- Trang Chủ
- Công nghệ - Môi trường
- Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng cá Basa
Xem mẫu
- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Đề tài :
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN
QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME
PROTEASE TỪ NỘI TẠNG CÁ BASA.
NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN : PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG
CN ĐỖ THỊ TUYẾN
SINH VIÊN THỰC HIỆN : TRẦN TÚ NHI
MSSV : 107111115 LỚP : 07DSH3
TP. HỒ CHÍ MINH, 2011
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
MỞ ĐẦU
A. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI :
Trong sản xuất và đời sống, các loại enzyme nói chung và protease nói riêng
được sử dụng ngày càng phổ biến. Chế phẩm protease được sản xuất chủ yếu nhờ vi
sinh vật, một số ít có nguồn gốc từ thực vật, mô động vật. Gần đây, do yêu cầu về
vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng nghiêm ngặt, chi phí cho kiểm tra chất lượng
ngày càng cao. Trong khi đó chế phẩm protease thu nhận từ mô động vật và thực
vật được coi là tuyệt đối an toàn nên ngày càng thu hút được sự quan tâm của các
phòng thí nghiệm cũng như các nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thương
mại. Nguồn nguyên liệu từ nội tạng động vật để thu chế phẩm protease ngày càng
khan hiếm và không kinh tế do nội tạng động vật thường được dùng làm thực phẩm
và dùng để ghép tạng cho những bệnh nhân đặc biệt. Protease trong cơ thể cá, đặc
biệt là ở cơ quan tiêu hóa đã được biết đến từ lâu nhưng lại chưa được nghiên cứu
đầy đủ và cũng chưa có công nghệ thu nhận, tinh chế protease từ nội tạng cá. Vì
vậy, những công trình nghiên cứu về protease nội tạng và phương pháp chiết rút
chúng đang được ráo riết tiến hành ở nhiều nước có nghề cá phát triển.
Việt Nam là một trong những quốc gia có nghề cá phát triển, với trên 200
loài cá kinh tế, sản lượng 1,5 triệu tấn/năm. Tuy sản lượng lớn nhưng phần được sử
dụng hữu ích từ cá chỉ chiếm khoảng gần 50%. Nghĩa là hàng năm có trên 700.000
tấn phế liệu, trong đó có trên 30.000 tấn nội tạng cá. Theo thói quen, nội tạng cá chỉ
được sử dụng làm bột cá chăn nuôi, một phần được chế biến nước mắm, phần lớn bị
thải bỏ vào môi trường vừa lãng phí vừa là nguồn gây ô nhiễm môi trường.
Tình hình trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học là sử dụng hợp
lý và hiệu quả lượng phế liệu cá rất lớn do các nhà máy chế biến cá tạo ra hàng
ngày để sản xuất ra những sản phẩm mới, có giá trị cao.
SVTH : Trần Tú Nhi 1 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
Với mong muốn góp phần giải quyết yêu cầu trên, em thực hiện đề tài
“Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch
enzyme protease từ nội tạng cá Basa”.
B. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU :
Mục đích chung là nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết
và tinh sạch enzyme từ nội tạng cá, cũng như tính chất của enzyme này.
C. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU :
1. Xác định quy trình tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng cá :
- Xác định tỷ lệ dung môi chiết : mẫu.
- Xác định dung môi chiết enzyme protease.
- Xác định thời gian chiết enzyme protease.
- Xác định tỷ lệ (nồng độ) tác nhân kết tủa thu chế phẩm enzyme thô.
- Xác định tác nhân kết tủa thu chế phẩm enzyme thô.
- Tinh sạch chế phẩm enzyme thô bằng sắc ký lọc gel.
- Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS – PAGE.
2. Khảo sát một số tính chất của enzyme protease nội tạng cá :
- Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nhiệt độ.
- Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease.
- Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo pH.
- Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nồng độ muối ăn.
- Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease khi có mặt một số ion kim
loại, chất đặc hiệu nhóm.
SVTH : Trần Tú Nhi 2 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
D. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU :
1. Phương pháp tách chiết, thu nhận và tinh sạch enzyme protease :
- Chiết rút thu dịch chiết.
- Thu nhận chế phẩm enzyme protease.
- Tinh sạch enzyme protease bằng sắc ký lọc gel.
- Phân tách enzyme protease bằng điện di trên gel polyacrylamide.
2. Các phương pháp phân tích :
- Xây dựng đường chuẩn albumin.
- Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford.
- Xây dựng đường chuẩn tyrosine.
- Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano.
E. KẾT CẤU ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP :
Đồ án tốt nghiệp gồm :
- Chương 1 : Tổng quan tài liệu
- Chương 2 : Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
- Chương 3 : Kết quả và thảo luận
- Chương 4 : Kết luận và đề nghị
SVTH : Trần Tú Nhi 3 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
SVTH : Trần Tú Nhi 4 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
1.1 MỘT SỐ KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ENZYME :
1.1.1 Giới thiệu chung về enzyme :
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme tham gia xúc
tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho quá
trình chuyển hóa các chất trong cơ thể với tốc độ nhịp nhàng, cân đối theo chiều
hướng xác định. Do đó đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống.
Hiện nay người ta đã khám phá hơn 2000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme
thu được ở dạng tinh thể. Enzyme ngày nay được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả
trong mọi lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp đặc biệt
là công nghiệp chế biến thực phẩm : bia, rượu, bánh mì, tương chao, nước mắm…
1.1.2 Bản chất, cấu trúc enzyme :
1.1.2.1 Bản chất của enzyme :
Enzyme là protein có hoạt tính sinh học nên nó có đủ tính chất của protein.
Giống với các protein hình hạt khác, enzyme có thể hòa tan trong nước, dung dịch
đệm phosphate, dung dịch đệm Tris, dung dịch muối sinh lý…
Dung dịch enzyme có tính chất của dung dịch keo ưa nước. Enzyme trong
dung dịch dễ dàng bị kết tủa dưới tác dụng của muối trung hòa như sulphatamon
hoặc các dung môi hữu cơ như ethanol, acetone ở nhiệt độ thấp nhưng không bị mất
hoạt tính xúc tác. Do đó, có thể dùng các tác nhân này để thu chế phẩm enzyme.
Ngược lại dưới tác dụng của các yếu tố gây biến tính protein (nhiệt độ cao, acid
hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng nồng độ cao) enzyme thường bị mất khả năng
xúc tác. Và mức giảm hoạt tính tương ứng với mức độ biến tính của phân tử protein
– enzyme.
1.1.2.2 Cấu trúc enzyme :
Phân tử enzyme một thành phần cũng như hai thành phần đều chứa phần
protein. Enzyme một cấu tử trong thành phần phân tử chỉ có protein. Enzyme hai
cấu tử trong thành phần cấu tạo gồm : protein (“feron” hoặc “apoenzyme”) và phi
protein (“agon” hoặc “coenzyme”). Trung tâm hoạt tính của enzyme chiếm phần rất
SVTH : Trần Tú Nhi 5 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
nhỏ với phân tử enzyme nhưng có vai trò quan trọng trong việc tham gia kết hợp
đặc hiệu với cơ chất trong quá trình xúc tác.
Ở các enzyme một cấu tử, trung tâm thường bao gồm một tổ hợp các nhóm
chức acid amin liên kết lại với nhau. Nhờ có cấu trúc bậc 3,4 các nhóm này tuy nằm
cách xa nhau trong mạch polypeptide, nhưng do xoắn cuộn mạch mà được gần nhau
hơn. Với enzyme hai cấu tử, ngoài một số nhóm chức của acid amin còn có nhóm
ngoại tham gia trung tâm hoạt tính enzyme.
1.1.3 Danh pháp và phân loại enzyme :
Theo quy ước quốc tế, tên enzyme thường được gọi theo cơ chất đặc hiệu
của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó tên enzyme
thường có hai phần : phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân của
phản ứng.
Năm 1960, Hiệp hội hóa sinh quốc tế đã thống nhất phân loại enzyme ra làm
6 lớp sau :
- Oxydoreductase : enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử.
- Transpherase : enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị.
- Hydrolase : enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân.
- Liase : enzyme tham gia xúc tác cho phản ứng loại CO2 hay phản ứng tách
thuận nghịch phân tử nước.
- Isomerase : enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hỗ phức tạp
giữa galactose và glucose.
- Ligase : enzyme này xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa pyruvic tạo thành
oxaloacetic acid.
1.1.4 Cơ chế tác dụng của enzyme :
Bản chất của phản ứng enzyme là khi có sự tham gia xúc tác của enzyme,
các cơ chất sẽ được hoạt hóa mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất hóa học của cơ
chất, kết quả sau phản ứng sẽ tạo ra những sản phẩm của phản ứng. Do tác dụng của
SVTH : Trần Tú Nhi 6 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
enzyme cơ chất có thể có những thay đổi không chỉ về cấu trúc hóa học, mà còn
thay đổi tính chất hóa học. Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra 3 giai đoạn :
- Giai đoạn thứ nhất : enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu,
nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất. Phức hệ này thường không bền.
Phản ứng tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất thường xảy ra nhanh và đòi hỏi
một ít năng lượng.
- Giai đoạn thứ hai : khi cơ chất tạo phức với enzyme thì sẽ bị thay đổi cả cấu
hình không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết. Kết quả các liên
kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm.
- Giai đoạn thứ ba : đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm được tạo thành và
tách khỏi enzyme.
Cơ chế xúc tác tổng quát của enzyme được trình bày như sau :
E + S ES E + P
E : enzyme ; S : cơ chất ; ES : Phức hệ enzyme – cơ chất ; P : Sản phẩm
1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme :
Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như : bản chất và
nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, pH môi trường phản ứng, nhiệt độ, các ion kim
loại, các chất vô cơ và hữu cơ khác ( có tác dụng kìm hãm hay hoạt hóa enzyme).
1.1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất :
Ở giai đoạn đầu của phản ứng, khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ enzyme sẽ
phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất. Khi nồng độ cơ chất đủ lớn sao cho tất cả
nồng độ enzyme đều tham gia phản ứng để tạo ra phức hợp enzyme – cơ chất, phản
ứng sẽ tạo ra được vận tốc cực đại. Nhưng đôi khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất lên
thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng.
1.1.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme :
Nói chung, trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến
tính vào nồng độ enzyme. Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, tốc độ phản
ứng tăng chậm hoặc không tăng.
SVTH : Trần Tú Nhi 7 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
1.1.5.3 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hóa :
Hoạt tính enzyme có thể thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ và hữu
cơ khác nhau. Các chất này có thể làm tăng, hoặc làm giảm hoạt tính enzyme. Tác
dụng của chúng có thể là đặc hiệu hoặc không đặc hiệu và thay đổi tùy từng chất,
từng enzyme khác nhau.
Chất kìm hãm (chất ức chế) là các chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽ
làm cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hóa bởi enzyme. Các
chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ kể cả protein, kìm hãm
thuận nghịch hoặc không thuận nghịch, cạnh tranh hay không cạnh tranh. Khi biết
được tác dụng ức chế của các chất này đối với từng loại enzyme trong từng phản
ứng cụ thể ta có thể điều chỉnh được phản ứng.
Chất hoạt hóa là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme. Các chất
này thường có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại
hoặc các chất hữu cơ. Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hồi hoạt tính của
enzyme một cách trực tiếp hay gián tiếp. Cơ chế của sự kích hoạt này có các chất
tác dụng trực tiếp với trung tâm hoạt tính của enzyme, làm thay đổi cấu hình không
gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt tính xúc tác hoặc cho gián tiếp thông qua
việc loại trừ các chất ức chế ra khỏi hỗn hợp phản ứng, nhưng không tác dụng trực
tiếp với phân tử enzyme.
1.1.5.4 Ảnh hưởng của pH môi trường :
pH môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng enzyme vì nó ảnh
hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và độ bền của protein –
enzyme. pH thích hợp của phần lớn enzyme là 7.
pH thích hợp của enzyme còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như đặc
tính và nồng độ cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ phản ứng…
1.1.5.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ :
Do bản chất hóa học của enzyme là protein nên khác với các phản ứng hóa
học, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một
giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme.
SVTH : Trần Tú Nhi 8 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng enzyme
cho thấy nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40 – 500C, trên 500C
hoạt tính thường bị giảm mạnh do làm hỏng cấu trúc phân tử enzyme. Các enzyme
có nguồn gốc thực vật và một số enzyme vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp cao hơn.
Nhiệt độ thích hợp của enzyme còn phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau như : thời
gian xác định hoạt tính, pH…
Ở nhiệt độ thấp dưới 00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều, nhưng có thể hồi
phục khi đưa về nhiệt độ bình thường.
Ở nhiệt độ 700C, phần lớn enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính, gọi là nhiệt độ
tới hạn. Ở nhiệt độ tới hạn, enzyme bị biến tính, hiếm khi được hồi phục hoạt tính
trở lại.
1.1.5.6 Ảnh hưởng của các ion kim loại :
Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa enzyme. Các ion kim loại
nặng ở nồng độ gây biến tính protein, có tác dụng kìm hãm không thuận nghịch
enzyme.
Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng, mức độ
hoạt hóa chỉ tăng theo nồng độ ion kim loại ở những nồng độ thấp trong một giới
hạn xác định, khi vượt quá nồng độ này lại có tác dụng kìm hãm enzyme. Giới hạn
nồng độ có tác dụng hoạt hóa enzyme của mỗi ion kim loại có thể khác nhau, vì vậy
ở cùng một nồng độ, cùng điều kiện phản ứng, đối với một enzyme, hai ion có thể
có tác dụng trái ngược nhau. Hiện tượng này thường xảy ra giữa các ion cùng hóa
trị.
1.2 ENZYME PROTEASE VÀ LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU :
1.2.1 Giới thiệu chung :
Protease là một nhóm các enzyme có khả năng xúc tác cho quá trình thủy
phân các liên kết peptide trong phân tử protein. Trong cơ thể cá còn sống các
protease là tác nhân xúc tác quá trình trao đổi chất phục vụ hoạt tính sống của cá.
Sau khi cá chết, khả năng xúc tác quá trình thủy phân của các enzyme này vẫn còn
SVTH : Trần Tú Nhi 9 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
và là nguyên nhân gây ra sự biến đổi thịt cá sau khi chết, khi tách ra khỏi cơ thể cá
thì protease vẫn giữ được khả năng xúc tác quá trình thủy phân. Do đó, cần nghiên
cứu các đặc tính của protease nội tạng nhằm sử dụng nguồn enzyme này từ phế liệu
cá trong công nghiệp chế biến thủy sản, tạo ra các sản phẩm có giá trị cao từ thịt cá.
1.2.2 Phân loại enzyme protease :
Theo Baret và Donald (1986) thì protease được chia thành hai nhóm lớn là
endopeptiase (proteinase) và exopeptidase.
Nhóm endopeptiase
Là các enzyme phân giải các liên kết ở giữa chuỗi mạch polypeptide. Theo
phân loại của Ủy ban enzyme thuộc Hội Hóa Sinh quốc tế, các enzyme nhóm này
gồm 4 phân nhóm là :
- Phân nhóm 1 : Proteinase – xerin : gồm các enzyme như tripsin,
chimotripsin.
- Phân nhóm 2 : proteinase – xistein hay proteinase – thiol : gồm các enzyme
cathepsin.
- Phân nhóm 3 : aspactic – protease hay protease acid : gồm các enzyme
pepsin, gastricsin…
- Phân nhóm 4 : metalo – proteinase như colagenase, calpain…
Nhóm exopeptidase :
Là các enzyme thủy phân liên kết peptide ở đầu mút của chuỗi mạch peptide.
Các enzyme thuộc nhóm này gồm cacboxyl – peptidase, amino – peptidase,
dipeptidase. Các exopeptidase không có khả năng thủy phân liên kết peptide ở trung
tâm mà chỉ tác dụng thủy phân liên kết ngoài cùng của chuỗi polypeptide, hoặc đầu
amin, hoặc đầu cacboxyl, tuần tự tách từng acid amin ra khỏi chuỗi polypeptide.
1.2.3 Protease nội tạng cá và các động vật thủy sản :
Hệ tiêu hóa của cá gồm nhiều bộ phận khác nhau. Mỗi bộ phận có chức năng
và các đặc điểm riêng của quá trình chuyển hóa, hấp thu thức ăn. Do đó, hệ enzyme
SVTH : Trần Tú Nhi 10 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
protease trong các bộ phận này cũng khác nhau. Tuy nhiên hoạt tính của enzyme
chủ yếu diễn ra ở dạ dày và ruột cá.
Enzyme dạ dày
Dạ dày của cá là cơ quan duy nhất có pepsin xúc tác cho quá trình thủy phân
protein trong môi trường acid mạnh. Trong dạ dày có cả hai loại enzyme chính là
pepsin và parapepsin.
Pepsin là enzyme chủ yếu tiêu hóa thức ăn có protein trong dạ dày, được sinh
tổng hợp trong các tế bào màng nhày của dạ dày và tiết ra dưới dạng không hoạt
tính gọi là pepsinogen. Pepsinogen có khối lượng phân tử 39.000 – 40.000 Da, bền
trong môi trường trung tính và acid yếu, nhưng dưới tác dụng của acid clohydric và
sự có mặt của một lượng nhỏ pepsin tự do trong dạ dày, sẽ chuyển hóa thành pepsin
dạng hoạt tính là một chuỗi polypeptide có khối lượng 32.700 Da. Pepsin có tác
dụng của một proteinase, transpeptidase và esterase nhưng chủ yếu có tác dụng của
endopeptidase và thủy phân chủ yếu các liên kết peptide sát gốc Lα – acid amin
thơm và dicacboxyl.
Enzyme đường ruột
Trong màng nhày ruột và trong dịch ruột, người ta xác định được có 22
enzyme tham gia vào quá trình tiêu hóa thức ăn. Trong đó các enzyme protease gồm
: enterokinase, amino – peptidase, amino – tripeptidase, dipeptidase,
cacboxylpeptidase.
Enterokinase
Là enzyme hoạt hóa đặc hiệu tripsinogen và chymotripsinogen. Enterokinase
được tổng hợp từ tế bào màng ruột, nhờ tác dụng của các muối mật mà xâm nhập
vào khe ruột và hoạt hóa tripsinogen trên bề mặt màng nhày của ruột cũng như ở
trong khoang ruột. Dưới tác dụng của enterokinase, phân tử tripsinogen bị cắt một
đoạn 6 acid amin tại vùng giữa lysin và isoleusin và do đó chuyển thành dạng hoạt
tính. Ngoài ra, tuyến tụy còn tiết ra một lượng enterokinase cân bằng với tripsin để
hoạt hóa chymotripsinogen thành chymotripsin.
SVTH : Trần Tú Nhi 11 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
Chymotripsin
Là enzyme thuộc nhóm proteinase – serin, khối lượng phân tử khoảng
25.000 Da gồm 3 chuỗi polypeptide gắn với nhau bằng hai cầu nối sulfua.
Chymotripsin xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết peptide trong đó có
nhóm – CO - của các acid amin thơm hoặc methionin. Nó cũng xúc tác cho phản
ứng thủy phân este của các acid amin này.
Tripsin và chymotripsin có khả năng cắt đứt các liên kết ở giữa mạch
polypeptide của phân tử protein, kết quả hoạt tính thủy phân protein của chúng tạo
thành các đoạn polypeptide. Các đoạn này khi vào khoang ruột sẽ được các protease
khác tiếp tục thủy phân tạo thành sản phẩm cuối cùng là các acid amin.
1.2.4 Lược sử nghiên cứu về protease :
Loài người sử dụng enzyme protease trong sản xuất và đời sống từ lâu đời
trước khi biết đến chúng. 5000 năm trước công nguyên, con người đã sử dụng renin
có trong dạ dày bê như chất đông tụ để sản xuất phomat. Các thổ dân Nam Mỹ cổ
đại đã sử dụng lá đu đủ để làm mềm thịt và phương pháp này đã được kế thừa, phát
triển thành kỹ thuật làm mềm thịt nhân tạo bằng papain và các enzyme protease
khác. Ở Việt Nam, từ lâu đời, ông cha ta đã chế biến nước mắm trên cơ sở quá trình
tự phân giải thịt cá nhờ hệ enzyme có sẵn trong nội tạng và cơ thịt cá, trong điều
kiện nồng độ muối cao.
Đến thế kỷ 18, Reomur mới phát hiện dịch dạ dày của loài chim ăn thịt có
khả năng tiêu hóa thịt. Năm 1836 Schwann nghiên cứu hoạt tính phân giải protease
của dịch vị trong dạ dày chó. Năm 1857, Corvisart tách được chế phẩm thô tripsin
từ dịch tụy. Năm 1862, Danilevxki tách được tripsin và amylaza từ tụy tạng. Từ
những năm 50 của thế kỷ 20, các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu, thu nhận và ứng
dụng enzyme protease từ vi sinh vật, đồng thời phát triển và hoàn thiện công nghệ
thu nhận protease từ các mô động vật và thực vật. Từ đó đến nay, hàng loạt các
protease từ vi sinh vật, từ động vật và thực vật đã được sản xuất và ứng dụng vào
mọi lĩnh vực sản xuất và đời sống. Đặc biệt, những năm cuối thế kỷ 20, đầu thế kỷ
SVTH : Trần Tú Nhi 12 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
21, công nghệ enzyme phát triển vô cùng nhanh chóng, các loại protease được sử
dụng trong hầu hết các lĩnh vực sản xuất, đời sống, y học và nghiên cứu khoa học.
Nếu như năm 1980, cả thế giới sản xuất và tiêu thụ khoảng 1300 tấn enzyme các
loại trong đó có protease chiếm 40,7% thì đến năm 1985, thị trường enzyme thế
giới đã có sản lượng được mua bán là 45000 tấn, trị giá gần 650 triệu USD và đến
năm 1990, doanh thu từ các enzyme công nghệ của thế giới đạt 1,5 tỷ USD, trong
đó thị phần enzyme protease là 48%. Như vậy có khoảng 5 năm, lượng enzyme
được sản xuất và tiêu thụ trên toàn thế giới tăng gấp đôi, trong đó lượng enzyme
protease chiếm khoảng 50%. Các cường quốc về sản xuất và tiêu thụ enzyme
protease công nghiệp là Mỹ, Pháp, Nhật, Đức, Ý, Thụy Điển, Hà Lan, Đan Mạch,
Trung Quốc… hầu hết thuộc các nước công nghiệp phát triển. Dự báo, trong thế kỷ
21, sản xuất và tiêu thụ enzyme của thế giới sẽ tăng với tốc độ hàng năm khoàng
20%.
Tuy protease được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau nhưng cho đến những
năm gần đây, các protease sử dụng trong công nghiệp chủ yếu có nguồn gốc từ vi
sinh vật, các protease có nguồn gốc từ thực vật và động vật có vị trí thứ yếu.
1.3 ỨNG DỤNG PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA CÁ TRONG CHẾ BIẾN
THỦY SẢN :
1.3.1 Giới thiệu chung :
So với các protease có nguồn gốc từ vi sinh vật, thực vật và động vật trên
cạn, protease của động vật thủy sinh nói chung, cá nói riêng ít được ở trong quy mô
công nghiệp. Những nguyên nhân của tình trạng trên có thể là:
Nguồn nguyên liệu thủy sản mang tính mùa vụ lại không tập trung, cố định
nên việc cung cấp nguồn thu enzyme không ổn định, khó tổ chức sản xuất
chế phẩm enzyme ở quy mô công nghiệp.
Trong cơ thể động vật thủy sản, cơ quan tập trung enzyme lớn và có hoạt
tính cao là nội tạng nên thường được sử dụng làm nguồn thu enzyme. Tuy
SVTH : Trần Tú Nhi 13 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
nhiên, nội tạng cá thường có mùi tanh hôi, không hấp dẫn đối với công nhân
sản xuất, lại rất khó bảo quản ở điều kiện tự nhiên.
Protease của động vật thủy sản là một hệ gồm rất nhiều loại protease khác
nhau. Để tách riêng và làm tinh sạch từng enzyme cần trải qua hàng chục
bước khác nhau với kỹ thuật phức tạp. Chính vì vậy, cho đến nay, trên thị
trường chưa có protease thương mại từ nguyên liệu thủy sản. Để phát triển
sản xuất chế phẩm enzyme từ thủy sản phải nghiên cứu, hoàn thiện công
nghệ và giảm giá thánh sản phẩm.
Từ những năm 50 của thế kỷ trước, ở nhiều nước đã phát triển công nghệ sản
xuất các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật. Hàng trăm loại chế phẩm protease từ các
chủng vi sinh vật khác nhau đã được sản xuất và mua bán trên thị trường sản lượng
các chế phẩm protease thương mại tăng nhanh, liên tục và tỷ trọng các protease từ
vi sinh vật trong tổng doanh số enzyme trên thị trường thế giới luôn ở mức cao nhất
với các protease từ các nguồn khác. Việc sản xuất các chế phẩm protease thương
mại từ vi sinh vật có những ưu điểm như :
- Có nhiều chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease, chu kỳ sinh
trưởng của vi sinh vật ngắn, có thể thu nhận enzyme hàng chục lần trong
năm, có thể chủ động về nguyên liệu.
- Có thể dễ dàng điều hòa, định hướng quá trình sinh tổng hợp enzyme cần
thiết trên cơ sở tác động vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật, chọn lọc hoặc
gây đột biến ở các chủng vi sinh vật.
- Hiệu suất sinh tổng hợp enzyme trong môi trường nuôi cấy tổng hợp cao hơn
việc thu nhận enzyme thuận lợi.
- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật dễ chế tạo, chi phí thấp, giá thành enzyme
hạ.
Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng các chủng vi sinh vật để sản xuất enzyme
công nghiệp gặp phải một số trở ngại. Các chủng vi sinh vật protease phải được
đánh giá, kiểm tra nghiêm ngặt về độc tính để bảo đảm an toàn, vệ sinh cho sản
phẩm. Việc phân tích, kiểm tra phải tiến hành thường xuyên, liên tục với độ chính
SVTH : Trần Tú Nhi 14 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
xác cao nên cần phải có các phòng thí nghiệm, phân tích chuyên dùng, trang bị
dụng cụ hiện đại, chi phí đầu tư lớn.
Trong khi đó, các enzyme protease có nguồn gốc từ động vật và thực vật
luôn được đánh giá an toàn, sau khi thu nhận có thể sử dụng ngay vào quá trình chế
biến mà không cần kiểm tra độc tính. Với sản lượng 100 triệu tấn cá biển và 30
triệu tấn cá nước ngọt hằng năm, cả thế giới có tới 6,5 – 9 triệu tấn nội tạng và nếu
đưa vào để thu nhận enzyme protease, nguồn lợi thu được là không nhỏ.
1.3.2 Nghiên cứu và ứng dụng protease trong chế biến thủy sản ở Việt Nam :
Đến nay trong phạm vi quốc gia, ngành thủy sản chưa có một cơ quan, đơn
vị chuyên nghiên cứu và ứng dụng enzyme trong chế biến thủy sản. Các Viện
nghiên cứu, các trường đào tạo cán bộ khoa học công nghệ chuyên ngành thủy sản
chưa có chương trình nghiên cứu và ứng dụng enzyme nói chung, enzyme thủy sản
nói riêng. Chính vì vậy, có thể nói ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu về enzyme của
cá và động vật thủy sinh cũng như các hướng ứng dụng chúng vào sản xuất và đời
sống, vào chế biến thủy sản hầu như chưa có gì. Những năm gần đây, một số nhà
khoa học và công nghệ đã bắt đầu quan tâm đến vấn đề này, nhưng mới chỉ là
những nỗ lực cá nhân, chưa được sự quan tâm của nhiều người, chưa được sự đầu
tư về tài, lực cho nghiên cứu nên kết quả mới là bước đầu và còn rất khiêm tốn. Các
tài liệu, số liệu về enzyme thủy sản và ứng dụng enzyme trong ngành thủy sản còn
nghèo nàn, thiếu hệ thống.
Tuy nhiên có một ngành chế biến có truyền thống lâu đời là chế biến nước
mắm. Các công trình nghiên cứu về nước mắm đều đi đến kết luận là nước mắm là
sản phẩm của quá trình thủy phân protein trong thịt cá dưới tác dụng của hệ enzyme
protease của bản thân nguyên liệu. Quá trình thủy phân thịt cá bằng enzyme thực
hiện trong điều kiện có muối ăn ở nồng độ cao, để ngăn hoạt tính của các vi khuẩn
gây thối rữa, tạo thành các chất đạm hòa tan, chủ yếu là acid amin và peptide ngắt
mạch. Do thủy phân thịt cá bằng hệ enzyme của bản thân nguyên liệu trong điều
kiện muối mặn nên quá trình chế biến nước mắm trong điều kiện tự nhiên có thời
SVTH : Trần Tú Nhi 15 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
gian dài, từ trên 10 tháng tới 1 - 2 năm. Trong quá trình lâu dài ấy, đồng thời với
quá trình thủy phân thịt cá còn có các quá trình lên men khác với sự tham gia của hệ
vi sinh vật yếm khí hình thành các hợp chất bay hơi, các acid hữu cơ… Làm cho
nước mắm có hương vị, màu, mùi đặc trưng, có giá trị dinh dưỡng và cảm quan đặc
biệt.
Bên cạnh ứng dụng protease trong chế biến nước mắm, các nhà khoa học
công nghệ nước ta cũng đã quan tâm mở rộng thêm nhiều lĩnh vực ứng dụng
protease trong chế biến thủy sản. Các lĩnh vực sử dụng protease trong chế biến thủy
sản chủ yếu tập trung vào lĩnh vực nâng cao hiệu quả sử dụng phế liệu thủy sản
cũng như nguồn cá tạp, cá kém giá trị kinh tế.
So với kết quả nghiên cứu về enzyme protease của thực vật, động vật máu
nóng và vi sinh vật có lịch sử phát triển hàng trăm năm thì việc nghiên cứu, ứng
dụng enzyme protease cá trong chế biến thủy sản mới chỉ tập trung vào việc tận
dụng enzyme protease có sẵn trong nguyên liệu. Các lĩnh vực nghiên cứu, ứng dụng
protease trong chế biến thủy sản còn hạn chế, chỉ mới dừng ở trong phòng thí
nghiệm, chưa chuyển giao công nghệ để sản xuất công nghiệp.
Yêu cầu sản xuất chế phẩm protease từ thủy sản để sử dụng trong chế biến
cũng như cung cấp cho ngành khác đang đặt ra trực tiếp và cấp bách. Các công trình
nghiên cứu về protease của cá và các lĩnh vực ứng dụng đang tăng lên nhanh chóng
ở nhiều nước có nghề cá phát triển. Tiềm năng phát triển sản xuất chế phẩm
protease từ thủy sản và ứng dụng để chế biến ra những sản phẩm mới rất là to lớn.
Trong thời đại bùng nổ thông tin, sự hội nhập và trao đổi thông tin đang rất khẩn
trương và thuận lợi, các nhà khoa học công nghệ nước ta cần nhanh chóng tiếp thu
các thành tựu mới trong lĩnh vực này để áp dụng vào sản xuất, góp phần phát triển
nhanh chóng công nghệ chế biến thủy sản ở đất nước.
SVTH : Trần Tú Nhi 16 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
1.3.3 Nguồn thu enzyme protease :
Enzyme nói chung và enzyme protease nói riêng được thu nhận chủ yếu từ
ba nguồn cơ bản : mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh
vật.
Enzyme được tách từ các mô như : tụy tạng, dạ dày, ruột … của một số động
vật thủy sản (mực , cá…) thường là trypsin, pepsin, chymotrypsin, cathepsin… Từ
thực vật có thể thu nhận được một số enzyme thủy phân như : papain từ nhựa đu đủ,
bromelin từ thân, lá và vỏ dứa. Ngoài ra còn có thể thu nhận được một số enzyme
khác như : amylase, urease, peroxydase…
1.3.4 Ứng dụng enzyme protease :
Enzyme nói chung và enzyme protease nói riêng có thể sử dụng theo hai
hướng sau :
Hướng 1 : Sử dụng trong quá trình thủy phân trong cơ thể. Các enzyme này
là các enzyme nội bào. Chúng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào
sống, nhưng khi sinh vật chết quá trình thủy phân protein vẫn diễn ra. Như vậy,
protease tham gia vào quá trình thủy phân protein của chính nguyên liệu chứa
nó. Việc sử dụng enzyme theo hướng này rất đơn giản, có thể làm tăng hương
vị, màu sắc của sản phẩm. Tuy vậy, chỉ có thể sử dụng enzyme loại này đối với
quy trình chế biến nguyên liệu chứa nó.
Hướng 2 : Tách enzyme ra khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm và sử dụng
chúng vào trong các quá trình sản xuất. Việc tách chiết enzyme dựa vào tính
chất của chúng : enzyme tan được trong nước, trong dung dịch muối sinh lý, các
dung dịch đệm. Dịch chiết thu được chứa enzyme, protein tạp, các chất hữu cơ
và vô cơ nên phải tiến hành tinh sạch để thu chế phẩm. Các chế phẩm enzyme
được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
a. Trong công nghiệp thực phẩm :
- Enzyme protease được sử dụng trong chế biến thịt, làm cải biến giá trị cảm
quan, làm tăng giá trị sản phẩm. Người ta sử dụng protease từ dứa, đu đủ, nội
SVTH : Trần Tú Nhi 17 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
tạng động vật để thủy phân làm mềm nguyên liệu, hoặc thủy phân nguyên
liệu tạo thành dịch dễ hấp thu, dễ tiêu hóa.
- Trong chế biến nước giải khát, trong công nghiệp bia, các chế phẩm protease
được sử dụng làm trong dịch quả, dịch bia.
- Dùng protease trong công nghiệp chế biến sữa, làm pho mát.
- Protease được dùng làm tăng giá trị sản phẩm về mặt thương mại của sản
phẩm có giá trị thấp. Ví dụ như dùng protease để thủy phân protein trong phế
liệu công nghiệp thực phẩm (xương, collagen…) thành các dạng hòa tan, thu
dịch đạm thủy phân làm thức ăn cho người hoặc thức ăn chăn nuôi.
- Dùng protease để thủy phân màng tế bào gan cá để trích ly dầu cá.
b. Trong công nghiệp dệt :
Dùng chế phẩm protease để sản xuất dung dịch hồ tơ làm tăng độ bóng,
không ảnh hưởng đến độ bền của tơ.
c. Trong công nghệ phim ảnh :
Protease được sử dụng để sản xuất gellatin trên bề mặt phim ảnh, dùng để tái
sinh ảnh, giấy ảnh và các phim chụp X – quang.
d. Trong công nghiệp da :
Sử dụng protease để tẩy sơ bộ da nguyên liệu, làm mềm da, tăng lượng lông
thu hồi (tỷ lệ thu hồi tăng 25 – 30 % so với khi dùng phương pháp hóa học),
và da có chất lượng cao.
e. Trong công nghệ sản xuất xà phòng, chất tẩy rửa, công nghiệp mỹ phẩm :
Protease được thêm vào để sản xuất xà phòng, kem đánh răng… có tác dụng
tẩy sạch các vết mủ, hay bổ sung protease vào kem bôi mặt để loại các lớp
biểu bì chết, làm mịn da.
f. Trong công nghiệp dược phẩm :
Dùng protease để bổ sung vào thuốc chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa, thuốc
tiêu mủ ở các vết thương, thuốc chữa nghẽn mạch máu để làm sạch vết
thương và giảm đau cho người bệnh.
SVTH : Trần Tú Nhi 18 MSSV : 107111115
- Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
g. Trong chế biến thủy sản :
Nước mắm được hình thành từ quá trình thủy phân protein trong thịt cá dưới
tác dụng của hệ enzyme protease có sẵn trong nguyên liệu trong điều kiện
muối mặn và thời gian dài. Người ta đã sử dụng chế phẩm protease để bổ
sung trong quá trình sản xuất nước mắm với lượng nhất định nhằm rút ngắn
thời gian chế biến. Nhờ vậy mà làm tăng hiệu quả kinh tế, tăng sự luân
chuyển vốn.
Ngoài ra, người ta còn sử dụng enzyme protease vào việc sản xuất bột đạm
cá, bột đạm hòa tan, … từ các loại cá có giá trị kinh tế thấp (như cá mối, cá
tạp…). Sở dĩ làm như vậy vì hướng sản xuất này có thể tận dụng được các
phế liệu trong quá trình chế biến, tiết kiệm nguyên liệu, tăng giá trị sản
phẩm, … đem lại hiệu quả kinh tế cao.
1.4 SƠ LƯỢC VỀ SẮC KÝ LỌC GEL :
1.4.1 Bản chất của phương pháp :
Phương pháp được sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lượng phân
tử và phân tích định lượng tương tác phân tử.
Hình 1.1. Tách các phân tử bằng lọc gel
SVTH : Trần Tú Nhi 19 MSSV : 107111115
nguon tai.lieu . vn
