1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro phục vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc

Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro phục vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định nồng độ NAA và BA tối ưu lên sự tái sinh chồi và nhân nhanh chồi lan kim tuyến; xác định nguồn mẫu (các mô hay cơ quan của lan kim tuyến) phù hợp cho hiệu suất chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. Mời các bạn cùng tham khảo. tên đề tài.txt Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyển (Anoectochilus Setaceus) in Vitro phục vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc Giảng viên hướng dẫn: TS. Hà Thị Loan SV: Nguyễn Thị Kim Ng

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 78

Ngày tạo 10/11/2021 12:32:04 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 2.04 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan k... (.pdf)

Xem mẫu

  1. tên đề tài.txt Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyển (Anoectochilus Setaceus) in Vitro phục vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc Giảng viên hướng dẫn: TS. Hà Thị Loan SV: Nguyễn Thị Kim Ngân Lớp: 13DSH01 MSSV: 1311101018 Page 1
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của Tiến sĩ Hà Thị Loan. Các số liệu sử dụng phân tích trong đồ án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây, nếu phát hiện có bất kỳ gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. TP. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 6 năm 2017 Sinh viên trường ĐH Công Nghệ TP.HCM Nguyễn Thị Kim Ngân
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bài luận văn này, em luôn nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp Lãnh đạo, các tập thể và cá nhân. Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, quý thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã dạy dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức chuyên môn bổ ích trong suốt bốn năm học vừa qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn và sự tri ân sâu sắc đến Ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện về kinh phí và trang thiết bị để em thực hiện đề tài này. Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Tiến sĩ Hà Thị Loan cùng với những Anh (Chị) cán bộ làm việc tại phòng Thực nghiệm cây trồng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được học hỏi, tiếp cận những kiến thức thực tế, tích lũy nhiều kinh nghiệm về thao tác trong phòng thí nghiệm. Đồng thời các Anh (Chị) đã góp ý, bổ sung và chỉnh sửa những kiến thức thiếu sót để em có thể hoàn thành tốt đề tài này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể bạn bè, người thân, gia đình những người đã luôn bên cạnh em, cổ vũ tinh thần và đã ủng hộ em trong suốt thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn! TP. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 6 năm 2017 Sinh viên trường ĐH Công Nghệ TP.HCM Nguyễn Thị Kim Ngân
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. iv DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................v DANH MỤC BIỂU ĐỒ ........................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ vii LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................1 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................4 1.1. Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật ...................................4 1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô thực vật .........................................................4 1.1.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật..............................5 1.1.3. Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật .......................................................12 1.1.4. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô thực vật ...........13 1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ...........................................14 1.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng .......................................................................14 1.2.2. Nuôi cấy mô sẹo .......................................................................................14 1.2.3. Nuôi cấy tế bào đơn .................................................................................15 1.2.4. Nuôi cấy tế bào trần ................................................................................15 1.2.5. Nuôi cấy hạt phấn ....................................................................................16 1.2.6. Nuôi cấy protoplast..................................................................................16 1.3. Chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ................16 1.3.1. Đặc điểm và cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào chủ ......................................................................................................................16 1.3.2. Vai trò, chức năng của oncogen rol (root inducing locus) .....................19 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3. Tình hình nghiên cứu rễ tóc trên một số loài dược liệu và cây trồng .....21 1.4. Tổng quan về cây lan kim tuyến ..................................................................22 1.4.1. Nguồn gốc và phân bố .............................................................................22 1.4.2. Phân loại. .................................................................................................23 1.4.3. Đặc điểm hình thái...................................................................................23 1.4.4. Điều kiện sinh sống của lan kim tuyến ....................................................25 1.4.5. Giá trị dược liệu của lan kim tuyến .........................................................25 1.4.6. Nhân giống cây lan kim tuyến .................................................................26 1.4.7. Tình hình nghiên cứu cây lan kim tuyến ..................................................27 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................29 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................29 2.2. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................29 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ..............................................................................29 2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất .........................................................29 2.2.3. Môi trường nuôi cấy ................................................................................31 2.2.4. Điều kiện nuôi cấy ...................................................................................31 2.3. Phương pháp ...................................................................................................31 2.3.1. Pha môi trường .....................................................................................31 2.3.2. Các thao tác trong phòng cấy .................................................................32 2.4. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................33 2.5. Bố trí thí nghiệm ..........................................................................................33 2.5.1. Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy chồi lan kim tuyến ......................................................................................................33 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.5.2. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến. .....................................................................................................34 2.5.3. Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes .............36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............. Error! Bookmark not defined. 3.1. Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến… ..................................................................................................................38 3.2. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến. ..............................................................................................................43 3.3. Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ......................48 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................54 4.1. Kết luận. .........................................................................................................54 4.2. Kiến nghị ........................................................................................................54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................55 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CNSH Công Nghệ Sinh Học TPHCM Thành phố Hồ Chí Minh MS Murashige – Skoog BA Benzyl Adenin NAA Napthalene Acetic Acid BAP 6-Benzyl Amino Purine 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid IBA 3-Indole butyric acid IAA 3-Indole acetic acid NT Nghiệm thức ĐC Đối chứng Cs Cộng sự YMB Yeast mannitol broth B5 Gamborg’s iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thời gian và nồng độ các chất khử trùng (Street, 1974) ............................6 Bảng 2.1. Khảo sát nồng độ BA và NAA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến ............34 Bảng 2.2. Khảo sát nồng độ BA và NAA dùng để nhân nhanh chồi lan kim tuyến .35 Bảng 2.3. Các cơ quan của lan kim tuyến được chuyển gen ....................................37 Bảng 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi lan kim tuyến sau 8 tuần theo dõi.....................................................................................................39 Bảng 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến sau 8 tuần theo dõi.....................................................................................................44 Bảng 3.3. Khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes chủng 15834 và chủng TR7 sau 4 tuần nuôi cấy. ....................................................................................................................48 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến số chồi và chiều cao chồi của mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy. ...............................................40 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến tỷ lệ tái sinh chồi của mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy. .......................................................41 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến số chồi và chiều cao chồi của mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy. ...............................................46 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ................................................19 Hình 1.2. Lan kim tuyến ở ngoài vườn ươm .............................................................23 Hình 2.1. Cây Lan Kim tuyến ngoài tự nhiên ...........................................................29 Hình 3.1. Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi lan kim tuyến. ..............38 Hình 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên sự nhân nhanh chồi lan kim tuyến44 Hình 3.3. Ảnh hưởng của việc chuyển gen chứa vi khuẩn Agobacterium rhizogenes chủng Tr7 và chủng 15834 vào các cơ quan của lan kim tuyến sau 4 tuần nuôi cấy ở các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, NT4. ...................................................................51 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU I. Đặt vấn đề Từ xưa đến nay, lan được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa dành cho bậc vương giả. Lan là một loài hoa được trồng rất phổ biến ở Việt Nam nói riêng và ở các nước trên thế giới nói chung. Lan ở việt nam tượng trưng cho một vẻ đẹp thuần khiết, thanh cao và mang nhiều ý nghĩa. Cùng với sự phát triển của ngành trồng lan trong thời gian qua, loài hoa quý này không chỉ hấp dẫn mọi du khách do sự đa dạng về hình dáng và màu sắc mà còn mang lại giá trị hiệu quả kinh tế cao. Họ Lan Orchidaceae là một trong số những họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi. Thông thường Lan được sử dụng làm cảnh. Ngoài ra, có nhiều loài Lan còn được sử dụng làm thuốc (Nguyễn Tiến Bân, 2005). Chi Lan kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài Lan kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall. ex Lindl. được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó. Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài Lan kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, Lan kim tuyến được cấp báo trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và trong Sách Đỏ Việt Nam (2007), phân hạng EN A1a,c,d (Sách Đỏ Việt Nam, 2007). Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào trần đã được công bố trên nhiều loài cây dược liệu, đáng chú ý là sản xuất và thương mại hóa shikonin, berberine and ginseng ở Nhật Bản. Tuy nhiên sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng phương pháp nuôi cấy tế bào vẫn còn một số tồn tại như dòng tế bào không ổn định, năng suất thấp và khi nuôi cấy quy mô lớn gặp khó khăn như dễ bị lây nhiễm, việc điều chỉnh nguồn khí oxy, … (Rao and Ravishankar, 2002). Hướng mới để sản xuất các hợp chất thứ cấp là nuôi cấy rễ chuyển gen (rễ tóc). Nuôi cấy rễ tơ, loại rễ hình 1
  12. Đồ án tốt nghiệp thành do sự xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào mô thực vật bị tổn thương từ lâu đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như phân tích chức năng của gen, biểu hiện protein ngoại lai, sản xuất các hợp chất thứ cấp hay biến đổi thành phần các chất chuyển hóa ở thực vật (Lê Thu Ngọc và cs, 2013). Công nghệ chuyển gen tạo rễ tóc cho phép nhanh chóng thu được sinh khối lớn trong thời gian ngắn đã thành công trên một số loài thực vật, điển hình là sâm ngọc linh đem lại hiệu quả cao. Trên thế giới cũng như trong nước đã có một số đề tài nghiên cứu về lan kim tuyến: Nhân sinh khối in vitro loài Anoectochilus formosanus (Chow và cs, 1982). Nhân nhanh chồi in vitro loài lan kim tuyến - Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. (Phùng Văn Phê và cs, 2010)… Lan kim tuyến được xem như là loài dược liệu quý cho sức khỏe con người nên hiện nay loài thực vật này đang có nguy cơ bị người dân khai thác cạn kiệt để bán cho các thương nhân nước ngoài bởi giá trị kinh tế cao với mức giá dao động từ 1,2 – 1,6 triệu đồng / 1 kg lá tươi. Mặt khác khả năng tái sinh của cây lan kim tuyến trong tự nhiên thấp, đặc biệt là những nơi môi trường sinh thái bị tàn phá. Loài thực vật này chủ yếu mọc trong rừng già trên vùng núi cao, nơi có ẩm độ cao và nhiệt độ thấp, ở những nơi đất tốt và tơi xốp, không có ánh sáng trực tiếp của mặt trời (Dương Đức Chiến, 2014). Chính vì môi trường sống ngoài tự nhiên khá khó khăn cũng như loài dược liệu quý này có giá trị kinh tế cao nên việc ứng dụng công nghệ nuôi rễ tóc thu sinh khối là cần thiết. Xuất phát từ những cơ sở đó, người thực hiện đề tài đã tiến hành: “Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro phục vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc”. II. Mục đích, nhiệm vụ và phương pháp nghiên cứu 1. Mục đích Đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về loài lan (Anotoecchilus setaceus Blume), chi Lan kim tuyến. 2
  13. Đồ án tốt nghiệp Tạo nguồn vật liệu in vitro làm vật liệu cho các nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tóc. 2. Nhiệm vụ Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến. Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. 3. Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm SAS và Microsoft Excel 2010. III. Các kết quả đạt được và kết cấu của đồ án. 1. Các kết quả đạt được của đề tài Xác định nồng độ NAA và BA tối ưu lên sự tái sinh chồi và nhân nhanh chồi lan kim tuyến. Xác định nguồn mẫu (các mô hay cơ quan của lan kim tuyến) phù hợp cho hiệu suất chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. 2. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Đồ án gồm 4 chương - Chương 1: Tổng quan tài liệu. - Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết quả và thảo luận. - Chương 4: Kết luận và kiến ghị. 3
  14. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật 1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô thực vật Theo Dương Công Kiên (2002), những mốc chính trong lịch sử phát triển của công nghệ tế bào thực vật: Năm 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào. Năm 1838: Mattias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào. Năm 1902: Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng không thành công. Năm 1904: Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải Crucifers. Năm 1922: Knudson và Bot. Gaz. Cho hạt phong lan nảy mầm in vitro. Năm 1924: Blumenthal và cộng sự nuôi cấy hình thành callus từ rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic. Năm 1929: Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hòa hợp khi lai ở Linum spp. Năm 1934: White đã thành công khi nuôi cấy mô rễ cà chua trong thời gian dài. Năm 1934: Kogl và cộng sự lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, 1 phytohormone thực vật đầu tiên có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Năm 1936: LaRue và Bull đã nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau. Năm 1939: Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy, mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá. 4
  15. Đồ án tốt nghiệp Năm 1941: Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cà rốt. Năm 1942: Gautheret lần đầu tiên theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp trong nuôi cấy mô sẹo thực vật. Năm 1950: Morel lần đầu tiên nuôi cấy thành công cây một lá mầm bằng nước dừa. Từ năm 1950 – 1960: Hàng loạt thành công tiếp theo trong nuôi cấy mô như nuôi cấy cây 1 lá mầm, nuôi cấy noãn, nuôi cấy phát sinh cơ quan, nuôi cấy câh sạch virus, vi ghép, nuôi cấy đơn bội, tái sinh phôi soma, sản xuất sinh khối thực vật, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng,… Năm 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật- môi trường MS. Từ năm 1964 – 1998: hàng loạt các công trình thành công trong nuôi cấy mô như cải tiến môi trường và phương pháp nuôi cấy, chuyển gene để lai tạo giống mới thương mại hóa sản phẩm nuôi cấy mô. Giai đoạn hiện nay, ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào sản xuất các hợp chất thứ cấp, nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. 1.1.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.2.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật a. Điều kiện vô trùng Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối thiểu cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy. Vì thế, nuôi cấy in vitro luôn được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng, mô nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, chết (Dương Công Kiên, 2002). Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao. 5
  16. Đồ án tốt nghiệp  Các bước để xử lý khử trùng bề mặt mẫu vật - Chọn lựa mẫu cấy tốt nhất, rửa kỹ mẫu bằng nước máy (trong dòng chảy) cho sạch bụi bẩn. - Ngâm rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng trong 3 phút (lắc nhẹ liên tục trong quá trình ngâm). - Rửa sạch xà phòng bằng nước máy (trong dòng chảy). Chuyển vào tủ đã được xử lý, vô trùng mẫu từ trước, mọi thao tác từ đây đều phải áp dụng các biện pháp vô trùng. - Dùng kẹp vô trùng gắp chuyển mẫu sang dung dịch khử trùng (kẹp này không dùng lại nữa nếu không khử trùng lại), ngâm (lắc nhẹ) mẫu trong dung dịch khử trùng trong thời gian ấn định. - Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần. Nếu rửa không sạch, chất khử trùng có thể làm chết mẫu. - Nhập mẫu sau khi khử trùng chuyển mẫu ra giấy thấm đặt trên đĩa petri vô trùng. Tiến hành cắt tỉa tách mẫu, tỉa bỏ các phần dập nát, hư hỏng và cấy chuyền ngay vào môi trường đã chuẩn bị trước. Bảng 1.1. Thời gian và nồng độ các chất khử trùng (Street, 1974) Tác nhân vô trùng Nồng độ Thời gian xử lý Hiệu quả (%) (phút) Calcium hypochorite 9 – 10 5 – 30 Rất tốt Natri hypochlorite 2 5 – 30 Rất tốt Hydro peroxide 10 – 12 5 – 15 Tốt Nước Brom 1–2 2 – 10 Rất tốt HgCl2 0,1 – 1 2 – 10 Trung bình Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60 Khá tốt 6
  17. Đồ án tốt nghiệp b, Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính ảnh hưởng cơ bản đến quá trình sinh trưởng của mô nuôi cấy.  Ánh sáng Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: cường độ chiếu sáng, thời gian chiếu sáng và chất lượng ánh sáng. Trong tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng phù hợp nằm trong khoảng 2000 – 2500 lux. Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao hơn để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng, có khả năng quang hợp. Trong giai đoạn này, cường độ ánh sáng được Murashige (1974) đề nghị là 3.000 – 10.000 lux và nhiều phòng thí nghiệm cho rằng con số 40 – 75 µmol/m2/s (tương đương 3.300 – 6.200 lux) là thích hợp (Edwin, 1993).  Nhiệt độ Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng ở nhiều loài cây là 250C (Nguyễn Văn Uyển, 1993). 1.1.2.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy (Dương Công Kiên, 2002). Có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy thực vật khác nhau. Trong đó, có một số môi trường cơ bản được sử dụng phổ biến như: MS, B5, SH có hàm lượng khoáng 7
  18. Đồ án tốt nghiệp đa lượng cao. Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau: - Các muối khoáng đa lượng và vi lượng. - Nguồn cacbon. - Các vitamin. - Các chất điều hòa sinh trưởng. - Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây… a. Các muối khoáng đa lượng và vi lượng Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg (Trần Văn Minh, 2010). Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu. Trước đây, khi kĩ thuật nuôi cấy mô mới ra đời, người ta không nghĩ tới việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy. Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Co, I, …(Trần Văn Minh, 2010). b. Nguồn cacbon Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối. Các loại đường thường được sử dụng là saccharose, d-glucose, d-fructose. Saccharose là nguồn các cacbon được sử dụng rộng rãi nhất cho các loại cây, nồng độ saccharose thay đổi từ 2 – 3% hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống, tuổi mẫu cấy, giai đoạn sinh trưởng và yêu cầu thí nghiệm (Dodds và Roberts, 1985). c. Các vitamin Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của 8
  19. Đồ án tốt nghiệp chúng. Trong nuôi cấy in vitro thì một số vitamin được bổ sung vào môi trường và trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng như: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol (Trần Văn Minh, 2010). Thiamine là một vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào. Vitamin C đôi khi được sử dụng ở nồng độ cao như là một chất chống oxi hóa. Myo- inositol có vai trò quan trọng cho sự phân chia tế bào vì thúc đẩy sự hình thành thành tế bào. Thường sử dụng ở nồng độ cao 50 – 100 ppm (Trần Văn Minh,2010). d. Chất điều hòa sinh trưởng Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (plant growth regulator), có tên khoa học là phytohormon, là chất hữu cơ có mặt trong cây với hàm lượng rất nhỏ nhằm tham gia vào điều khiển quá trình trao đổi chất và các quá trình hình thành mới các cơ quan ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây. Cho đến nay người ta đã tìm được rất nhiều chất tự nhiên hoặc nhân tạo ảnh hưởng rất mạnh đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Người ta chia các phytohormon ra làm 5 nhóm chính: Auxin, Gibberrellin, Cytokinin, Abcisic acid và Ethylene (Nguyễn Văn Uyển, 1993). Trong đó, auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất.  Nhóm các auxin Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các cytokinin. Các auxin sử dụng có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp bao gồm (IAA, NAA, 2,4-D, IBA) chủ yếu được sử dụng để kích thích sự phân bào và tạo rễ nhưng nếu sử dụng liều lượng quá cao dễ tạo ra các đột biến (Hoàng Minh Tấn và CS, 1993). Vai trò sinh lý của Auxin - Kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào. 9
  20. Đồ án tốt nghiệp - IAA kích thích chồi bên sản sinh ra ethylene làm ức chế sinh trưởng chồi đỉnh. - Kích thích hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vô tính. - 2,4-D sử dụng rộng rãi cho sự phát sinh mô sẹo. - Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus). - Kích thích tạo chồi bất định ở nồng độ thấp.  Nhóm các cytokinin Trong nuôi cấy mô thực vật, cytokinin dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994). Trong môi trường nuôi cấy, tỷ lệ Auxin/Cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ, nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi, ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo. Cytokinin gồm có kinetin, BAP, zeatin, TDZ. - Kinetin hình thành và phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao từ chế phẩm DNA có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi. - Zeatin thực chất là một dẫn xuất của adenine có tác dụng kích thích sự tạo chồi nhưng giá thành cao nên ít sử dụng. - BAP có hoạt tính cao hơn kinetin và bền nhiệt với độ cao hơn zeatin. Vai trò sinh lý của nhóm Cytokinin - Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng chồi in vitro. - Kìm hãm sự già hóa và kéo dài tuổi thọ của cây. - Ức chế sự hình thành rễ. - Kích thích sự nảy mầm của hạt, củ. - Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh. e. Các chất hữu cơ bổ sung 10
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược