1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Bacillus để phân giải protein gây dị ứng trong khô dầu đậu nành với phương pháp lên men bán rắn

Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Bacillus để phân giải protein gây dị ứng trong khô dầu đậu nành với phương pháp lên men bán rắn

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus có khả năng ngoại tiết protease cao và ứng dụng chủng vi khuẩn này để lên men bán rắn nhằm loại bỏ các protein gây dị ứng trong khô dầu đậu nành (glycinin, beta-conglycinin). Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN BACILLUS ĐỂ PHÂN GIẢI PROTEIN GÂY DỊ ỨNG TRONG KHÔ DẦU ĐẬU NÀNH VỚI PHƯƠNG

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 85

Ngày tạo 10/11/2021 12:24:17 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 2.46 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Baci... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN BACILLUS ĐỂ PHÂN GIẢI PROTEIN GÂY DỊ ỨNG TRONG KHÔ DẦU ĐẬU NÀNH VỚI PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Phạm Huỳnh Ninh Sinh viên thực hiện : Lê Huỳnh Hoài Thương MSSV: 1311100732 Lớp: 13DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Phạm Huỳnh Ninh Bộ môn Dinh dưỡng và Thức ăn chăn nuôi, Phân viện chăn nuôi Nam Bộ (IASVN). Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác dưới bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án này là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án của mình. TP.HCM, ngày 16 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Lê Huỳnh Hoài Thương 1
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gởi lời tri ân chân thành đến TS. Phạm Huỳnh Ninh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian xây dựng đề cương và hoàn thành đồ án. Em xin cám ơn anh Lê Quang Trí và Vũ Minh đã động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện. Đồng thời, em cũng gởi lời cám ơn đến quý Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian dài học tập. Với những kiến thức mà em đã tiếp thu được không chỉ giúp cho em thực hiện đồ án tốt nghiệp mà còn là nền tảng kiến thức cho công việc sau này. Em xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn chăm sóc, tạo điều kiện cho em đến trường theo đuổi ước mơ và là chỗ dựa vững chắc không chỉ về tinh thần mà cả vật chất cho em trong suốt những năm qua. Em cũng xin gởi lời cám ơn chân thành đễn các bạn cùng thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm CNSH – Phân viện chăn nuôi Nam Bộ - những người luôn động viên, sát cánh và giúp đỡ hết mình để em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này. Cuối cùng, em xin cám ơn các Thầy Cô trong hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Em xin gửi đến quí Thầy Cô lời chúc sức khỏe. TP.HCM, ngày 16 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Lê Huỳnh Hoài Thương 2
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC .........................................................................................................................i DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... iii DANH MỤC ĐỒ THỊ .....................................................................................................iv DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................... v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ..........................................................................................vi MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 4 1.1 Tổng quan về nghiên cứu sản xuất khô dầu đậu nành ........................................ 4 1.1.1 Lên men khô dầu đậu nành để giảm thiểu chất gây dị ứng ......................... 4 1.1.2 Vấn đề sử dụng khô dầu nành lên men ........................................................ 5 1.2 Tổng quan về Bacillus ........................................................................................ 6 1.2.1 Vi khuẩn Bacillus......................................................................................... 6 1.2.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis ............................................................................ 8 1.3 Tổng quan về protease ...................................................................................... 11 1.3.1 Khái niệm ................................................................................................... 11 1.3.2 Phân loại .................................................................................................... 11 1.3.3 Hoạt tính protease ở đậu nành ................................................................... 12 1.4 Giới thiệu về lên men bán rắn .......................................................................... 13 1.4.1 Những vấn đề cơ bản của lên men bán rắn ................................................ 13 1.4.2 Những ưu điểm của lên men bán rắn ......................................................... 13 1.4.3 Sự tạp nhiễm trong lên men bán rắn .......................................................... 14 1.4.4 Các giai đoạn của lên men bán rắn ............................................................ 15 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................... 17 2.1 Vật liệu ............................................................................................................. 17 2.1.1 Nguyên vật liệu .......................................................................................... 17 2.1.2 Thiết bị và dụng cụ .................................................................................... 17 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 2.2 Môi trường nghiên cứu ..................................................................................... 17 2.2.1 Môi trường phân lập và giữ giống Bacillus ............................................... 17 2.2.2 Môi trường khảo sát hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn............... 18 2.2.3 Hóa chất SDS-PAGE ................................................................................. 19 2.3 Các phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 19 2.3.1 Phương pháp phân lập, giữ giống vi khuẩn Bacillus ................................. 19 2.3.2 Phương pháp định danh ............................................................................. 22 2.3.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính protease .................................................. 27 2.3.4 Khảo sát các điều kiện thích hợp cho lên men khô dầu đậu nành ............. 31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 40 3.1 Phân lập và định danh các chủng Bacillus ....................................................... 40 3.2 Khảo sát hoạt tính protease của vi khuẩn ......................................................... 42 3.2.1 Xác định dựa trên vòng phân giải .............................................................. 42 3.2.2 Xác định dựa trên cơ chất khô dầu đậu nành ............................................. 44 3.3 Khảo sát các điều kiện lên men ........................................................................ 46 3.3.1 Khảo sát độ ẩm thích hợp cho lên men ...................................................... 46 3.3.2 Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho lên men................................................... 48 3.3.3 Khảo sát độ dày thích hợp cho lên men cơ chất ........................................ 50 3.3.4 Khảo sát thời gian lên men thích hợp ........................................................ 51 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 54 4.1 Kết luận............................................................................................................. 54 4.2 Kiến nghị .......................................................................................................... 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 55 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 1 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học và axít amin của khô dầu đậu nành tách vỏ Mỹ............ 5 Bảng 1.2. Đặc điểm sinh hóa của chủng Bacillus subtilis ............................................. 9 Bảng 2.1. Trình tự bổ sung hóa chất để xây dựng đường chuẩn Tyrosine ................... 29 Bảng 2.2. Các bước xác định hoạt tính enzyme protease ............................................. 30 Bảng 3.1. Kết quả các thử nghiệm sinh hóa .................................................................. 41 Bảng 3.2. Kết quả vòng phân giải gelatin ..................................................................... 42 Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme protease (U/g) .................................................................. 44 Bảng 3.4. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ ở các mức độ ẩm khác nhau ............................................................................................................................... 46 Bảng 3.5. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ ở các mức nhiệt độ khác nhau ............................................................................................................................... 48 Bảng 3.6. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ ở các mức độ dày khác nhau ............................................................................................................................... 50 Bảng 3.7. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ khác nhau..................... 52 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1. Biểu thị đường kính vòng phân giải gelatin ................................................ 43 Đồ thị 3.2. Biểu thị hoạt tính enzyme sau các mốc thời gian ....................................... 44 Đồ thị 3.3. Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian ở các mức độ ẩm khác nhau....................................................................................................................... 47 Đồ thị 3.4. Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian ở các nhiệt độ khác nhau ............................................................................................................................... 49 Đồ thị 3.5. Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian ở các độ dày khác nhau ............................................................................................................................... 51 Đồ thị 3.6. Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian khác nhau ........ 53 iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ chế phẩm Natto ......................................... 40 Hình 3.2. Hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi .......................................................... 40 Hình 3.3. Đường kính vòng phân giải gelatin ............................................................... 42 Hình 3.4. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức độ ẩm khác nhau....................................................................................................................... 47 Hình 3.5. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức nhiệt độ khác nhau ................................................................................................................. 49 Hình 3.6. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức độ dày khác nhau....................................................................................................................... 51 Hình 3.7. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức thời gian khác nhau............................................................................................................... 53 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ctv cộng tác viên IU đơn vị quốc tế rpm vòng/phút SCA Simmon Citrate Agar SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis Std Thang chuẩn Đc Đối chứng vi
  10. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU ❖ Đặt vấn đề Khô dầu đậu nành, sản phẩm của quá trình tách chiết dầu từ hạt đậu nành, chủ yếu được sử dụng để chế biến thức ăn chăn nuôi gà và heo, chiếm khoảng 74% tổng sản lượng (Chen và ctv, 2010). Khô dầu đậu nành thường được sử dụng với tỷ lệ khoảng 10- 20% trong khẩu cho heo và gà. Đây là nguồn cung cấp protein rất tốt cho vật nuôi do có hàm lượng các axít amin không thay thế cao. Tuy nhiên, việc sử dụng khô dầu đậu nành trong khẩu phần thức ăn cho gia súc, gia cầm non (hệ tiêu hóa chưa hoàn thiện) bị hạn chế, hiệu quả không cao do khô dầu đậu nành chứa một số protein gây dị ứng. Hai protein gây dị ứng chủ yếu trong đậu nành là glycinin (globulin 11S) và β- conglycinin (globulin 7S). Chúng chiếm hơn 50% tổng lượng protein trong hạt đậu nành (Samoto và ctv, 2007). Glycinin là một protein với cấu trúc gồm 5 tiểu đơn vị mà mỗi một tiểu đơn vị gồm một chuỗi polypeptide mang tính axít (khối lượng phân tử 35-40 kDa) và một chuỗi polypeptide mang tính bazơ (22 kDa) liên kết với nhau bằng liên kết disulfua (Helm và ctv, 2000; Beardslee và ctv, 2000; Hou và ctv, 2004; Golubovic và ctv, 2005). Tổng lượng glycinin khoảng 20-70mg/g khô dầu đậu nành và chiếm đến 40% tổng khối lượng protein trong đậu nành (van Eys và ctv, 2004; Sun và ctv, 2008). Glycinin có khả năng bền nhiệt và kháng hầu hết các enzyme trong hệ tiêu hóa do có liên kết disulfua khá bền (Kuipers và ctv, 2007). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, glycinin gây dị ứng cho người và vật nuôi non do có khả năng gắn globulin miễn dịch E (IgE) vào chuỗi axít polypeptide của mình. Nó làm tăng hàm lượng kháng thể glycinin-IgE trong huyết thanh và đây là nguyên nhân gây dị ứng (Sun và ctv, 2007). Mặt dù khá nhiều nghiên cứu cho thấy glycinin liên quan đến các triệu chứng của dị ứng như biến đổi hình dáng nhung mao, đảo lộn chức năng miễn dịch, tăng trưởng chậm và tiêu chảy. 1
  11. Đồ án tốt nghiệp Tuy nhiên, cơ chế tác động của glycinin như thế nào hiện vẫn chưa được sáng tỏ. Một vài nghiên cứu đề nghị rằng các tế bào phì hay dưỡng bào (mast cells) có liên quan trực tiếp đến tính nhạy cảm của vật nuôi đối với protein glycinin. Các dưỡng bào này nằm trong các lông tơ của ruột non để thực hiện chức năng nhu động và các quy trình đáp ứng miễn dịch (Schneider và ctv, 2002). Các dưỡng bào này đóng vai trò chủ đạo trong các phản ứng nhạy cảm của cơ thể vật nuôi hay con người đối với phức hợp glycinin- IgE thông qua một chuỗi các hoạt động như kích thích sản xuất một lượng lớn histamine hay các cytokine miễn dịch (van Wijk và ctv, 2007). Tóm lại, glycinin trong khô dầu đậu nành gây kích ứng miễn dịch ở động vật con, làm tăng hàm lượng globulin miễn dịch (IgE, IgG), giải phóng histamine, làm tăng nhu động và sự bài tiết nước của ruột non, dẫn đến tăng tỷ lệ heo con bị tiêu chảy, giảm năng suất (Li và ctv, 1991; Zhao và ctv, 2008; Sun và ctv, 2008; Hao và ctv, 2009). Trong khi đó β-conglycinin là phân tử protein chứa 3 tiểu đơn vị khác nhau α (72 kDa), α’ (72 kDa) và β (53 kDa) (Doyle và ctv, 1986). Khô dầu đậu nành chứa khoảng 3-40 mg/g β-conglycinin (van Eys và ctv, 2004). β-conglycinin có khả năng kháng lại các enzyme thủy phân so với các protein khác trong đậu nành. Các tiểu đơn vị của β- conglycinin có thể kết tạo khối trong ruột non, giấu vị trí hoạt động (bám) đối với enzyme nên nó khó bị tiêu hóa trong hệ tiêu hóa (Kuipers và ctv, 2007). Tương tự như glycinin, β-conglycinin cũng làm giảm sinh trưởng ở heo con thông qua việc làm tăng hàm lượng globulin miễn dịch (IgE) trong huyết thanh, phá hủy tính toàn vẹn của ruột non, làm giảm khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng (Hao và ctv, 2009; Zhao và ctv, 2010). Tóm lại, tuy khô dầu đậu nành là nguồn protein rất tốt cho vật nuôi nhưng nó cũng chứa nhiều chất gây dị ứng. Các chất này gây kích ứng miễn dịch, tiêu chảy, ức chế enzyme tiêu hóa, giảm tỷ lệ tiêu hóa, do đó làm giảm tăng trọng và năng suất của vật nuôi, đặc biệt là vật nuôi giai đoạn non. Việc loại bỏ các chất có ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe của vật nuôi là một đòi hỏi của thực tế sản xuất nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu, góp phần giảm chi phí thức ăn. 2
  12. Đồ án tốt nghiệp Từ những nhân định trên tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN BACILLUS ĐỂ PHÂN GIẢI PROTEIN GÂY DỊ ỨNG TRONG KHÔ DẦU ĐẬU NÀNH VỚI PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN”. ❖ Mục tiêu, phạm vi đề tài Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus có khả năng ngoại tiết protease cao và ứng dụng chủng vi khuẩn này để lên men bán rắn nhằm loại bỏ các protein gây dị ứng trong khô dầu đậu nành (glycinin, beta-conglycinin). ❖ Ý nghĩa đề tài Phân lập được chủng vi khuẩn có đặc tính tốt trong sản sinh protease chuyển hóa protein đậu nành, ứng dụng trong lên men khô dầu đậu nành, phục vụ trong chăn nuôi, tiết giảm chi phí ❖ Địa điểm nghiên cứu Phân viện chăn nuôi Nam Bộ, khu phố Hiệp Thắng, phường Bình Thắng, Dĩ An, Bình Dương. ❖ Thời gian nghiên cứu Từ ngày 17/4/2017 đến 16/7/2017 3
  13. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về nghiên cứu sản xuất khô dầu đậu nành 1.1.1 Lên men khô dầu đậu nành để giảm thiểu chất gây dị ứng Có khá nhiều phương pháp để giảm thiểu tác động hay phân hủy các chất trong khô dầu đậu nành. Trong đó, phương pháp lên men vi sinh vật (với Bacillus, Aspergillus và Lactobacillus) nhằm loại bỏ các chất gây dị ứng trong đậu nành đã được nghiên cứu và ứng dụng trong thực tiễn sản xuất trên thế giới. Trong quá trình lên men, vi sinh vật phân hủy carbohydrate của khô dầu nành và sử dụng chúng để phát triển. Việc giảm lượng vật chất khô và tăng mật độ vi sinh làm tăng lượng protein trong khô dầu đậu nành. Thêm vào đó, các vi sinh vật dùng cho quá trình lên men còn có khả năng tiết ra môi trường amylase, protease, cellulase có khả năng phân hủy các protein, gây dị ứng và tăng tính dễ tiêu hóa của các chất dinh dưỡng trong khô dầu đậu nành. Chen và ctv (2010) cũng đã tiến hành lên men bán rắn khô dầu đậu nành với Aspergillus oryzae và lên men kết hợp Aspergillus oryzae với Lactobacillus casei. Cả 2 phương pháp lên men đều cho thấy kết quả tốt trong việc tăng cường tính hữu dụng của protein với hàm lượng trichloroacetic cao, khả năng tiêu hóa protein in vitro cao. Lên men bán rắn khô dầu đậu nành sử dụng vi khuẩn thuộc giống Bacillus cũng giúp loại bỏ các chất kháng dinh dưỡng, tăng cường các hoạt chất chống oxy hóa, tăng tỷ lệ tiêu hóa ở heo (Wongputtisin và ctv, 2007; Feng và ctv, 2007a; Hu và ctv, 2010). Phương pháp lên men sử dụng Bacillus subtilis tỏ ra có nhiều lợi thế hơn so với lên men bằng Aspergillus oryzae trong việc loại bỏ các protein gây dị ứng và cải thiện chất lượng thành phần các axít amin (Frias và ctv, 2007). Bào tử hay tế bào của vi khuẩn Bacillus trong khô dầu đậu nành lên men còn được xem như nguồn cung cấp probiotic, có lợi cho sức khỏe đường ruột của vật nuôi. 4
  14. Đồ án tốt nghiệp Phương pháp lên men sử dụng vi khuẩn Bacillus, Lactobacillus tỏ ra có nhiều lợi thế hơn so với lên men với nấm mốc do sản phẩm có lượng protein hòa tan cao hơn, khả năng phân giải các protein gây dị ứng tốt hơn, sinh trưởng nhanh hơn (Mukherjee và ctv, 2016). Bảng 1.1. Thành phần hóa học và axít amin của khô dầu đậu nành tách vỏ Mỹ Stt Thành phần % vật chất Stt Thành phần % vật chất khô khô 1 Đạm thô 47,8 12 Leucin 3,57 2 Xơ thô 3,1 13 Valin 2,26 3 Béo 1,5 14 Histidine 1,22 4 Khoáng tổng số 6,4 15 Phenylalanin 2,33 5 Lysin 2,99 16 Tyrosin 0,4 6 Methionin 0,68 17 Glycin 1,99 7 Cystein 0,73 18 Serin 2,32 8 Threonine 1,85 19 Prolin 2,34 9 Tryptophan 0,65 20 Alanin 2,02 10 Arginin 3,43 21 Aspartic axít 5,42 11 Isoluecin 2,1 22 Glutamic 8,58 1.1.2 Vấn đề sử dụng khô dầu nành lên men Khá nhiều nghiên cứu ở ngoài nước đã tiến hành lên men khô dầu đậu nành bằng vi sinh vật nhằm loại bỏ các chất gây dị ứng và đã sử dụng sản phẩm sau lên men cho nhiều đối tượng vật nuôi. Khô dầu đậu nành lên men chứng tỏ có thể giúp tăng cường hoạt động của enzyme tiêu hóa và tăng tỷ lệ tiêu hóa protein, cải thiện tăng trọng và sức khỏe đường ruột, giảm tỷ lệ tiêu chảy ở heo và gà, đặt biệt là heo con và gà con (Mathivanan và ctv, 2006; Cho và ctv, 2007; Feng và ctv, 2007b; Liu và ctv, 2007; Song và ctv, 2010; Cervantes-Pahm và Stein, 2010; Xu và ctv, 2012; Zhang và ctv, 2013; Kim và ctv, 2014). Nghiên cứu của Gebru và ctv (2010) cho thấy, khi sử dụng 5% khô dầu đậu nành lên men bằng Bacillus subtilis trong khẩu phần của heo con, lượng thức ăn ăn vào và tăng trọng tương đương với heo cho ăn khẩu phần có bổ sung 100 mg/kg kháng 5
  15. Đồ án tốt nghiệp sinh cholotetracycline và cao hơn heo ở khẩu phần không sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên, hầu như không có bất kỳ nghiên cứu nào liên quan đến việc sản xuất chế phẩm khô dầu đậu nành lên men dùng cho chăn nuôi và có rất ít các nghiên cứu sử dụng sản phẩm khô dầu đậu nành lên men giàu protein này cho chăn nuôi ở nước ta được công bố. Hiện tại, có ít nhất 5 loại sản phẩm khô dầu đậu nành lên men đã được nhập khẩu và phân phối đại trà tại Việt Nam (Soytide của công ty CJ-Hàn Quốc; P-up 50 và EPS 500 của Thái Lan; Supersoy và Dabomb-P của công ty Suchiang-Đài Loan) với giá bán từ 19.000-21.000 đ/kg, so với giá khô dầu đậu nành (không lên men) chỉ khoảng 10.000- 11.000 đ/kg. Chúng ta thấy rằng giá bán của khô dầu đậu nành gần như tăng gấp đôi sau khi lên men. Hiện tại có khá nhiều nhà máy chế biến thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam đã sử dụng khô dầu đậu nành lên men trong thức ăn cho heo con như thức ăn Delice B của Proconco, Comfeed651 của công ty Japfa, S1 primary diets của công ty spotlight và viên sữa H-10 của công ty RTD. Với 3,9 triệu nái trong đàn lợn của Việt Nam, thì mỗi tháng lượng tiêu thụ khô dầu nành lên men là rất lớn, khoảng 20 ngàn tấn/tháng (> 200 ngàn tấn/năm). Như vậy, nếu chúng ta có thể sản xuất khô dầu nành lên men từ 3 triệu tấn nguyên liệu này và cung cấp cho thị trường trong nước thì giá trị thặng dư sẽ rất lớn. Đề tài thành công đồng nghĩa với việc khô dầu đậu nành lên men sẽ được sản xuất tại Việt Nam với giá cả cạnh tranh hơn sản phẩm ngoại nhập do tiết kiệm được chi phí nhập khẩu và vận chuyển, đồng thời giảm lệ thuộc vào công nghệ của nước ngoài. 1.2 Tổng quan về Bacillus 1.2.1 Vi khuẩn Bacillus Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli 6
  16. Đồ án tốt nghiệp Bộ: Bacilliales Họ: Bacilliaceae Chi: Bacillus Vi khuẩn thuộc chi Bacillus là nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ khô. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm. Vi khuẩn thuộc chi Bacillus là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước 0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn thường có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng axít, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng. Các loài vi khuẩn này lên men các loại đường như: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose và arabinose. Nhiệt độ tối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4. Vi khuẩn Bacillus đã được ứng dụng rất nhiều trong thực tế sản xuất từ lên men sản xuất các sản phẩm truyền thống phục vụ cho con người (đậu natto, nước mắm, cá hộp…) đến lên men sản xuất các sản phẩm trong lĩnh vực y dược, da giày, chăn nuôi. Một ứng dụng khác của vi khuẩn thuộc Bacillus là thành phần của thuốc trừ sâu sinh học. Chủng vi khuẩn thường được sử dụng trong các sản phẩm dạng này là Bacillus thuringiensis. Enzym protease tách chiết từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus (chủ yếu từ Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis) được sử dụng rộng rải trong bột giặt, kem đánh răng, giày da. Một số các protease mạnh nhất được sản xuất từ Bacillus licheniformis, B. subtilis, B.amyloliquefaciens và B. mojavensis. Việc sản xuất protease của vi sinh thường chịu tác động bởi sự biến động nguồn carbon và nitơ, sự thay đổi trong tỷ lệ C/N, sự hiện 7
  17. Đồ án tốt nghiệp diện của một số loại đường dễ dàng chuyển hóa, chẳng hạn như glucose. Một số yếu tố vật lý như nhiệt độ, pH… cũng có ảnh hưởng đến sản xuất protease 1.2.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis 1.2.2.1 Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis. Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời. Bacillus subtilis được sử dụng ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy…Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường… 1.2.2.2 Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường trong đất trồng trọt có khoảng 106 – 107 CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì (trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo, 8
  18. Đồ án tốt nghiệp trong các thực phẩm như mắm, tương, chao… Bacillus subtilis đóng vai trò đáng kể về mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học. 1.2.2.3 Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước nhỏ 3 – 5 x 0,6 µm, tế bào thường nối với nhau thành chuỗi hoặc đứng riêng rẽ, có khả năng di động, gồm 8 – 12 lông, có bào tử hình elip nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kích thước 0,8 – 1,8 µm. Vị tró của bào tử trong tế bào sinh dưỡng không theo bất cứ một nguyên tắc chặt chẽ nào, có thể lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm. Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định, mỗi tế bào sinh dưỡng sinh ra một bào tử. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi. Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới. Bacillus subtilis phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ... 1.2.2.4 Đặc điểm sinh hóa Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi trường thiếu oxi, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 37oC, pH 7 – 7,4, tối ưu ở pH 7,2, Vi khuẩn lên men không sinh khí các loại đường: Glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose, arabinose và một số hoạt tính khác được liệt kê trong bảng sau Bảng1.2. Đặc điểm sinh hóa của chủng Bacillus subtilis Phản ứng Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol - 9
  19. Đồ án tốt nghiệp MR + VP + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Tan chảy Gelatine + Di động + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + 1.2.2.5 Đặc điểm nuôi cấy Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát triển được trong môi trường thiếu oxy. Nhiệt độ tối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4. Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ bản: Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. 10
  20. Đồ án tốt nghiệp Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều. Trên môi trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 4 cm sau 72 giờ nuôi cấy. Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi lượng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như glucose) và nitơ (như peptone). 1.3 Tổng quan về protease 1.3.1 Khái niệm Protease hay peptide hydrolase là những enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide (-O-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thủy phân này có thể là acid amine, các polypeptide chuỗi ngắn. Nhiều enzyme protease còn có thể xúc tác phản ứng thủy phân liên kết ester, liên kết amide và phản ứng chuyển vị gốc acid amin. 1.3.2 Phân loại Các nhà khoa học đã phân loại protease của vi sinh vật thành 4 nhóm sau: Protease serin: là những protease có chứa nhóm (-OH) của serin trong trung tâm hoạt động. Các protease serin thường hoạt động ở pH kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng. Protease thiol: là những protease có chứa nhóm thiol (-SH) của axít amin cystein trong trung tâm hoạt động. Nhóm (-SH) có khả năng phản ứng cao, tham gia nhiều biến đổi hóa học như: axít hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa... Các protease thiol thường hoạt động mạnh ở pH trung tính và có tính đặc hiệu rộng. Protease axít: là những protease chứa nhóm (-COOH) trong trung tâm hoạt động. Các nhóm (-COOH) thuộc mặt bên của asparagin hoặc axít glutamic hay ở đầu Carbon 11
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược