................................54
Hình 3. 12 Kết quả test định tính enzyme amylase của các chủng vi khuẩn phân lập
được. ..........................................................................................................................55
v
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
NA Nutrient agar
NB Nutient broth
MR Methyl red
VP Voges Progkauer
Food and Agriculture Organization of
FAO
the United Nations
TCA Trichloroacetic acid
vi
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngành chế biến thủy sản của nước ta sản lượng ngày càng tăng, mang lại
nguồn lợi lớn cho quốc gia, song bên cạnh đó, việc chế biến thủy sản không sử dụng
hết toàn bộ các phần của chúng mà để lại nguồn phụ phế phẩm rất lớn, nếu không
được xử lý sẽ lãng phí và gây ô nhiễm môi trường do quá trình phân giải các
protein, lipid…theo Trần Duy 2014, hiện nay trên toàn cầu có khoảng 70 triệu tấn
thủy sản đang được chế biến ở dạng phi lê, đông lạnh, đóng hộp hoặc ngâm tẩm.
Trong năm 2011, sản lượng cá ngừ toàn cầu đạt 4,6 triệu tấn, tuy nhiên sản phẩm cá
ngừ đóng hộp chỉ có gần 2 triệu tấn [32], điều này có nghĩa là lượng phụ phẩm cá
ngừ thải ra từ công nghiệp chế biến cá ngừ này lên đến hơn 2 triệu tấn. Việc đánh
bắt, chế biến thủy sản xuất khẩu luôn đi kèm theo một lượng phụ phế phẩm khá lớn,
theo thống kê của Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO)
lượng phụ phế phẩm bao gồm: đầu, xương, da, vây, vẩy, thịt vụn và nội tạng cá thải
ra trong quá trình chế biến đồ hộp chiếm từ 30 – 65 %, trong sản xuất cá phi lê, cá
khô, cá muối, cá xông khói lượng phụ phế phẩm thải ra chiếm từ 50 – 75 %. Sản
xuất chế biến cá lấy phi lê, dùng đóng hộp thường chỉ lấy phần cơ, các phụ phế
phẩm sản xuất cá ngừ đóng hộp có thế chiếm khoảng 65 % lượng nguyên liệu ban
đầu, trong ngành sản xuất thịt cá ngừ cho thấy các phế phẩm, phụ phẩm chiếm
khoảng 50 % tổng nguyên liệu ban đầu, đối với cá basa thì phụ phế phẩm trong chế
biến cá phi lê gồm đầu, xương, mỡ, da, nội tạng, thịt vụn… và chúng chiếm khoảng
65 – 70 % lượng nguyên liệu ban đầu [19].
Phụ phế phẩm trong sản xuất chế biến thủy sản cá có thành phần là các chất
hữu cơ giàu Nitơ, nếu sử dụng không đúng mục đích và xử lý không tốt chúng dễ bị
phân hủy thành các chất gây ô nhiễm không khí (các protein khi bị vi sinh vật phân
giải sẽ hình thành H2S, NH3…) và nhiều chất khác gây ô nhiễm cả nguồn đất,
nguồn nước, ảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống, sức khỏe con người và môi
trường, chính vì vậy cần có giải pháp khắc phục vần đề trên. Tìm ra được các
chủng vi sinh vật có khả năng phân giải protein là một giải pháp hữu hiệu, an toàn,
tận dụng hiệu quả nguồn phụ phế phẩm từ ngành công nghiệp chế biến thủy sản nói
chung và chế biến cá nói riêng, từ đó có cách tận dụng hiệu quả.
Trong ruột cá có hiện diện vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease phân
giải tốt protein cá, đặc biệt là các chủng Bacillus [19]. Nhiều chủng Bacillus đã
được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, sản
xuất enzyme, probiotic…. Và cả trong sản xuất phân bón vi sinh phân giải lân,
silicat, ức chế vi sinh vật gây bệnh, phân giải cellulose… (Lê Thị Hồng Nhung,
2015).
1
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Các chủng vi sinh vật này có sẵn trong môi trường và cả ruột cá, (Rahul
Krishnan, 2014), chúng tự phát triển hỗ trợ tiêu hóa cho cá khi còn sống và cùng
các loài khác tiết enzyme phân giải cá khi cá chết đi. Trong điều kiện tự nhiên
chúng sinh trưởng được nhưng cần thời gian dài nhưng chúng sẽ phát triển nhanh
chóng, tối ưu nếu như được tăng sinh hoạt hóa giống từ chủng thuần khiết, lúc này
các chủng vi sinh vật này cho sản phẩm enzyme nhiều và tốt hơn, rút ngắn được
thời gian xử lý phân giải nguồn phụ phế phẩm cá và cho ra sản phẩm tốt hơn, hiệu
quả lên men tốt hơn.
Sản xuất nông nghiệp hữu cơ là một phương pháp canh tác tiến bộ, chứa đựng
trong đó là hàm lượng khoa học công nghệ và tính nhân văn cao (Lê Văn Hưng,
2001). Tính nhân văn cao ở chỗ là tất cả các công đoạn trong sản xuất nông nghiệp
hữu cơ đều hướng đến sự an toàn cho con người, vật nuôi và môi trường sinh thái
xung quanh, hướng đến một hành tinh xanh và sạch [5]. Việt Nam là một nước có
dân số sản xuất nông nghiệp lớn, diện tích đất sản xuất nông nghiệp lớn. Theo thống
kê năm 2013, tổng diện tích đất nông nghiệp là 262.805 km2 (chiếm tới 79,4 %) bao
gồm đất sản xuất nông nghiệp là 101.511 km2, đất lâm nghiệp là 153.731 km2, đất
nuôi trồng thuỷ sản là 7.120 km2 [7]. Vì vậy nhu cầu phân bón cho sản xuất nông
nghiệp lớn. Mặt khác sử dụng phân bón hóa học không có lợi cho đất, phân bón hóa
học làm giảm pH của đất, chúng được hấp thụ nhanh, bón lượng lớn và ít các chất
dinh dưỡng, cây hấp thụ không hết làm ô nhiễm môi trường đất.
Từ những cơ sở trên, đề tài “phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ ruột cá”
được thực hiện để tận dụng hiệu quả và an toàn nguồn tài nguyên này là cần thiết.
2. Tình hình nghiên cứu
2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Bacillus subtilis được nghiên cứu khá rộng rãi trong nước nhằm sử dụng cho
mục đích sản xuất probiotic, thu nhận enzyme…
Một số công trình nghiên cứu như phân lập và ứng dụng Bacillus subtilis tiết
các loại protease như:
Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009. Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng Bacillus
phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm.
Bùi Thị Phi, 2007. Phân lập, khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis
và tìm hiểu khả năng sinh enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn để sản xuất thử
nghiệm chế phẩm sinh học.
2
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Nghiên cứu tận dụng cá phế liệu để sản xuất dịch cao đạm dùng trong thức
ăn nuôi tôm, cá của Đặng Thị Mộng Quyên và Trần Thị Xô, 2006.
Nghiên cứu khảo sát khả năng thủy phân protein phụ phẩm cá tra bằng
enzyme protease từ Bacillus subtilis S5 của Nguyễn Thị Nếp, 2005.
2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Syeda Azeem Unnisa sản xuất phân bón từ thức ăn thừa có bổ sung đường
nâu.
Mrunmaya Kumar Panda cùng cộng sự đã nghiên cứu phân lập Bacillus sp
ưa nhiệt từ suối nước nóng có hoạt tính protease cao. Cũng đã có một số công trình
nghiên cứu phân lập Bacillus subtilis từ ruột cá như của Jamal K.H. Al Faragi và
Sundus A.A. Alsaphar, 2012 hay của Rahul Krishnan phân lập từ cá nước ngọt,
2014.
3. Mục đích nghiên cứu
Phân lập được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sinh enzyme
protease mạnh từ ruột cá.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
Phân lập và chọn lọc được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sinh
enzyme protease mạnh từ ruột cá.
Định danh sơ bộ bằng các test sinh hóa.
Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme của chủng vi khuẩn
phân lập được.
5. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp tổng hợp tài liệu:
+ Thu thập, tìm hiểu các tài liệu tham khảo, sách, giáo trình và internet liên
quan đến đề tài.
+ Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu của đề tài.
- Phương pháp nghiên cứu:
+ Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease và tuyển chọn
các chủng có khả năng sinh enzyme mạnh nhất từ nguồn ruột cá.
3
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
+ Thực hiện một số khảo sát về hình thái, thử nghiệm sinh hóa đặc trưng cho các
chủng Bacillus subtilis để tuyển chọn chủng mong muốn, loại các vi sinh vật có
nguy cơ gây bệnh.
+ Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng sinh enzyme protease phân hủy protein từ
các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn.
+ Khảo sát khả năng thủy phân protein từ phụ phế phẩm cá từ chủng phân lập
được.
- Phương pháp thu thập và xử lý số liệu:
+ Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát.
+ Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System (SAS).
6. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng:
Nghiên cứu thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải
protein từ nguồn ruột cá thu thập từ chợ.
- Phạm vi giới hạn đề tài:
Vi khuẩn Bacillus subtilis phân giải protein có nguồn gốc từ cá.
7. Ý nghĩa đề tài khoa học
- Ý nghĩa khoa học:
Phân lập được chủng vi khuẩn B.subtilis có khả năng phân giải protein đạt
hiệu quả cao, góp phần xác định một số đặc điểm về hình thái tế bào và hình thái
khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn nhóm B.subtilis, xác định được điều kiện yếu
tố pH tố nhất đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn phân lập được.
- Ý nghĩa thực tiễn:
Dựa trên kết quả thí nghiệm nghiên cứu thu được để góp phần tìm ra chủng
vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease mạnh ứng dụng để tạo ra các sản phẩm
phân bón tận dụng phụ phế phẩm từ cá và bảo vệ môi trường.
8. Các kết quả đạt được của đề tài
- Phân lập được 8 chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease phân
giải protein từ cá, từ kết quả phân lập sau khi định danh sơ bộ bằng các phản ứng
test sinh hóa đặc trưng của Bacillus subtilis thì trùng khớp.
4
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
-Kết quả khả năng tổng hợp enzyme protease được thực hiện cho các chủng
vi khuẩn phân lập được trên môi trường nhân tạo giàu protein làm cơ sở để sản xuất
chế phẩm phân bón từ nguồn phụ phế phẩm cá.
-Bước đầu ứng dụng vi khuẩn phân lập tuyển chọn được vào xử lý thủy phân
protein từ phụ phế phẩm cá.
9. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
- Phần Mở đầu.
- Chương 1: Tổng quan tài liệu - nội dung chương đề cập đến các nội dung
liên quan đến tài liệu nghiên cứu.
-Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - nội dung chương đề cập
đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
-Chương 3: Kết quả và thảo luận - nội dung chương đưa ra những kết quả mà
đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được.
-Phần Kết luận và đề nghị: nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đạt
được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài.
5
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Đại cương về Bacillus subtilis
1.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis lần đầu tiên được phát hiện năm 1835 và được đặt tên là “vibrio
subtilis” bởi nhà khoa học là Christian Gottfried Ehrenberg.
Vào năm 1972 nó được đổi tên thành Bacillus subtilis bởi Ferdinand Cohn.
Ngày nay, vi khuẩn này đã được sử dụng rất rộng rãi trong y học, chăn nuôi và
thực phẩm (Lý Kim Hữu, 2005)
1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
1.2.1. Đặc điểm phân loại
Theo phân loại của Bergey (1994) Bacillus subtilis thuộc:
Lãnh giới: Bacteria
Giới: Monera
Ngành: Firrmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacilales
Họ: Baccilaceae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
Hình 1. 1 Tế bào Bacillus subtilis
(Nguồn: http://www.bharatvyapar.in/mitushi-pharma/bacillus-subtilis)
6
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.2.2. Phân bố
Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí túy nghi [21], chúng phân bố rộng khắp
mọi nơi trong tự nhiên, chúng được tìm thấy trong các tầng trên của đất, đường tiêu
hóa của động vật nhai lại và của con người [36], Bacillus subtilis thường được tìm
thấy nhiều ở cỏ khô nên chúng cũng còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô. Phần lớn
chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu
cfu/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus
subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử
và tế bào Bacillus subtilis (trích Bùi Thị Phi, 2007). Trong ruột cá cũng có sự tồn tại
của chủng loài vi khuẩn này [19], [40].
Bacillus subtilis là một trực khuẩn có lợi trong hệ vi khuẩn đường ruột, chúng ức
chế sự phát triển của các vi sinh vật có hại đối với đường tiêu hóa [11].
1.3. Đặc điểm hình thái [36]
Bacillus subtilis là trực khuẩn gram dương, hai đầu tròn, phản ứng catalase
dương tính, chúng có khả năng tạo bào tử để tồn tại trong môi trường khắc nghiệt.
B.subtilis có các roi giúp chúng di chuyển, vì vậy chúng có khả năng di chuyển
nhanh chóng trong chất lỏng. Kích thước tế bào của chúng khoảng 0,5 - 0,8 µm ×
1,8 - 3 µm [37].
Khi gặp điều kiện bất lợi, Bacillus subtilis sẽ hình thành bào tử để vượt qua điều
kiện bất lợi, nếu gặp điều kiện thuận lợi bào tử Bacillus subtilis sẽ nảy mầm và phát
triển như một tế bào mới với chu kỳ sống mới. Bào tử B.subtilis có hình bầu dục,
kích thước khoảng 0,6 - 0,9 µm. Phân bố không theo quy tắc chặt chẽ nào, lệch tâm,
gần tâm nhưng không chính tâm.
1.4. Đặc điểm phân lập, nuôi cấy
1.4.1. Đặc điểm phân lập.
Bacillus subtilis phát triển tốt nhất trong điều kiện có oxy và nhiệt độ thích hợp
của chúng là 36 – 50 0C, tối đa khoảng 60 0C (trích Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009),
nhiệt độ tối thích cho loài vi khuẩn này sinh trưởng là 37 0C (Bùi Thị Phi, 2007).
Trong điều kiện thiếu oxy loài vi khuẩn này vẫn có khả năng tồn tại, phát triển
yếu nhờ khả năng lên men các nguồn carbonhydrate của chúng.
Độ pH: pH tối ưu của Bacillus subtilis là trong khoảng 7 - 7,4.
Khi nuôi cấy trên môi trường đĩa thạch, khuẩn lạc B.subtilis khô, không màu
hoặc màu xám trắng, có dạng tròn, không đều hay phân tán, rìa răng cưa không đều,
mép nhăn, tâm có màu sẫm, sau 1 - 4 ngày thì bề mặt khuẩn lạc trờ nên nhăn nheo
và khô, màu hơi nâu.
7
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Trên môi trường lỏng NB thì B.subtilis phát triển mạnh làm đục môi trường,
song song đó vi khuẩn kết màng phía trên bề mặt môi trường nuôi cấy.
1.4.2. Đặc điểm sinh hóa
Bacillus subtilis có một số test sinh hóa đặc trưng sau:
Lên men nhưng không sinh hơi các loại đường Glucose, Maltose, Mannitol,
Sucrose, Xylose, Arabinose.
Indol (-), VP (+), Nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), Catalase (+), Amylase (+),
Casein (+), Citrate (+), có khả năng di động và hiếu khí.
8
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Bảng 1. 1 Kết quả định danh Bacillus subtiblis
Phản ứng sinh hóa Kết quả
Catalase +
Indol -
MR +
VP +
Citrate +
Nitrate +
Gelatin +
Di động +
Amylase +
Arabinose +
Xylose +
Saccharose +
Mannitol +
Glucose +
Lactose -
Maltose +
(Theo Holt, 1992) (trích bởi Lý Kim Hữu, 2005)
1.5. Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử
1.5.1. Đặc điểm tế bào
Tế bào Bacillus subtilis hình que, là tế bào gram dương, chúng có khả năng sinh
ra bào tử để tồn tại qua thời điểm khó khăn, điều kiện môi trường khắc nghiệt như
nhiệt độ tăng cao, môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, khô hạn….
Thành phần hóa học chủ yếu của vách tế bào là lớp peptidoglycan dày mang
diện tích dương đóng vai trò là duy trì cấu trúc của vách tế bào.
9
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.5.2. Cấu tạo bào tử
Bacillus subtilis sinh bào tử, chiều ngang bào tử không vượt quá chiều ngang
của tế bào vi khuẩn nên không làm thay đổi hình thái tế bào mang bào tử [11].
Bào tử là một cấu trúc hình thành do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong
một giai đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn như điều kiện môi
trường không thuận lợi, tế bào phát triển đến một giai đoạn nhất định. Hai chủng vi
khuẩn gram dương có khả năng tạo bào tử là Bacillus và Clostridium.
Bào tử vi khuẩn là một cấu trúc rất phức tạp [38], bào tử có nhiều lớp màng bao
bọc, lớp ngoài cùng gọi là lớp màng khá mỏng và đó là lớp vỏ của tế bào mẹ, ngay
dưới đó là lớp áo bào tử, lớp áo bào tử gồm nhiều lớp protein mỏng và không có
tính thấm, lớp áo bào tử này đảm bảo tính kháng của bào tử.
Vỏ của bào tử gồm nhiều lớp peptidoglycan chiếm một thể tích khá lớn, ít cầu
nối nội peptide và ít liên kết chéo. Trong cùng của bào tử là lõi bào tử được vách
bào tử bao bọc có cấu trúc như một tế bào bình thường nhưng đang trong tình trạng
bất hoạt [38].
1.5.2.1. Đặc điểm của bào tử
Bào tử ở Bacillus subtilis không phải là hình thức sinh sản như ở nấm mà chúng
là dạng cấu trúc đặc biệt có tính kháng chuyên biệt giúp chủng loài tồn tại qua giai
đoạn điều kiện sống bất lợi. Bào tử không chỉ có khả năng lưu tồn tốt trong những
điều kiện khó khăn của môi trường sống mà chúng còn có khả năng sống rất lâu
(bào tử trong xác sinh vật cổ đại 1000 năm hoặc dưới đáy băng hà 3000 năm hoặc
trong quặng mỏ 250 triệu năm đến nay vẫn còn sống) [11].
Nhiệt độ 100 0C, bào tử của một số loài Bacillus có thể chịu đựng được từ 2,5 -
20 giờ.
Ngoài việc chịu được nhiệt độ khô cao, bào tử có thể chịu được khô hạn cũng
như tác động của nhiều loại hóa chất cũng như các loại tia sáng [11].
Quá trình hình thành bào tử: các tế bào sinh bào tử trong những điều kiện thiếu
thức ăn hoặc có tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá
trình hình thành bào tử.
Trong bào tử nước liên kết chiếm đến 40 % và chứa nhiều ion Ca2+.
Sự nảy mầm của bào tử
10
- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Quá trình chuyển từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn được
gọi là quá trình nảy mầm của bào tử. Quá trình này gồm 3 giai đoạn là: hoạt hóa,
nảy mầm và sinh trưởng [11].
Khả năng tạo bào tử: theo Bùi Thị Phi, 2007 thì một trong những đặc điểm quan
trọng nhất của Baciluss subtilis là khả năng sinh bào tử trong những điều kiện nhất
định. Bacillus subtilis hình thành bào tử theo chu kỳ sống hay khi gặp điều kiện bất
lợi [11].
Theo Bùi Thị Phi, 2007 sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn và mất đến 8
giờ để hoàn tất.
1.5.2.2. Sự hình thành bào tử
Hình thành những búi chất nhiễm sắc.
Tế bào chất bắt đầu phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là tiền
bào tử.
Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ.
Lớp vỏ sơ khai hình thành giữ hai lớp màng của bào tử sau khi đã tích lũy nhiều
peptidoglycan và tổng hợp DPA (acid dipicolinic), tích lũy calci, tính chiết quang
cao.
Kết thúc việc hình thành áo bào tử
Kết thúc việc hình thành vỏ bào tử, bào tử thành thục, bắt đầu có tính kháng
nhiệt.
Bào nang vỡ ra giải phóng bào tử ra ngoài [38].
1.6. Tính đối kháng và khả năng sinh bacteriocin
Trong mỗi môi trường và điều kiện môi trường khác nhau, mỗi chủng loài vi
khuẩn lại có khả năng sinh trưởng và phát triển khác nhau. Khi thay đổi môi trường
sống của chúng hay các yếu tố môi trường bất lợi làm điều kiện môi trường sống
thay đổi theo chiều hướng bất lợi cho vi sinh vật sẽ làm chúng sinh trưởng và phát
triển kém đi hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật.
Theo Bùi Thị Phi, nếu môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của
Bacillus subtilis với số lượng lớn sẽ cạnh tranh sinh dưỡng và không gian sống giữa
vi khuẩn và nấm. Bacillus phát triển khá nhanh nên sẽ phát triển trước so với nấm
nên sẽ sử dụng phần lớn chất dinh dưỡng và sinh ra một số chất ức chế sự phát triển
của nấm bệnh.
1.7. Ứng dụng của Bacillus trong sản xuất và đời sống [9]
11
nguon tai.lieu . vn
