1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự phát sinh mô sẹo cây Xạ đen (Celastrus hindsii)

Đồ án tốt nghiệp: Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự phát sinh mô sẹo cây Xạ đen (Celastrus hindsii)

Đồ án tốt nghiệp: Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự phát sinh mô sẹo cây Xạ đen (Celastrus hindsii) được thực hiện với mục tiêu nhằm tạo nguồn vật liệu cho các nghiên cứu nhân sinh khối cây Xạ đen và sau đó thu nhận các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ cây này để ứng dụng trong y học hiện đại. Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG LÊN SỰ PHÁT SINH MÔ SẸO CÂY XẠ ĐEN (Celastrus hindsii) Ngành: Công

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 56

Ngày tạo 10/11/2021 12:07:24 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 1.55 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự p... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG LÊN SỰ PHÁT SINH MÔ SẸO CÂY XẠ ĐEN (Celastrus hindsii) Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: ThS. Trần Trọng Tuấn Sinh viên thực hiện : Nguyễn Anh Phi MSSV: 1151110258 Lớp: 11DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG LÊN SỰ PHÁT SINH MÔ SẸO CÂY XẠ ĐEN (Celastrus hindsii) Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: ThS. Trần Trọng Tuấn Sinh viên thực hiện : Nguyễn Anh Phi MSSV: 1151110258 Lớp: 11DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào. Ký tên Nguyễn Anh Phi
  4. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành để tài này, chúng em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến: Thầy ThS Trần Trọng Tuấn và cô ThS Nguyễn Thị Huyền Trang, thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và động viên chúng em trong suốt thời gian qua. Ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực phẩm - Môi Trường, trường Đại Học Công Nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi, hỗ trỡ tận tình trong 4 năm học tại trường. Ban lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới Tp. HCM và các anh chị đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này. Chúng em xin cảm ơn các anh chị trong phòng Công nghệ Tế Bào Thực Vật Viện Sinh học Nhiệt đới đã giúp đỡ chúng em trong thời quan qua. Tập thể 11DSH02 đã luôn bên cạnh động viên. Con xin cảm ơn Bố Mẹ đã luôn ủng hộ, động viên và giúp đỡ con. Tp HCM, tháng 8, năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Anh Phi
  5. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................................ii MỤC LỤC ............................................................................................................................. i DANH MỤC BẢNG............................................................................................................ iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ ...................................................................................................... iv CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 2 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI CELASTRUS ................................................................ 2 1.1.1 Tổng quan về chi celastrus ............................................................................ 2 1.2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ CÂY XẠ ĐEN (CELASTRUS HINDSII).......... 3 1.2.1 Phân loại ......................................................................................................... 3 1.2.2 Đặc điểm thực vật .......................................................................................... 3 1.2.3 Phân bố, sinh thái........................................................................................... 4 1.2.4 Thành phần các hợp chất có trong cây ........................................................ 4 1.2.5 Công dụng dƣợc lý ......................................................................................... 4 1.2.6 Một số nghiên cứu của cây xạ đen trong và ngoài nƣớc............................. 6 1.3 NUÔI CẤY MÔ SẸO (CALLUS) ........................................................................ 8 1.3.1 Hình thái tế bào trong sự phát sinh mô sẹo từ các mảnh mô hay cơ quan song tử diệp khi nuôi cấy in vitro ................................................................................... 8 1.3.2 Vai trò của loại cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng trong sự tạo mô sẹo ..... 9 1.4 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG LÊN NUÔI CẤY TẠO MÔ SẸO ............. 9 1.4.1 Môi trƣờng ...................................................................................................... 9 1.4.2 Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật 10 1.4.3 Sơ lƣợc về chất điều hòa sinh trƣờng ......................................................... 12 1.5 HỆ THỐNG NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO ............................................. 15 1.5.1 Khái niệm...................................................................................................... 15 2 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .............................. 1 2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI ......................................... 1 2.2 VẬT LIỆU.............................................................................................................. 1 2.2.1 Nguồn mẫu...................................................................................................... 1 2.2.2 Môi trƣờng nuôi cấy ...................................................................................... 1 2.2.3 Dụng cụ thiết bị .............................................................................................. 1 2.2.4 Điều kiện nuôi cấy .......................................................................................... 1 2.2.5 Kệ đèn LED .................................................................................................... 2 i
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM ........................................................................................ 2 2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của một số môi trƣờng khoáng lên sự phát triển mô sẹo từ lớp mỏng đốt thân và lá cây Xạ đen ........................................ 2 2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của CĐHSTTV lên khả năng tăng sinh mô sẹo .................................................................................................................... 2 2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện ánh sáng lên khả năng tăng sinh mô sẹo .................................................................................................................... 3 2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng (rắn, bán rắn, lỏng, lỏng lắc) lên khả năng tăng mô sẹo ........................................................... 3 2.3.5 Cách thu các chỉ tiêu khảo sát ...................................................................... 4 2.3.6 Phƣơng pháp thu thập số liệu ....................................................................... 4 3.1. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng khoáng lên sự phát triển mô sẹo từ đốt non thân và mẫu lá của cây Xạ đen ................................................................................ 5 3.2. Ảnh hƣởng của 2,4-D lên khả năng tăng sinh mô sẹo ........................................ 8 3.3. Ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng lên khả năng tăng sinh mô sẹo ................... 12 3.4. Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng (rắn, bán rắn, lỏng, lỏng lắc) lên khả năng tăng sinh mô sẹo .................................................................................................... 15 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN ................................................................................................. 17 CHƢƠNG 5: KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 19 ii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-Dicholorophenoxy acetic acid BA : 6 - Benzyl adenin IAA : Indole -3- acetic acid IBA : Indole - 3 - butyric acid NAA : α - Naphthalene acetic acid MS : Murashige và skoog, 1962 1/2MS : Môi trường MS với thành phần khoáng đa lượng giảm còn ½ SH : Schenk và Hildebrandt TCL : Thin cell layer tTCL : Transverse TCL PGRs : Plant growth regulators ITCL : Longitudinal TCL ED50 : Effective dose LED : Light- Emitting diode CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật iii
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hưởng của một số môi trường khoáng lên sự phát triển mô sẹo từ đốt thân non cây Xạ đen. .................................................................................................. 5 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng tăng sinh mô sẹo cây Xạ đen ............ 9 Bảng 3.3Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên khả năng tăng sinh mô sẹo ............. 12 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên khả năng tăng sinh mô sẹo .... 15 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biều đồ 3.1 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên tỷ lệ sống mô sẹo ..................... 6 Biều đồ 3.2 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên trọng lượng tươi mô sẹo .......... 6 Biểu đồ 3.3Ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng tăng sinh trọng lượng tươi mô sẹo 11 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của 2,4-D lên tỷ lệ gia tăng trong lượng mô sẹo ................ 12 Biểu đồ3.5 Ảnh hưởng ánh sáng lên trọng lượng tươi mô sẹo ................................. 13 Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng ánh sáng lên tỷ lệ gia tăng trọng lượng tươi mô sẹo .......... 13 Biểu đồ 3.7Ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên khả năng tăng sinh trọng lượng tươi mô sẹo ..................................................................................................... 16 iv
  9. Đồ án tốt nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Nước Việt Nam ta được thiên nhiên ưu đãi với những cánh rừng nguyên sinh chạy dọc đất nước, theo thống kê có hơn 5000 loại cây thuốc trong đó có nhiều cây đặc hữu. Ngày nay, tuy thuốc tây đang lưu hành rộng rãi và dồi dào, nhưng sự ưa thích và sự tín nhiệm của nhân dân đối với cây thuốc không hề giảm sút. Trên các phương tiện thông tin đại chúng hiện nay đã đề cập tới nhiều loại thảo dược có nguồn gốc từ thiên nhiên như Sâm ngọc linh, Xáo tam phân, Bá bệnh và trong đó có cây Xạ đen… được dùng làm dược liệu trong điều trị và chữa bệnh. Từ những kinh nghiệm sử dụng phong phú, các vị lương y đã đúc kết được nhiều bài thuốc tâm đắc trong việc trị bệnh cứu người. Các loại thảo mộc có công dụng chữa trị được nhiều loại bệnh nan y. Chính vì vậy, con người ngày nay đang có xu hướng tìm và khai thác các loại thảo mộc ngoài tự nhiên, hơn nữa tình trạng môi trường ngày nay đang bị ô nhiễm nặng nề đã đe dọa lên tình trạng sống và phát triển của các loài thảo mộc ngoài tự nhiên. Các phương pháp nhân giống truyền thống không đáp ứng được nguồn cung cấp dược liệu từ thiên nhiên cho con người sử dụng và duy trì được mức độ ổn định về số lượng chủng loại. Chính vì vậy, việc nghiên cứu nhân giống cũng như phát triển nguồn sinh khối các loại thảo dược có hoạt chất thứ cấp trong điều kiện in vitro đang được các nhà khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam tìm hiểu và thực hiện với mục đích cung cấp được các loại hoạt chất thứ cấp có tác dụng dược lý cho con người mà vẫn đảm bảo được sự đang dạng về chủng loại của các loại thảo dược ngoài tự nhiên. Chính vì các lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự phát sinh hình thái mô sẹo của cây Xạ đen (Celastrus hindsii)” nhằm tạo nguồn vật liệu cho các nghiên cứu nhân sinh khối cây Xạ đen và sau đó thu nhận các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ cây này để ứng dụng trong y học hiện đại. 1
  10. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI CELASTRUS 1.1.1 Tổng quan về chi celastrus Chi Celastrus bao gồm có 50 loài được phân bố khắp nơi trên thế giới, đặc biệt nhiều nhất ở Châu Á (Su và cộng sự, 2009). Các loài thuộc chi Celastrus đã được sử dụng như là một loại thuốc diệt côn trùng tự nhiên, cũng như những bài thuốc dân gian quan trọng để chữa trị các bệnh như sốt, nhiễm khuẩn, viêm đa khớp dạng thấp,… Ví dụ như, C. hypoleucus được dùng để chữa trị bệnh viêm và sưng tấy (Bruning và cộng sự, 1978). C. orbiculatushas được dùng để chữa trị bệnh viêm đa khớp dạng thấp và những nghiên cứu trước đó về thành phần hóa học đã cho thấy sự hiện diện của nhiều loại ester β-dihydroagarofuran sesquiterpene polyol và alkaloids (Bruning và cộng sự, 1978). Một số loài thì kích thích việc kháng sâu và kháng khối u. Gần đây, chất β-dihydroagarofuran đã được nghiên cứu có tác dụng chống lại sự hình thành khối u (Takaishi và cộng sự, 1993). Các hợp chất tự nhiên và những nghiên cứu về sinh học ở chi Celastrus: Nhóm sesquiterpennes (β-Agarofurans). Họ Celastraceae được biết đến như là việc sản xuất các dẫn xuất khác nhau của β-dihydroagarofuran. Trong bài báo cáo của Su và cộng sự (2009) đã cho thấy có khoảng 97 chất của dạng dẫn xuất này được tìm thấy kể từ thập niên 1980. Các loài được nghiên cứu bao gồm C. angulatus, C. orbiculatus, C. paniculatus, C. stephanotiifolius, C. flagellaris, C. gemmatus, C. hindsii, C. rosthornianus,... Nhóm diterpenes: năm 1999, Chen và Liang đã chiết suất thành công ba loại diterpenes, 98-100, từ thân của cây C. stephaotifolius. Celaphanol A cũng đã được tìm thấy từ cây C. orbiculatus. Xiong và cộng sự đã báo cáo rằng việc chiết suất và tổng hợp(+)-7-deoxynimbidiol vào năm 2006. Trong cùng năm này, Wang và cộng sự đã chiết suất thành công ba loại diterpenes là celahypodiol, furreginol và suigol từ cây C. hypoleucus. 2
  11. Đồ án tốt nghiệp Nhóm triterpenes: Các chất thuộc nhóm này cũng đã lần lượt tìm thấy ở các loài C. angulatus, C. paniculatus, C. hypoleucus và C. hindsii. Nhóm alkaloids: Từ quả của cây C. orbiculatus chất 3-Oxo-4-benzyl-3,4- dihydro-1H-pyrrolo[2,1-c]-oxazine-6-carbaldehyde đã được tìm thấy. Ngoài ra nhiều chất thuộc nhóm alkaloid cũng đã được tìm thấy trong chi Celastrus. Nhóm flavonoids: Năm 2006, tám hợp chất phenol đã được tìm thấy ở loài Celastrus Hindsii, bao gồm 5 hợp chất và ba oligomer mới của rosmarinic acid, một dimer và hai trimers. Thành phần chính trong dịch chiết là rosmarinic acid và lithospermic acid B. Những hợp chất này có thể kìm hãm sự oxi hóa của nhóm methyl linoleate ở phần lớn các giai đoạn ức chế phản ứng peroxidation ở cây đậu tương, phosphatidylcholine ở liposomes. Vì thế, dịch chiết từ cây C. hindsii được mong đợi có thể trở thành nguồn dược liệu tự nhiên để kháng oxi hóa (Ly và cộng sự, 2006). 1.2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ CÂY XẠ ĐEN (CELASTRUS HINDSII) 1.2.1 Phân loại Cây Xạ đen có tên khoa học là Celastrus hindsii thuộc: - Giới : Viridiplante - Ngành : Streptophyta - Lớp : Embryophyta - Bộ : Celastrales - Họ : Celastraceae - Chi : Celastrus - Loài : Celastrus hindsiii (www.ncbi.nlm.nih.gov) 1.2.2 Đặc điểm thực vật Cây Xạ đen còn được gọi là cây cùm cụm răng, dây gối Ấn Độ hoặc dây gối bắc, quả nâu, dân tộc Mường gọi là cây ung thư. 3
  12. Đồ án tốt nghiệp Thân cây dạng dây dài 3 - 10 m. Bụi leo, nhánh non tròn, không lông. Lá không rụng theo mùa, phiến lá hình bầu dục, xoan ngược, diện tích lá từ 6 - 11 x 2 - 5 cm, dài, gân phụ 7 cặp, bìa có răng thấp. Cuống lá dài 5 - 7 mm. Chùm hoa ở ngọn hay ở nách lá, dài 5 - 10 cm, cuống hoa dài 2 - 4 mm. Hoa mẫu 5, cánh hoa trắng, hoa cái có tiểu nhụy lép, noãn sào có 3 buồng. Quả nang hình trứng, dài khoảng 1 cm, nổ thành 3 mảnh. Hạt có áo hạt màu.Ra hoa từ tháng 3 - 5, ra quả tháng 8 - 12. Cánh tròn, lúc non có màu xám nhạt, sau chuyển sang màu nâu, có lông, về sau màu xanh. 1.2.3 Phân bố, sinh thái Cây Xạ đen được phân bố ở nhiều nước như:Trung Quốc, Ấn độ, Thái Lan, Myanmar và một số quốc gia khác. Ở nước ta cây Xạ đen phân bố chủ yếu ở các tỉnh Hà Nam, Quảng Ninh, Ninh Bình, Hòa Bình, rừng quốc gia Cúc Phương, rừng quốc gia Ba Vì mọc tự nhiên trong rừng và rất dễ trồng. 1.2.4 Thành phần các hợp chất có trong cây Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện trong cây Xạ đen có sesquiterpenes (Huang và cộng sự, 2000; Kuo và cộng sự, 1996), triterpenes (Huang và cộng sự 2000; Kuo và Yang-kup, 1997), alkaloids (Huang và cộng sự, 2000, 2006; Kuo và cộng sự,1995), flavonoids (Ly và cộng sự, 2006), các polyphenol, tannin, acid amin, đường khử, cyanoglycosid. Trong đó hai hợp chất chính có trong dịch chiết lá Xạ đen là rosmarinic acid và lithospermic acid B (Ly và cộng sự, 2006). 1.2.5 Công dụng dƣợc lý Theo Đông y Cây Xạ đen có vị đắng chát, tính hàn, có tác dụng hữu hiệu trong điều trị mụn nhọt, ung thũng, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch trong xơ gan cổ chướng và đặc biệt trong chữa trị ung thư. Có tác dụng thông kinh lợi tiểu. Cây dùng trị kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm gan, bệnh lậu. 4
  13. Đồ án tốt nghiệp Điều trị, ức chế và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư, tiêu hạch, tiêu độc, thanh nhiệt, mát gan, hành thủy, điều hòa hoạt huyết, giảm đau, an thần, tăng cường sức đề kháng cơ thể. Vài chục năm trước, cây Xạ đen, tiếng Mường gọi là Xạ cái, từng được lương y dân tọc Mường Bùi Thị Bẻn, đặt tên là cây ung thư, chuyên dùng để chữa các loại ung thối. Bài thuốc cây Xạ đen, sau đó được bà Bẻn tặng cho Hội Đông y tỉnh Hòa Bình, nhưng vẫn ít người biết đến (www.laocai.gov.vn). Theo Tây y Các nghiên cứu trong và ngoài nước đã chứng minh hoạt tính sinh học của Xạ đen. Kết quả thử hoạt tính in vitro cho thấy dịch chiết cồn của vỏ cây Xạ đen có hoạt tính kháng tế bào ung thư, giảm thiểu quá trình oxy hóa của cơ thể, tăng cường hệ miễn dịch và phòng chống HIV-AIDS. Các nghiên cứu về thực vật học, hóa được, dược lý, nghiên cứu thực nghiệm trên động vât được gây ung thư của GS.TS. Lê Thế Trung và các bác sĩ của Học viện Quân Y đã phát hiện ở Xạ đen này tác dụng hạn chế sự phát triển của khối u ác tính. Hơn nữa, theo GS.TS. Lê Thế Trung, các hợp chất lấy từ Xạ đen nếu được kết hợp với chất phylamin có thể kéo dài tuổi thọ trung bình của động vật bị ung thư hơn nhiều chất lấy từ trinh nữa hoàng cung hay tỏi Thái Lan (www.laocai.gov.vn). Dịch chiết cồn của vỏ cây Xạ đen chứa bốn hợp chất triterpen gồn celasdin A, celasdin C, anti-AIDS celasdin B và cytotoxic maytenfolone A đã được các nhà khoa học Đài Loan chứng minh, qua kết quả thử hoạt tính in vitro, có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (Hepatocellular carcinoma, HEP-G2), ung thư mũi (Nasopharynx carcinoma), ung thư ruột kết (Colon carcinnoma, COLO-205). Đặc biệt trong đó, anti-AIDS celasdin B có khả năng kháng hoạt động tái bản của virus HIV trong các tế bào lympho H9 (Kuo và Yang Kuo, 1997). Đây là phát hiện quan trọng mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc điều trị căn bệnh thế kỷ HIV - AIDS. Ngoài ra dịch chiết lá Xạ đen khô còn được chứng minh có chứa các chất chống oxy hóa, trong đó thành phần chính của các chất chống oy hóa này là rosmarinic acid cùng các oligomer của nó và lithospermic acid B. Các hợp chất 5
  14. Đồ án tốt nghiệp thuộc nhóm phenolic này được chứng minh là có hoạt động chống oxy hóa chống lại quá oxy hóa tự nhiên của methyl linoleate trong pha chính và các gốc khởi động quá trình peroxy hóa phosphatidylcholine của đậu tương trong liposome (Ly và cộng sự, 2006). Sự thần kỳ của cây Xạ đen chính là làm hạn chế sự phát triển của các khối u trong cơ thể người bệnh. Tuy nhiên, các nhà khoa học đã luôn cảnh báo cho các người bệnh ung thư rằng, Xạ đen được xem như là một thực phẩm chức năng, chỉ có tác dụng hỗ trợ trong điều trị ung thư, hoàn toàn không phải là thuốc chữa khỏi căn bệnh này. Tất cả các báo cáo khoa học đều khẳng định, cây Xạ đen chỉ có tác dụng làm tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể, ức chế tiến triển của tế bào ung thư, không phải thuốc có thể chữa căn bệnh này. 1.2.6 Một số nghiên cứu của cây xạ đen trong và ngoài nƣớc Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Xạ đen được công bố, tuy nhiên các nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào nghiên cứu cấu trúc phân tử của các hợp chất tách chiệt được từ cây Xạ đen và tác dụng dược lý của dịch chiết Xạ đen. Tình hình nghiên cứu về cây Xạ đen trên thế giới Năm 1996, Kuo và Yang Kuo công bố nghiên cứu về khả năng kháng ung thư và kháng virus HIV của dịch chiết lá Xạ đen. Kết quả từ dịch chiết lá Xạ đen đã phân lập được bốn chất trong đó có maytenfolone-A đã được chứng minh có tác dụng gây độc với tế bào ung thư gan (HEPA-2B) với liều lượng ảnh hưởng ED50= 2,3 µg ml-1 và ung thư mũi (KB) với liệu lượng gây ảnh hưởng ED50 = 3,8 µg ml-1. Celasdin B có khả năng kháng hoạt động tái bản của virus HIV trong các tế bào lumpho H9 với nồng độ gây ảnh hưởng EC50 là 0,8 µg ml-1. Năm 2006, Ly và cộng sự đã công bố phát hiện mới về khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá Xạ đen. Các hợp chất chống oxy hóa được phân lập từ dịch chiết xuất methanol 50% của lá Xạ đen khô chứa tám hợp chất phenolic gồm rutin, kaempferol 3-rutinoside, rosmarinic acid, lithospermic acid, và lithospermic acid, và 6
  15. Đồ án tốt nghiệp lithospermic acid B, và ba oligomer mới lạ của rosmarinic acid, một dimer và hai trimer, các chất này có khả năng kháng quá trình oxy hóa các gốc tự do rất mạnh. Năm 2013, nghiên cứu của Hua và các cộng sự đã xác định được hai chất mới gồm một macrocyclic lactone (được đặt tên là Hindsii lactone A) và 5,8- quinoflavan (được đặt tên là Hindsii quinoflavan B). Hai chất này được kiểm tra khả năng gây độc đối với tế bào ung thư ở người gồm : Ung thư phổi (NCI-H187), ung thu ruột kết (HCT116), ung thư vú (BC-1) và ung thư gan (HuH7). Kết quả cho thấy Hindsii lactone A biểu hiện hoạt tính độc đối với các dòng tế bào của NCI- H187 và HCT116 với các giá trị IC50 là 14,9 - 36,8 µg ml-1 trong khi đó Hindsii quinoflavan B biểu hiện hoạt tính độc đối với các dòng tế bào của BC-1 và HuH7 với giá trị IC50 là 19,8 và 21,2 µg ml-1. Tình hình nghiên cứu về cây Xạ đen ở Việt Nam Ở nước ta, Lê Thế Trung (Chủ tịch Hôi Ung thư TP.Hà Nội) và các bác sĩ của Học viện Quân y là những người tiên phong trong nghiên cứu, tìm hiểu về cây Xạ đen, kể từ khi phát hiện loài cây này năm 1987. Sau 12 năm nghiên cứu, Học viện Quân y đã chiết xuất được từ loài cây này một loại tinh thể có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Năm 1999, đề tài của các bác sĩ Học viện Quân y được nghiệm thu, cây Xạ đen chính thực được công nhận là một trong không nhiều những vị thuốc nam có tác dụng điều trị hỗ trợ bệnh nhân ung thư. Năm 2007, Lê Thị Huyền và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính độc tế bào của Xạ đen trong việc kháng tế bào ung thư phổi và ung thư gan ở người. Kết quả cho thấy 3 chất được phân lập từ Xạ đen gồm: 5α-olean-12-en-3β-ol (β -Amyrin); β-Amyrin-3-O-succinate; 6-methoxy-2,2-dimethyl-5-nitrogen-2H-chromen-7-ol đều có tác dụng với dòng tế bào ung thư phổi ở mức vừa phải. 7
  16. Đồ án tốt nghiệp 1.3 NUÔI CẤY MÔ SẸO (CALLUS) Để nuôi cấy mô sẹo, người ta sử dụng hầu hết các cơ quan đang còn sống của thực vật như là thân, lá, cuống… Tuy nhiên, người ta thường sử dụng các mẫu cấy còn non để quá trình cảm ứng của mẫu với chất kích thích sinh trưởng diễn ra dễ dàng. Trong hầu hết trường hợp, người ta sử dụng chất kích thích sinh trường là 2,4- D với nồng độ thay đổi tử 0,1 - 3,0 ppm. Mô sẹo được hình thành là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt và có hình dáng không nhất định với màu vàng, trắng và hơi xanh. Các tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan này, trừ các tế bào của mô phân sinh, phải chịu một sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên. Sự phản phân hóa có vai trò rất quan trọng, nó cho phép một tế bào đã trưởng thành trở lại trạng thái trẻ hóa. Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phôi soma trong điều kiện thích hơp (Pierik, 1987). Mô sẹo được tạo ra ngoài nguyên nhân do các tế bào nhu mô chịu sự phân hóa còn do sự phân chia các tế bào tượng tầng, sự xáo trộn trong các mô phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Hunault, 1979). 1.3.1 Hình thái tế bào trong sự phát sinh mô sẹo từ các mảnh mô hay cơ quan song tử diệp khi nuôi cấy in vitro Ở thân, auxin kích thích hoạt động của tượng tầng và có thể cảm ứng sự phản phân hóa của các tế bào nhu mô vỏ trong, libe 1 và libe 2, các tia tủy và tủy tạo nên những vùng mô phân sinh rộng lớn. Các tế bào vỏ ngoài và các tế bào biểu bì thường chỉ phù ra mà không phân chia. Sự biến đổi của các mô phân sinh mới có tính hỗn loạn, không bình thường về cấu trúc giải phẫu và về những mối quan hệ giữa các cơ quan. 8
  17. Đồ án tốt nghiệp 1.3.2 Vai trò của loại cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng trong sự tạo mô sẹo Các mô và các cơ quan của thực vật đều có khả năng tạo mô sẹo. Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen. Sự tăng sinh của mô sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong môi trường nuôi cấy. Tuổi của những mảnh mô hay cơ quan có ảnh hưởng rất lớn trong khả năng tạo mô sẹo. Những mảnh cơ quan đã trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo. Ngược lại, cây non (còn nguyên vẹn hay cắt đoạn) hay những mảnh thân còn rất non của cây trưởng thành có thể tạo mô sẹo trên môi trường có chất điều hòa sinh trưởng. Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần hay không cần trong suốt thời gian tạo mô sẹo (Pierik, 1987). Đa số trường hợp, sự tạo mô sẹo trong tối tốt hơn ngoài sáng đặc biệt với mẫu cấy lá. 1.4 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG LÊN NUÔI CẤY TẠO MÔ SẸO 1.4.1 Môi trƣờng 1.4.1.1 Nguồn đạm Nguồn đạm từ các muối nitrate thường được tế bào dễ hấp thụ nhiều nhất. Đôi khi người ta sử dụng nguồn đạm từ muối nitrate và amomonium. Cũng có nhiều trường hợp sử dụng nguồn đạm hữu cơ. Nhưng về cơ bản những nguồn đạm từ muối vô cơ hòa tan thích hợp cho nuôi cấy tế bào đơn. 1.4.1.2 Nguồn carbohydrate Người ta thường sử dụng sucrose như nguồn carbon trong nuôi cấy tế bào đơn thực vật. Điều này còn phụ thuộc vào từng loại cây dùng để thu nhận tế bào. Đối với một số loài thực vật, tế bào lại cần maltose, galactose hay glucose hơn. 9
  18. Đồ án tốt nghiệp 1.4.1.3 Các chất vi lƣợng và các chất khác Tùy theo loài thực vật mà nhu cầu về các nguyên tố vi lượng, vitamin và các chất khác có khác nhau. Do đó, khi nuôi cấy phải chú ý đến nhu cầu sinh lý của tế bào để tạo ra môi trường nuôi cấy thích hợp (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). 1.4.2 Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật Năng lượng bức xạ có ảnh hưởng quan trọng lên hình dạng và hoạt động của thực vật bao gồm sự phát triển khả năng quang hợp, tham gia vào nhịp nội sinh và định hướng về không gian và thời gian. Vai trò khác nhau của ánh sáng lên sinh trưởng và phát triển của thực vật như: định hướng theo thời gian đối với nhiều hoạt động trao đổi chất, phân chia tế bào và phát triển, mở khí khổng, di chuyển về đêm; quang kỳ ảnh hưởng đến sự nở hoa, cảm ứng ngủ, sự rụng lá, sự tạo ống tràng, hoa, thân hành, củ và thân bò, ánh sáng định hình sạng như tạo màu xanh trong sự tổng hợp sắc đỏ và phát triển lục lạp, định hình dạng mở lá mầm, sự phát triển cuống, sự mở rộng lá, dạng nhánh và sự phát triển rễ. Quá trính phát sinh hình thái ở thực vật được điều hòa ít nhất 4 loại thụ quan ánh sáng (photoreceptor) - Các phytochrome nhạy cảm với ánh sáng đỏ và đỏ xa - Các thụ quan nhận ánh sáng xanh - Các thụ quan hấp thụ ánh sáng cực tím - A - Các thụ quan hấp thụ tia cực tím - B Phytochrome kiểm soát sự nảy mầm hạt, sự tăng trưởng lá và thân, sự phát triển thể hạt và sự nở hoa ở thực vật bậc cao. Đó là một protein xanh, một phân tử thưởng ở thực vật bậc cao, hấp thụ ánh sáng đỏ (660 nm) và đỏ xa (730 nm). 1.4.2.1 Vai trò của đèn LED đối với sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật LED: là từ viết tắt của cụm từ Light Emitting Diode, tạm dịch là Diode phát sáng. Lá các diode có khả năng phát sinh ra ánh sáng hay tia hồng ngoại, tử ngoại. 10
  19. Đồ án tốt nghiệp Cũng giống như diode, LED có cấu tạo từ một bán dẫn loại P ghép với một bán dẫn loại N. Tương tự như bóng đèn tròn dụng sợi đốt nhưng không phải chiếu sáng bằng sợi đốt, đèn LED được coi là loại đèn tiết kiệm điện năng nhất, tạo ra hiệu suất ánh sáng tốt nhất, tỏa nhiệt ít hơn so với các thiết bị chiếu sáng thông thường (Wikipedia, 2011). Ưu điểm của đèn LED: có nhiều kích thước, hình dạng, máu khác nhau; giá hành phải chăng, tiết kiệm được chi phí. Được chế tạo từ vật liệu polymer. Đèn LED có độ bền cao, dễ vận chuyển mà không bị vỡ. Đèn LED cho nhiều ánh sáng, có tuổi thọ tới 70 nghìn giờ sử dụng, (nếu một ngày thắp sáng 8 giờ thì sau 23 năm mới phải thay bóng), tiết kiệm 70 - 80 % so với đèn thông thường. Đèn LED nhiệt năng phát sinh ra trong quá trình hoạt động không đáng kể. Đèn LED hoạt động tốt trong điều kiện nhiệt độ thấp, sử dụng dòng điện một chiếu với hiệu điện thế nhỏ và thân thiện với môi trường giảm lượng khí thải CO2 vì không sinh ra tia cực tím, không có thủy ngân, tối thiểu hóa lượng khí thải ra môi trường do đèn LED có tuổi thọ cao trung bình gấp 10 - 20 lần các loại bóng đèn chiếu sáng thông thường. Nhìn chung đèn LED an toàn cho người sử dụng, giảm nguy cơ cháy nổ, nâng cao hiệu suất làm việc của điều hòa không khí do đèn LED phát ra nhiệt thấp trong quá trình làm việc, chất lượng ánh sáng thân thiện, tối thiểu hóa tia cực tím và bức xạ hồng ngoại, không nhấp nháy, không gấy nhức mỏi mắt. Hệ thống đèn LED có một số thuận lợi trong nuôi cấy mô: Đỉnh của đường biểu diễn ánh sáng LED đỏ và LED xanh kết hợp với nhau là ngưỡng phù hợp cho sự quang hợp của chlorophyll và được báo cáo có những bước sóng ảnh hưởng lên sự quang hợp cực đại. LED có tuổi thọ cao và có thể thay đổi được nguồn sáng, vì vậy nó sẽ giảm được giá thành trong các phòng thí nghiệm. LED phát nhiệt ít, do vậy chỉ cần một lượng điện năng nhỏ để làm mát phòng nuôi cấy. Năng lượng được sử dụng cho LED thấp nên có thể làm giảm giá thành trong sản xuất thương mại. Một cấu trúc đặc của hệ thống đèn LED cũng là một đặc tính hấp dẫn (Dương Tấn Nhựt, 2011). 11
  20. Đồ án tốt nghiệp 1.4.3 Sơ lƣợc về chất điều hòa sinh trƣờng 1.4.3.1 Chất kích thích sinh trƣởng Chất điều hòa sinh trưởng là một trong những phức hợp hữu cơ với một lượng nhỏ và hiệu chỉnh đặc biệt phân tử của nó có thể thúc đẩy, ức chế hay làm thay đổi sự phát triển của cây trồng. Người ta phân chia ba nhóm chất điều hòa sinh trưởng chính: Auxin, cytokinin và giberelin. CĐHSTTV có vai trò rất quan trọng trong việc đảm bảo mối quan hệ hài hòa giữa các cơ, bộ phân trong cơ thể để điều chỉnh các quá trình sinh trưởng, phát triển và các hoạt động sinh lý của thực vật. 1.4.3.2 Cytokinin Các cytokinin là những CĐHSTTV liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô. Các cytokinin thường được sử dụng là BA, kinetin, zeatin. Trong đó, zeatin là cytokinin tự nhiên còn BA và kinetin là cytokinin tổng hợp. Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi để tạo callus và tạo rễ, cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự phát sinh chồi và chồi nách. Vấn đề không kém quan trọng là nồng độ của hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng này. Chẳng hạn, 2,4-D cùng với BA ở nồng độ 5 ppm sẽ kích thích sự tạo thành callus ở Agrostic nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi mặc dù trong cả hai trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin đều bằng một. Trong sự tăng trưởng tế bào, cytokinin kích thích sự phân hóa tế bào, giúp gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein, kích thích sự gia tăng kích thước tế bào lá trưởng thành. Trong sự tạo cơ quan cytokinin giúp tạo chồi. Sự phối hợp giữa auxin và cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái ở mẫu nuôi cấy in vitro. Khi phối hợp hai loại CĐHSTTV lại với nhau thì sự phân chia tế bào xảy ra nhanh hơn. 12
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược