1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm Purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu

Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm Purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào, xâm nhập con cái và khối trứng Meloidogyne spp. của các chủng nấm Purpureocillium lilacium (P. lilacinum) phân lập được từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu. Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME NGOẠI BÀO VÀ KÝ SINH TUYẾN TRÙNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM Purpureocillium lilacinum PHÂN LẬP TỪ ĐẤT RỪNG

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 92

Ngày tạo 10/11/2021 12:10:40 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 1.45 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát và so sánh khả năng tiế... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME NGOẠI BÀO VÀ KÝ SINH TUYẾN TRÙNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM Purpureocillium lilacinum PHÂN LẬP TỪ ĐẤT RỪNG VÀ ĐẤT CANH TÁC Ở VŨNG TÀU Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS Lê Thị Mai Châm Sinh viên thực hiện : Trần Thị Ngọc Hạnh MSSV: 1151110125 Lớp: 11DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố HCM nói chung và các anh chị công tác tại phòng Vi sinh nói riêng, đã tạo điều kiện cho em tham gia làm đồ án tốt nghiệp tại đây. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Lê Thị Mai Châm, chị Nguyễn Thị Thùy Dương đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp của em tại Trung tâm. Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại Học Công Nghệ Tp.HCM và quý thầy cô đã tận tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức cần thiết, bổ ích để chúng em có thể hoàn thành tốt quá trình học tập của mình. Cuối cùng em xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn đồng hành và ủng hộ em trong suốt quá trình này. XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN TP.HCM, ngày 20 tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện Trần Thị Ngọc Hạnh
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của cá nhân. Các kết quả và số liệu trong đồ án là trung thực. Ngƣời cam đoan Trần Thị Ngọc Hạnh
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................3 1.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp. ..........................................................................3 1.1.1 Phân loại ......................................................................................................3 1.1.2 Vòng đời ......................................................................................................3 1.1.3 Cấu tạo trứng của tuyến trùng .....................................................................4 1.1.4 Cấu tạo thành cơ thể con cái của tuyến trùng .............................................5 1.2 Nấm Purpureocillium lilacinum ........................................................................5 1.2.1 Phân loại ......................................................................................................5 1.2.2 Điều kiện sống .............................................................................................6 1.2.3 Đặc điểm hình thái ......................................................................................7 1.2.4 Đặc điểm dinh dưỡng ..................................................................................8 1.2.5 Khả năng tiết enzyme ngoại bào .................................................................8 1.2.6 Độc tố của P. lilacinum .............................................................................10 1.2.7 Quá trình kí sinh ........................................................................................11 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...12 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................12 2.2 Thiết bị, hóa chất, vật liệu nghiên cứu.............................................................12 2.2.1 Dụng cụ, thiết bị ........................................................................................12 2.2.2 Vật liệu, đối tượng nghiên cứu ..................................................................12 2.2.3 Hóa chất .....................................................................................................14 2.3 Nội dung nghiên cứu........................................................................................16 2.4 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................16 2.4.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào protease, chitinase của nấm P. lilacinum ........................................................................................................16 2.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng xâm nhập trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của nấm P. lilacinum ............................................................18 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu .........................................................................19 i
  5. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................20 3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum ......20 3.1.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease ......................................20 3.1.2 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào chitinase của các chủng nấm P. lilacinum .............................................................................................................26 3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum ...............................................30 3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum .................................................................31 3.2.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên tuyến trùng cái Meloidogyne spp. ............................................................................................................................36 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................39 4.1 Kết luận ............................................................................................................39 4.2 Đề nghị .............................................................................................................39 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................40 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các chủng nấm P. lilacinum được phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ...................................................................................................................12 Bảng 3.1 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất rừng ở Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau ............................................................20 Bảng 3.2 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất canh tác ở Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau ............................................................22 Bảng 3.3 Mức độ tiết enzyme protease của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau ......................25 Bảng 3.4 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất rừng ở Vũng Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau .................................................................26 Bảng 3.5 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất canh tác ở Vũng Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau .................................................................27 Bảng 3.6 Mức độ tiết enzyme chitinase của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau ......................30 Bảng 3.7 Tỷ lệ ký sinh trên khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu .........................32 Bảng 3.8 Mức độ ký sinh khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau ...........................................................................................................35 Bảng 3.9 Tỷ lệ ký sinh trên con cái Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu .....................................36 Bảng 3.10 Mức độ ký sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau...................................................................................................................38 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Vòng phân giải casein trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian. ......................................24 Biểu đồ 3.2 Vòng phân giải chitin trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian. ......................................29 Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ ký sinh khối trứng trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân lập ở đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau. ...................34 Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ ký sinh con cái Meloidogyne spp. trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau. ...................................................................................................................................37 iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vòng đời của tuyến trùng ký sinh thực vật. ................................................3 Hình 1.2 Hình thái tuyến trùng cái Meloidogyne sp.. ................................................5 Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc P. lilacinum sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA. ............................................................................................................................7 Hình 1.4 Hình thái cơ quan mang bào tử và bào tử nấm P. lilacinum. ......................7 Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin. ..................................................11 Hình 3.1 Vòng phân giải casein của chủng PB 2.10 trong các khoảng thời gian 24 giờ; 48 giờ và 72 giờ ................................................................................................21 Hình 3.2 Vòng phân giải casein của chủng PB 1.1, PB 1.10, PB 3.1 ở 48 giờ ........21 Hình 3.3 Vòng phân giải casein của chủng KL 5.3 và KL 6.2 và KL 5.2 ở 72 giờ. 24 Hình 3.4 Vòng phân giải casein của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác sau 24 giờ , 48 giờ, 72 giờ.....................................................................25 Hình 3.5 Vòng phân giải chitin của chủng PB 3.3 sau 24 giờ , 48 giờ , 72 giờ. ......27 Hình 3.6 Vòng phân giải chitin của chủng HT 5.1 sau 24 giờ , 48 giờ, 72 giờ . .....29 Hình 3.7 Quá trình khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh. hình dạng khối trứng ban đầu, nấm tiếp xúc khối trứng, khối trứng bị kí sinh. ...................................................................................................................................33 Hình 3.8 Quá trình tuyến trùng cái Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh. hình dạng con cái ban đầu, nấm bắt đầu ký sinh, con cái bị kí sinh. ........................37 v
  9. Đồ án tốt nghiệp TÓM TẮT Khảo sát khả năng tiết enzyme ngoại bào của 38 chủng nấm Purpureocillium lilacinum bằng phương pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch. Sau thử nghiệm, chọn lọc ra các chủng nấm tiêu biểu có khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và chitinase mạnh để thử nghiệm khả năng ký sinh con cái và khối trứng Meloidogyne spp. trực tiếp trên đĩa Petri. Kết quả, tất cả các chủng nấm Purpureocillium lilacinum đều có khả năng tiết enzyme ngoại bào và khả năng tiết enzyme protease mạnh hơn so với chitinase. Đối với enzyme chitinase, đường kính vòng phân giải cơ chất tối ưu nhất đạt được sau 48 giờ. Các chủng có khả năng phân hủy chitin mạnh là PB 3.3, HT 5.1, KL 6.2 và KL 5.3. Đối với enzyme protease thì các chủng nấm khảo sát có khả năng tiết mạnh nhất sau 72 giờ. Các chủng có khả năng phân hủy casein mạnh là PB 2.10, PB 1.3, KL 5.3 và KL 6.2. Không có sự khác biệt về mặt thống kê khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng nấm phân lập từ đất rừng và đất canh tác. Kết quả thử nghiệm ký sinh tuyến trùng cho thấy, tất cả các chủng nấm khảo sát PB 1.1, PB 1.3, PB 1.10, PB 2.10, PB 3.3 đều có thể ký sinh con cái Meloidogyne spp. nhanh và mạnh hơn so với khối trứng của nó. vi
  10. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Tuyến trùng ký sinh trên thực vật gây ra thiệt hại đáng kể về mặt kinh tế đối với nhiều loại cây trồng có giá trị thương nghiệp. Hàng năm, tuyến trùng gây tổn thất 11% năng suất các loại cây ngũ cốc, rau ăn lá, chuối, khoai mì, dừa, khoai tây, củ cải đường, mía đường, khoai lang, làm giảm 15% năng suất các loại cây trồng kinh tế quan trọng (Agrios, 2005). Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, tuyến trùng phát triển khá mạnh và gây tác hại nặng nề cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều vùng, đặc biệt là rau và các loại cây công nghiệp trong đó có cây hồ tiêu. Cây hồ tiêu là cây công nghiệp dài ngày, có giá trị kinh tế, được trồng ở nhiều nơi và có giá trị xuất khẩu cao trên thế giới. Diện tích đất canh tác ở Vũng Tàu chiếm 9047 ha, trong đó có khoảng gần 0,5% diện tích đất trồng bị nhiễm bệnh nguyên nhân là do tuyến trùng gây nên.Việc dùng thuốc hóa học để tiêu diệt tuyến trùng hại thực vật kéo theo các tác động tiêu cực đến môi trường và an toàn sức khỏe cho con người và vật nuôi. Bên cạnh đó, nó còn tăng tính kháng thuốc của sâu hại, làm cho việc phòng trừ ngày càng khó khăn hơn. Vì vậy, hiện nay người ta đang tìm kiếm các tác nhân sinh học để sử dụng thay thế một phần hoặc hoàn toàn thuốc hóa học trong kiểm soát tuyến trùng gây hại. Do đó việc nghiên cứu tìm ra các chủng nấm có khả năng ký sinh tuyến trùng là vấn đề đang được quan tâm hiện nay. Nấm Purpureocillium đã được chứng minh có khả năng ký sinh tuyến trùng hiệu quả và sống hoại sinh trong vùng rễ nhiều loại cây trồng. Chúng đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu phân lập hay xác định khả năng ký sinh tuyến trùng của nấm Purpureocillium còn rất hạn chế đặc biệt là các chủng nấm được phân lập ở vùng Đông Nam Bộ. Do đó, năm 2014, Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp. Hồ Chí Minh đã xác định sự phân bố của nấm này ở các hệ sinh thái đất (đất tự nhiên-đất rừng, đất canh tác-đất trồng) ở vùng này. Kết quả cho thấy nấm xuất hiện ở hầu hết các vùng, trong đó có hệ sinh thái rừng ngập mặn ở Vũng Tàu. Việc xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm này là rất cần thiết có thể giúp ích trong việc kiểm 1
  11. Đồ án tốt nghiệp soát bệnh do tuyến trùng gây ra trong tương lai. Do đó dẫn đến lý do chọn đề tài: “Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm Purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu”. Mục tiêu nghiên cứu: So sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào, xâm nhập con cái và khối trứng Meloidogyne spp. của các chủng nấm Purpureocillium lilacium (P. lilacinum) phân lập được từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học Đây là nghiên cứu đầu tiên về xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào cũng như kí sinh tuyến trùng của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng ngập mặn và đất canh tác ở Vũng Tàu. Từ đó, xác định được hệ sinh thái đất (đất rừng hay đất canh tác) tồn tại những chủng nấm P. lilacinum có đặc tính tốt. Ý nghĩa thực tiễn So sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và khả năng xâm nhập tuyến trùng của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác giúp chọn lọc được chủng nấm kí sinh tuyến trùng hiệu quả nhằm ứng dụng chúng để phòng trừ tuyến trùng gây hại cây trồng. 2
  12. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp. 1.1.1 Phân loại Meloidogyne spp. là tuyến trùng ký sinh thực vật. Chúng tồn tại trong đất ở nơi có khí hậu nóng hay có mùa đông ngắn. Khoảng 2000 loài thực vật bị nhiễm loại tuyến trùng này, nó chiếm 5% trong nguyên nhân gây mất mùa trên thế giới (Sasser, 1985). Ấu trùng xâm nhập vào rễ cây, hình thành những nốt sần ở rễ, hấp thụ chất dinh dưỡng của thực vật. Gây ra hiện tượng chết ở cây con và giảm năng suất ở cây trưởng thành khi xâm nhập vào cây. Phân loại theo Goeldi (1889) như sau: Giới: Animalia Nghành: Nematoda Lớp: Secernentea Bộ : Tylenchida Họ: Meloidogynidae Chi: Meloidogyne 1.1.2 Vòng đời Hình 1.1 Vòng đời của tuyến trùng ký sinh thực vật. (Nguồn: www.daf.qld.gov.au) 3
  13. Đồ án tốt nghiệp Tuyến trùng rễ bắt đầu vòng đời ở giai đoạn trứng phát triển thành ấu trùng tuổi 1. Giai đoạn này ấu trùng sống trong túi trứng và lột xác chuyển sang giai đoạn ấu trùng tuổi 2. Ấu trùng ở thời kỳ này có thể bắt đầu xâm nhập vào rễ thực vật, chúng tấn công vào chóp rễ rồi đi vào các gian bào. Ấu trùng di chuyển đến các tế bào đang phân chia để tạo vị trí lấy thức ăn bằng cách tiêm dịch tiết của tuyến thực quản vào trong các tế bào rễ. Những dịch được tiết ra này là nguyên nhân gây ra sự thay đổi các chức năng sinh lý của tế bào ký sinh. Ấu trùng tuổi 2 chưa có cơ quan sinh sản. Giống với giun tròn, tuyến trùng rễ trải qua 4 giai đoạn ấu trùng, trong mỗi giai đoạn chúng lột xác giống như côn trùng. Nhờ vậy ấu trùng có một vài nét tương đồng với tuyến trùng đực và cái ở giai đoạn trưởng thành. Ở giai đoạn tuổi 4, là quá trình từ ấu trùng chuyển sang dạng hình cầu ở con cái trưởng thành hay dạng giun của con đực trưởng thành có thể nhìn thấy rõ ràng hơn. Con cái trưởng thành có thể đẻ từ 500 đến hơn 1000 trứng. Chiều dài của vòng đời tuyến trùng rễ khác nhau tùy theo mỗi loài, nhưng ngắn nhất là trong khoảng 2 tuần. Các loài ở những vùng lạnh hơn thì vòng đời sẽ dài hơn. Trứng của tuyến trùng có thể ở nguyên trong rễ hay lẫn vào trong đất. Trứng nở một cách ngẫu nhiên, không cần tiếp xúc với các dịch chiết ở rễ. Trong điều kiện thuận lợi, trứng có thể tồn tại trong đất ít nhất trong vòng 1 năm (Mitkowski và cộng sự, 2003). 1.1.3 Cấu tạo trứng của tuyến trùng Tuyến trùng cái đẻ trứng vào chất nền gelatin được sản xuất bởi 6 tuyến trực tràng, và được tiết ra trước và trong suốt quá trình đẻ trứng. Hình dạng chất nền ban đầu là ống thông qua các lớp ngoài của mô rễ bao quanh trứng, tạo thành một lớp bảo vệ chống mất nước bằng cách duy trì một mức độ ẩm cao quanh trứng (Bird, 1887). Cấu tạo của trứng tuyến trùng: lớp vỏ trứng là phần bền nhất của trứng tuyến trùng, có vai trò trong việc chống lại các tác nhân bất lợi về mặt hóa học và sinh học (Wharton, 1980). Vỏ trứng của tuyến trùng có thể bao gồm từ một đến năm lớp tùy thuộc theo từng bộ tuyến trùng. Cấu trúc thường thấy nhất của vỏ trứng gồm: lớp 4
  14. Đồ án tốt nghiệp trong cùng là lớp lipid, một lớp chitin ở chính giữa (thành phần chính) và lớp màng vitelline ở ngoài cùng (Bird và cộng sự, 1976). Lớp chitin đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra một cấu trúc bền vững để bảo vệ cho lớp lipid trong cùng. Lớp lipid bao gồm một chuỗi màng lipoprotein và dày nhất trong khoảng 0,02 – 0,04 µm, có vai trò trong việc chống thấm để bảo vệ trứng khỏi các tác nhân hóa học bất lợi (Wharton, 1980). Nếu lớp chitin bị loại bỏ thì lớp lipid cũng dễ dàng bị phá hủy. 1.1.4 Cấu tạo thành cơ thể con cái của tuyến trùng Hình 1.2 Hình thái tuyến trùng cái Meloidogyne sp.. (Nguồn: www.lsuagcenter.com) Con cái của tuyến trùng Meloidogyne spp. hình cầu với cổ ngắn chứa kim hút (nên gần giống với hình quả lê), diều giữa và tuyến thực quản (Mitkowski và cộng sự, 2003). Thành cơ thể của tuyến trùng cái được bao bọc bởi lớp cutin chứa rất ít chitin mà chủ yếu là protein và collagen (Watson, 1965). Lớp cutin Meloidogyne incognita dày khoảng 1,5 µm bao gồm lớp vỏ, lớp trung gian và lớp cơ bản. Lớp vỏ được phân tối thiểu thành 5 lớp và có dộ dày khoảng 0,1 µm, lớp giữa thì khoảng 0,4 µm và lớp cơ bản là 0,5 µm (Baldwin và cộng sự, 1975). 1.2 Nấm Purpureocillium lilacinum 1.2.1 Phân loại P. lilacinum được mô tả lần đầu bởi nhà nghiên cứu nấm người Mỹ Charles Thom vào năm 1910, dưới tên gọi Penicillium lilacinum (Thom, 1910). Phân loại giống với chủng Penicillium amethystinum của Wehmer và Spicaria rubidopurpurea 5
  15. Đồ án tốt nghiệp của Aoki (Thom, 1974). Năm 1974, Robert A. Samson chuyển tên Penicillium lilacinum thành Paecilomyces (Samson, 1974). Các ấn phẩm được xuất bản trong những năm thập niên 20, chỉ ra rằng chi Paecilomyces không phải là một đơn ngành (Inglis và cộng sự, 2006), và có họ hàng gần với các chủng Paecilomyces nostocoides, Isaria takamizusanensis và Nomuraea atypicola. Chi mới Purpureocillium được tạo ra để giữ sự phân loại này (Sung và cộng sự, 2007). là tên chung dùng để chỉ các loại nấm sản sinh bào tử tím (Luangsa-Ard và cộng sự, 2011). P. lilacinum được phân loại là nấm sinh sản vô tính bằng bào tử theo loài Isarioidea, và đã được chấp nhận ở khắp nơi trên thế giới, do dạng sinh sản hữu tính hiếm khi được tìm thấy. Phân tích phát sinh loài cho thấy P. lilacinum phân lập được có mối quan hệ gần với Trichoderma, Gliocladium và Hypocrea hơn các loài Paecilomyces kí sinh côn trùng khác trong bộ Hypocreales (Inglis và cộng sự, 2006). Nấm này được phân loại theo Samson và cộng sự (2011) như sau: Giới: Fungi Nghành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Ophiocordycipitaceae Chi: Purpureocillium Loài: Purpureocillium lilacinum 1.2.2 Điều kiện sống Nấm P. lilacinum là nấm sợi hoại sinh phổ biến, đã được phân lập từ một loạt các môi trường sống như đất trồng trọt, đất bỏ hoang, rừng đồng cỏ, sa mạc, trầm tích ở cửa sông và bùn thải. Nó cũng được tìm thấy trên trứng của tuyến trùng và con cái của tuyến trùng gây nốt sần ở rễ cây. Bên cạnh đó, nó cũng được tìm thấy ở vùng rễ của nhiều loại cây trồng. Nhiều loài có thể phát triển trên một phạm vi nhiệt độ rộng trong khoảng từ 8oC đến 38oC và phát triển tối ưu ở nhiệt độ từ 26oC đến 30oC. Nấm này có thể chịu 6
  16. Đồ án tốt nghiệp được một khoảng pH rộng và có thể phát triển trên nhiều loại môi trường tự nhiên (Samson, 1974; Anderson và cộng sự, 1995). 1.2.3 Đặc điểm hình thái Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc P. lilacinum sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA. (Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp) Khuẩn lạc của P. lilacinum trên môi trường thạch Malt tăng trưởng khá nhanh đạt đường kính 5 – 7 cm trong vòng 14 ngày ở 25oC (77oF), gồm dạng nền bông với hệ sợi nấm dinh dưỡng tăng trưởng nhanh, ban đầu màu trắng nhưng khi hình thành bào tử thì chuyển sang màu tím. Mặt khác, có một số chủng đôi khi không có màu nhưng thường thì đều có màu tím (Samson, 1974). Hình 1.4 Hình thái cơ quan mang bào tử và bào tử nấm P. lilacinum. (Nguồn: http://thunder-house4-yuri.blogspot.com/2012_06_01_archive.html) P. lilacinum tạo thành một hệ sợi nấm dày đặc sản sinh ra cuống bào tử đính. Sợi nấm sinh dưỡng có vách trơn, trong suốt, rộng từ 2,5 – 4 µm. Cuống bào tử được sinh ra từ các sợi nấm cơ chất, hoặc những sợi nấm dinh dưỡng, dài khoảng 400 – 600 µm. Thể bình phình ra ở gốc và thon dần về phía ngọn. Bào tử trần được 7
  17. Đồ án tốt nghiệp sinh ra tạo thành chuỗi dài, ở phía cuối thể bình gắn trên cuống bào tử. Bào tử nảy mầm khi có đủ độ ẩm và dinh dưỡng thích hợp. Bào tử trần có dạng elip đến hình thoi, có vách trơn hơi nhám. Không xuất hiện bào tử đảm (Samson, 1974). 1.2.4 Đặc điểm dinh dưỡng Nấm không có diệp lục tố nên cần cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (dị dưỡng) sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong trứng và tuyến trùng Meloidogyne spp.) hay hoại sinh trên xác bã hữu cơ. Do trứng và tuyến trùng là nguồn hữu cơ phức tạp nên nấm sẽ tiết ra enzyme ngoại bào (protease, chitinase) để phân giải các chất khó hấp thụ thành những chất đơn giản dễ sử dụng (Nguyễn Văn Bá và cộng sự, 2005). 1.2.5 Khả năng tiết enzyme ngoại bào Vỏ trứng được cấu tạo từ 3 lớp khác biệt và thành phần chính gồm protein và chitin, đã tạo thành cấu trúc dạng sợi nhỏ chứa glycoprotein ở dạng vô định hình (Perry, 2002). Chitinase và proteases đóng vai trò quan trọng trong suốt quá trình xâm nhập vào vỏ trứng, và tác động vào sự phân hủy của vỏ trứng (Morton, 2003; Segers, 1996). Nấm có khả năng tiết enzyme ngoại bào (đặt biệt là enzyme protease, chitinase và collagenase) có ảnh hưởng nhiều trong việc ký sinh lên trứng của tuyến trùng (Huang, 2004). P. lilacinum có khả năng tiết enzyme serine protease và chitinase để tham gia vào quá trình phá hủy vỏ trứng của tuyến trùng (Morgan và cộng sự, 1984; Khan và cộng sự, 2004). Nhiều enzyme được tiết bởi P. lilacinum đã được nghiên cứu. Enzyme serine protease cơ bản có khả năng phân hủy sinh học trứng Meloidogyne hapha (Bonants và cộng sự, 1995). Một chủng P. lilacinum đã được phân lập và nghiên cứu có khả năng tiết enzyme protease và chitinase làm mỏng vỏ trứng tuyến trùng Meloidogyne javanica để cho móc xâm nhiễm có thể đâm xuyên qua vỏ trứng (Khan và cộng sự, 2004). 8
  18. Đồ án tốt nghiệp Enzyme protease Enzyme protease (còn gọi là peptidase hay proteinase) là nhóm enzyme có khả năng phân giải protein. Đó là quá trình chuyển hóa protein bằng cách cắt các liên kết peptide (-CO-NH-) liên kết các acid amin trong một chuỗi polypeptide. Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase. Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: Serin proteinase - những proteinase chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Cysteine proteinase - chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Aspartic proteinase - chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động. Các aspartic thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. Metallo proteinase - được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA (Trần Thị Nhã Uyên, 2010). Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới sinh vật như eukaryote, prokaryote, archaea và virus. Những enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính (Barrett, 1994). Bước 1 - hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử carbon trong nhóm carboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine. Bước 2 (khử acyl hóa) phức hệ acyl-enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O theo chiều ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme. Enzyme chitinase Chitinase là enzyme thủy phân liên kết glycoside trong chitin (Jolles, 1999). Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, 1-4-β- chitobiosidase, N-acetyl-β- D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase. Endochitinase là enzyme phân cắt 9
  19. Đồ án tốt nghiệp nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn olygosaccharides. Chitin 1,4-β- chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các dimer chitobiose. N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine. Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D- glucosamine. Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa. Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3] từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2, β-N-acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên tục từ đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc). Endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơ chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin thô thu từ vỏ tôm (Lê Thị Huệ, 2010). 1.2.6 Độc tố của P. lilacinum Ngoài khả năng tiết enzyme ngoại bào P. lilacinum còn có khả năng sinh độc tố. Độc tố chính của nấm P. lilacinum là paecilotoxin (leucinostatins), là một trong các tác nhân gây ra cái chết cho kí chủ. Paecilotoxin có cấu trúc cực kỳ phức tạp, là một chuỗi peptide thẳng gồm nhiều acid béo chưa bão hòa ở đầu N và amine ở đầu C. Paecilotoxin có pháp danh hóa học là (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[2[2-(3- arbamoylpropylcarbomoyl)propan-2-ylcarbamoyl]propan-2-ylcarbamoy]-3- methylbutyl]carbomoyl]-3-methyl-butyl]carbomoyl]propan-2-ycarbomoyl]-2- hydroxy-3-methyl-butul] carbomyl]-5-hydroxy-3-methyl-7-oxo-nonyl]-4-methyl-1- [(E.4S)-4-methylhex-2-enoyl]pyrrolidin-2-carboxamide (Nevalainen và cộng sự, 1977). Sản phẩm của paecilotoxin có rất nhiều dạng, nhưng khá giống nhau ở mỗi chủng, thường thì độc tố chính là Paecilotoxin A hoặc Paecilotoxin B. Tùy từng loài 10
  20. Đồ án tốt nghiệp khác nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriubin, viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hoá thứ cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng. Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin. 1.2.7 Quá trình kí sinh Nấm xâm nhập vào trứng và con cái của tuyến trùng thông qua chất nền gelatin của trứng và lỗ sinh dục hay cổ của tuyến trùng cái. Một khi vào bên trong, sợi nấm sẽ phân nhánh và đâm xuyên qua bề mặt vỏ trứng. Chỗ phình ra ở đầu sợi nấm sẽ tạo ra những đĩa áp tiếp xúc với bề mặt trứng. Móc xâm nhập được tạo nên bên dưới sợi áp sẽ đâm xuyên và mọc bên trong vỏ trứng. Trứng bị xâm nhiễm sẽ phình ra và biến dạng. Sau đó, lớp màng vitelline chia thành ba vùng, xuất hiện một lượng lớn không bào và lớp lipid hầu như biến mất (Esser và cộng sự, 1993). Khi sợi nấm đã xâm nhập vào trứng, nó nhanh chóng tiêu diệt các ấu trùng bên trong trước khi tiến ra khỏi vỏ trứng rỗng để sản sinh bào tử đỉnh và mọc về phía các trứng liền kề. Ở con cái trưởng thành giai đoạn bị nhiễm nấm là khi sợi nấm tiến vào lỗ sinh dục hoặc hậu môn (Jatala và cộng sự, 1979). 11
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược