1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô dược (Lindera myrrha)

Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô dược (Lindera myrrha)

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết ô dược; khảo sát khả năng ức chế quá trình tổng hợp hắc tố của cao chiết ô dược. Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HOÁ VÀ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP HẮC TỐ Ở LOÀI Ô DƯỢC (Lindera myrrha) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG ThS.

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 109

Ngày tạo 10/11/2021 12:26:08 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 3.79 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HOÁ VÀ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP HẮC TỐ Ở LOÀI Ô DƯỢC (Lindera myrrha) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG ThS. LÊ QUỲNH LOAN Sinh viên thực hiện : VÕ THỊ THUẬN MSSV: 1311100730 Lớp: 13DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. Đồ án tốt nghiệp CAM ĐOAN Người thực hiện đề tài xin cam đoan đề tài này là công trình nghiên cứu của riêng người thực hiện đề tài dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoàng Dũng và Ths. Lê Quỳnh Loan. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực. Mọi tài liệu tham khảo dùng trong đề tài này đều được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm công bố. Tất cả nội dung, sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, không trung thực, người thực hiện đề tài xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TP. Hồ Chí Minh, Ngày 18 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Võ Thị Thuận i
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên em xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, Ban chủ nhiệm bộ môn Công nghệ sinh học cùng thầy, cô bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại học Công Nghệ TP.HCM đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu và kĩ năng để em hoàn thành tốt quá trình học tập, hoàn thành khóa luận này và làm nền tảng chuẩn bị cho công việc sau này. Trong suốt khoảng thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại phòng Vi sinh - Viện Sinh học Nhiệt đới. Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến: TS. Hoàng Quốc Khánh, trưởng phòng vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo cho em được làm đề tài tại đây. TS. Nguyễn Hoàng Dũng đã gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn chi tiết công việc, luôn theo sát chỉ dẫn, động viên em, hỗ trợ kinh phí suốt quá trình làm khóa luận. ThS. Lê Quỳnh Loan đã hướng dẫn tận tình, giúp đỡ và hỗ trợ em trong suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp. Thầy Ngô Đức Duy đã tạo điều kiện, hỗ trợ em làm đề tài tốt nghiệp. Em xin chân thàh cám ơn cô Nguyễn Hoài Hương, phòng Vi sinh, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ TP. HCM đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận đề tài. Cám ơn tập thể lớp 13DSH02 đã cùng em trao đổi, cùng nhau học tập trong suốt bốn năm tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, cám ơn tập thể phòng Vi sinh – Viện Sinh học Nhiệt đới đã động viên và hết lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Cuối cùng, con gửi lời cám ơn sâu sắc đến Ba Mẹ đã sinh ra và nuôi dạy con, cám ơn anh chị trong gia đình luôn bên cạnh động viên em trong suốt quá trình học tập và trưởng thành. ii
  4. Đồ án tốt nghiệp Vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình nghiên cứu, hoàn thiện đề tài này em không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến đóng góp từ phía quý Thầy Cô. Tp. Hồ Chí Minh, Ngày 18 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Võ Thị Thuận iii
  5. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CÁM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ....................................................................................................... iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................ viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ..................................................................... ix MỞ ĐẦU ............................................................................................................1 1. Đặt vấn đề…………………………………………………………………1 2. Tình hình nghiên cứu……………………………………………………...2 3. Mục đích nghiên cứu……………………………………………………...3 4. Nhiệm vụ nghiên cứu……………………………………………………...3 5. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………….4 6. Kết quả đạt được…………………………………………………………..4 7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài………………………………….5 8. Kết cấu Đồ án tốt nghiệp……………………………………………….....5 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................6 1.1. Giới thiệu chung về chi Lindera (Họ Lauraceae)............................6 iv
  6. Đồ án tốt nghiệp 1.1.1. Chi Lindera (Họ Lauraceae) ...........................................................6 1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hoá học .................................................8 1.2. Tổng quan về cây ô dƣợc ..................................................................9 1.2.1. Phân loại khoa học ..........................................................................9 1.2.2. Đặc điểm thực vật .........................................................................10 1.2.3. Thành phần hoá học ......................................................................12 1.2.4. Công dụng theo y học dân gian .....................................................12 1.3. Tổng quan về quá trình tổng hợp sắc tố da ..................................12 1.3.1. Ảnh hưởng của tia cực tím (UV) trên người .................................12 1.3.2. Melanin .........................................................................................14 1.3.3. Vai trò của melanin .......................................................................15 1.3.4. Phân loại melanin ..........................................................................16 1.3.5. Con đường tổng hợp hoá học melanin ..........................................17 1.3.6. Các lại bênh liên quan đến sắc tố ..................................................19 1.3.7. Một số hoạt chất ức chế quá trình tổng hợp melanin ....................22 1.4. Tổng quan về chiết xuất dƣợc liệu .................................................27 1.4.1. Chiết xuất dược liệu ......................................................................27 1.4.2. Phương pháp chiết xuất .................................................................29 1.4.3. Phương pháp Soxhlet ....................................................................31 1.5. Hoạt tính kháng oxy hoá ................................................................31 1.5.1. Khái niệm về gốc tự do .................................................................31 1.5.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá .......................33 1.6. Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ..................................................37 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............39 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................39 2.2. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................39 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................39 2.2.2. Dụng cụ - Thiết bị .........................................................................39 2.2.3. Hoá chất ........................................................................................39 v
  7. Đồ án tốt nghiệp 2.3. Quy trình thực hiện .........................................................................40 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................41 2.4.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu .....................................................41 2.4.2. Quy trình chiết và thu nhận cao chiết ...........................................41 2.4.3. Phương pháp xác định thành phần hoá học ..................................43 2.4.4. Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do (DPPH assay) .........47 2.4.5. Phương pháp nuôi cấy tế bào (B16F10) .......................................49 2.4.6. Phương pháp xác định độc tính .....................................................49 2.4.7. Phương pháp xác định hàm lượng melanin ..................................49 2.4.8. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ............................50 2.4.9. Xử lý số liệu ..................................................................................51 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................52 3.1. Kết quả thu nhận cao tổng methanol ô dƣợc................................52 3.2. Định tính thành phần cao tổng methanol ô dƣợc.........................53 3.3. Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá của cao tổng methanol ô dƣợc …………………………………………………………………………..54 3.4. Khảo sát tác dụng của ô dƣợc lên độc tính của tế bào u sắc tố B16F10………………………………………………………………………... 56 3.5. Khảo sát tác dụng của ô dƣợc lên quá trình tổng hợp melanin ..57 3.6. Kết quả chiết và thu nhận cao phân đoạn ....................................58 3.7. Kết quả định tính thành phần hoá học cao phân đoạn ...............59 3.8. Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá cao chiết phân đoạn ...............61 3.9. Khảo sát tác dụng của phân đoạn cao lên độc tính và ức chế melanin của tế bào u sắc tố B16F10 ................................................................63 3.10. Kết quả xác định thành phần hoá học bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .............................................................................64 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................67 4.1. Kết luận ............................................................................................67 4.2. Đề nghị..............................................................................................68 vi
  8. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DHICA 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid DHI 5,6-dihydroxyindole DHICA 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid DMSO Dimethyl sulfoxide DOPA 3,4-dihydroxyphenylalanine DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl HPLC High Pressure Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) IC50 Half maximal Inhibitory Concentration (Nồng độ của một chất mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme) MTT 3-(4,5- dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide PIH Post-inflammatory hyperpigmentation TRP-1 DHICA oxidation TRP-2 DOPA chrome tautomerase vii
  9. Đồ án tốt nghiệp UV Ultraviolet (Tia cực tím). DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Dung môi khác nhau dung trong chiết xuất các nhóm hoạt chất trong dược liệu. ...................................................................................................................28 Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cao tổng methanol ô dược ...................................................................................................................................53 Bảng 3.2. Kết quả xác định thành phần hoá học các mẫu cao phân đoạn ô dược ...59 viii
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Lindera ....................................................8 Hình 1.2. Một số hợp chất Sesquiterpenoids được xác định trong chi Lindera ........8 Hình 1.3. Một số hợp chất alkaloids được xác định trong chi Lindera .....................9 Hình 1.4. Cây ô dược...............................................................................................11 Hình 1.5. Cấu trúc phân tử melanin (1,3,5-triazine-2,4,6-triamine) .......................14 Hình 1.6. Cấu tạo của da .........................................................................................14 Hình 1.7. Công thức hoá học của các loại melanin. ................................................17 Hình 1.8. Hai nhóm chính của melanin. ..................................................................17 Hình 1.9. Sơ đồ các con đường tổng hợp melanin ..................................................18 Hình 1.10. Các bệnh da tăng sắc tố. ........................................................................20 Hình 1.11. Các bệnh giảm sắc tố. ............................................................................21 Hình 1.12. Hydroquinone ........................................................................................23 Hình 1.13. Niacinamide (Vitamin B3) ....................................................................23 Hình 1.14. Arbutin (4-Hydroxyphenyl-α-D-glucopyranoside) ...............................24 Hình 1.15. Azelaic acid ...........................................................................................25 Hình 1.16. Kojic acid...............................................................................................26 Hình 1.17. Vitamin C ..............................................................................................26 Hình 1.18. Một số hợp chất ức chế quá trình tổng hợp melanin .............................27 ix
  11. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.19. Bình ngấm kiệt ......................................................................................30 Hình 1.20. Dụng cụ chiết Soxhlet ...........................................................................31 Hình 1.21. DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) ................................................34 Hình 1.22. Phản ứng của DPPH (gốc tự do) thành DPPH (không có gốc tự do)....35 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình và phương pháp thực hiện .............................................41 Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu ...............................................................................41 Hình 2.3. Phản ứng của DPPH (gốc tự do) thành DPPH (không có gốc tự do)......47 Hình 2.4. Sơ đồ điều kiện chạy sắc ký HPLC. ........................................................51 Hình 3.1. Mẫu ô dược ..............................................................................................52 Hình 3.2. Mẫu được chiết ngâm dầm với dung môi Methanol và mẫu cao thu được. ...................................................................................................................................53 Hình 3.3. Đồ thị thể hiện khả năng kháng oxy hóa của ..........................................55 Hình 3.4. Tác dụng của cao methanol ô dược lên độc tính tế bào. .........................56 Hình 3.6. Tác dụng của cao methanol ô dược lên quá trình tổng hợp melanin. .....57 Hình 3.5. Tế bào B16F10 melanoma thu nhận sau khi xử lý với cao methanol ô dược ...........................................................................................................................57 Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện hiệu suất thu hồi (%) của các cao phân đoạn ô dược ...59 Hình 3.8. Đồ thị thể hiện khả năng chống oxi hóa của các cao dịch chiết. .............61 Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện giá trị IC50 của các phân đoạn cao ô dược ....................62 Hình 3.10. Tác dụng của phân đoạn cao lên độc tính và ức chế melanin của tế bào u sắc tố B16F10 .........................................................................................................63 Hình 3.12. Phổ HPLC dịch cao chiết phân đoạn ethyl acetate ô dược....................65 Hình 3.11. Phổ HPLC dịch cao chiết methanol ô dược ..........................................65 x
  12. Đồ án tốt nghiệp xi
  13. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Melanin là một hợp chất phenolic sinh học cao phân tử có vai trò quan trọng trong việc tạo nên sắc tố da ở người. Các hắc tố (melanin) trong da được sản xuất bởi tế bào hắc tố nằm trong lớp nền của biểu mô. Trong tế bào hắc tố, melanin được tổng hợp trong một bào quan đặc biệt gọi là melanosome. Melanosome chứa nhiều enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp melanin. Tuy nhiên, việc gia tăng lượng melanin tổng hợp ở biểu mô sẽ gây ra hiện tượng đen da hoặc một số bệnh về da như: nám da, tàn nhang và tăng sắc tố sau viêm do melanin được tích luỹ vượt mức ở biểu mô. Những biểu hiện bên ngoài của những bệnh này có thể có tác động mạnh đến tâm lý người bệnh cũng như làm giảm các hoạt động xã hội, hiệu quả trong công việc hay tự kỷ. Do đó, có rất nhiều nghiên cứu được tiến hành và rất nhiều hoạt chất làm trắng da đang được sàng lọc. Tuy nhiên, tại nhiều quốc gia, các chất làm trắng da như hydroquinone, corticosteroids, các hợp chất chứa thủy ngân vẫn còn được sử dụng bất chấp tác dụng nguy hại của chúng. Một số chất khác như arbutin, kojic acid, vitamin C cũng đươc sử dụng nhưng những chất này có nhược điểm là hiệu quả không cao hoặc không bền. Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Không chỉ các nước phương Đông mà các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu. Nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học tốt đã được phân lập và đưa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh và làm đẹp. Xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học tốt từ các loài thực vật làm mỹ phẩm đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là những hợp chất có thể ức chế quá trình tổng hợp melanin nhưng không gây chết cho tế bào và có nguồn gốc thiên nhiên độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp. 1
  14. Đồ án tốt nghiệp Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật đa dạng và phong phú. Theo thông kê “Tiếp cận các nguồn gen và chia sẻ lợi ích” của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN) thì nước ta có khoảng gần 13.000 loài thực vật bậc cao trong đó có khoảng hơn 4.000 loài được sử dụng làm thuốc. Trước kia, các cây thuốc dân gian đóng vai trò quan trọng trong việc chữa bệnh cho con người. Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ thực vật đã được nghiên cứu và ứng dụng trực tiếp làm các chất dẫn đường cho một loạt các hợp chất ứng dụng mới trong các ngành công nghiệp như chữa bệnh, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm v.v… Do đó, việc tiếp tục nghiên cứu tính chất và tác dụng của các hợp chất thiên nhiên vẫn đang là nhiệm vụ của rất nhiều nha khoa học. Trong thế giới thực vật muôn màu, đa dạng, cây ô dược (Lindera myrrha Merr) là một loài thuộc chi Lindera, họ Long não (Lauraceae) được sử dụng để trị bệnh một số bệnh trong y học cổ truyền như: đau bụng, nôn mửa, trị tiểu nhiều lần hoặc đái dầm, trị chứng rối loạn tiêu hóa ăn không tiêu, và một số bệnh khác. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài này đã chỉ ra sự có mặt của các lớp chất alkaloid, tinh dầu…Nhiều hoạt chất trong số đó đã thể hiện nhiều hoạt tính sinh học tốt như: Borneol, Linderane, Linderalactone. Tuy nhiên, khả năng kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố của ô dược chưa được nghiên cứu chuyên sâu. Do vậy, đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố từ loài ô dƣợc (Lindera myrrha Merr)” được thực hiện để tiến hành kiểm tra khả năng ức chế quá trình tổng hợp melanin từ ô dược. 2. Tình hình nghiên cứu  Tình hình nghiên cứu trên thế giới Cho đến nay, những nghiên cứu về loài ô dược vẫn chưa được công bố nhiều. Tuy nhiên, những nghiên cứu về những loài thuộc chi Lindera đã được công bố. Năm 1925, lần đầu tiên Kondo và cộng sự đã xác định được hợp chất lindeneol từ loài L. strychnifolia. Sau đó, năm 1964, takeda và cộng sự đã xác định được hơn 100 chất tương tự, những hợp chất này chủ yếu được phân lập từ L. strychnifolia, L. 2
  15. Đồ án tốt nghiệp chunii và L. aggregate. Trong đó có một số hợp chất có tính chống ung thư, chống viêm và kháng vi – rút. Năm 2011, Kim và cộng sự đa tìm ra các hợp chất flavonoids (có dạng một phân tử flavone kết hợp với một hoặc hai nhóm p-methene) có tác dụng gây độc tế bào và ức chế sự phóng thích LDH từ các tế bào thần kinh H9c2. Chiết xuất L. aggregata thường được chỉ định để điều trị các bệnh về hệ tiết niệu như đái tháo đường và đá tiểu và có tác dụng rõ rệt đến viêm dạ dày mãn tính và viêm khớp mãn tính đã được Zang và Wang công bố năm 2000. Năm 2002, Lee và cộng sự đã công bố hợp chất lucitone có độc tính tế bào với các dòng tế bào ung thư B16 – F10, HT1080 và K562 với giá trị ED50 lần lượt là 2,2; 2,5 và 8,3 lg/ml.  Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Trong tài liệu những cây thuốc và vị thuốc ở Việt Nam, theo Đỗ Tất Lợi, loài ô dược ở Việt Nam được sử dụng như một vị thuốc nam có rất nhiều công dụng chữa bệnh như: trị đau bụng, chứng rối loạn tiêu hoá (ăn không tiêu, ợ hơi, ợ chua, buồn nôn…), tiểu nhiều lần hoặc đái dầm. Mặc dù loài ô dược đã được sử dụng trong y học cổ truyền, nhưng hiện nay ở Việt Nam chưa có hoạt tính ức chế hắc tố nào về loài này. Việc nghiên cứu thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học sẽ góp phần làm sáng tỏ thêm thành phần hóa học cũng như các kinh nghiệm sử dụng dược liệu này trong dân gian và đặc thù loài tại Việt Nam để định hướng cho những nghiên cứu ứng dụng tiếp theo. 3. Mục đích nghiên cứu - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết ô dược. - Khảo sát khả năng ức chế quá trình tổng hợp hắc tố của cao chiết ô dược. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 4.1. Giai đoạn 1 - Tiến hành chiết, cô quay chân không và thu cao methanol. - Định tính thành phần hoá học từ cao methanol. - Thử hoạt tính kháng oxy hóa từ cao methanol thu được. 3
  16. Đồ án tốt nghiệp - Khảo sát tác dụng của ô dược lên quá trình tổng hợp melanin. - Khảo sát tác dụng của ô dược lên độc tính của tế bào u sắc tố B16F10. 4.2. Giai đoạn 2 - Từ cao tổng methanol, tiến hành chiết phân đoạn với các dung môi có độ phân cực khác nhau (hexan, chloroform, ethyl acetate), cô quay chân không và thu cao chiết. - Khảo sát tác dụng của các cao phân đoạn lên hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn. - Khảo sát tác dụng của phân đoạn cao chiết ô dược lên quá trình tổng hợp melanin. - Khảo sát tác dụng của phân đoạn cao chiết ô dược lên độc tính của tế bào u sắc tố B16F10 4.3. Giai đoạn 3 Xác định thành phần hoá học cao ô dược bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu  Nghiên cứu lý thuyết - Thu thập, tổng hợp tài liệu, tư liệu về nguồn nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, thành phần hóa học và ứng dụng của loài ô dược. - Tổng hợp tài liệu về phương pháp lấy mẫu, chiết tách và xác định thành phần hóa học các chất từ thực vật. - Tổng hợp tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học và ứng dụng của loài ô dược.  Nghiên cứu thực nghiệm - Phương pháp lấy và xử lí mẫu. - Phương pháp tách chiết các hợp chất hữu cơ bằng dung môi: phương pháp chiết rắn – lỏng, chiết lỏng – lỏng. 4
  17. Đồ án tốt nghiệp - Phương pháp xác định thành phần hoá: định tính và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). - Phương pháp sinh học thăm dò hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố của cao chiết. - Phương pháp xác định độc tính của cao chiết lên tế bào.  Sử dụng phần mềm Sigma Plot version 10.0 và phần mềm Microsoft Excel 2010 để xử lý số liệu. 6. Các kết quả đạt đƣợc Chiết mẫu ô dược với dung môi, hiệu suất thu hồi 12,46%. Từ cao tổng methanol, chiết phân đoạn với bốn loại dung môi, hiệu suất thu hồi của phân đoạn cao hexan là 3,42%, chloroform 10,57% và ethyl acetate 23,45%, nước 43,02%. Định tính thành phần hoá học, kết quả cho thấy các mẫu cao đều chứa nhiều hợp chất hoá học như: alkaloid, carbohydrate, flavonoid, chất béo, protein. Cao methanol từ cây ô dược cho hiệu quả ức chế quá trình tổng hợp melanin và không gây độc cho tế bào ở nồng độ 200 g/ml. Cao methanol có khả năng bắt gốc tự do cao với IC50 = 58,89 g/ml. Phân đoạn Ethyl acetate có khả năng bắt gốc tự do cao nhất trong các phân đoạn với IC50 = 10,71 g/ml. Cho hiệu quả ức chế tổng hợp melanin và không gây độc với tế bào ở nồng độ 200 g/ml. 7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Những kết quả nghiên cứu sẽ góp phần cung cấp các thông tin có ý nghĩa khoa học về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cao ô dược, qua đó góp phần nâng cao giá trị ứng dụng của cây ô dược trong ngành dược liệu. 8. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp Kết cấu của đồ án tốt nghiệp này gồm có 4 chương: - Chương 1: Tổng quan tài liệu - Chương 2: Vật liệu và phương pháo nghiên cứu - Chương 3: Kết quả và thảo luận - Chương 4: Kết luận và đề nghị. 5
  18. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về chi Lindera (Họ Lauraceae) 1.1.1. Chi Lindera (Họ Lauraceae) Chi Lindera thuộc họ Long não (Laraceae) hay còn gọi là Nguyệt quế, gồm khoảng 100 loài, phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới, đặc biệt là các nước Đông Nam Á và Brazil. Chúng chủ yếu là các loại thân gỗ hay cây bụi có hương thơm (Võ Văn Chi, 1997). Cây gỗ có cành non màu xanh, vỏ có mùi thơm, thường có chồi ngủ đông. Lá thường mọc cụm đầu cành, có ba gân chính hay hệ gân đơn giản. Hoa mẫu ba, thường có nhị lép và tuyến mật ở gốc chỉ nhị. Quả thường có đài dính liền, phát triển thành dạng đấu dưới quả (Phạm Hoàng Hộ, 1991) (Hình 1.1). Theo thông kê “Tiếp cận các nguồn gen và chia sẻ lợi ích” của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN), Lindera không chỉ mang giá trị kinh tế cao mà bên cạnh đó nó còn mang tính dược lý và sinh học như khả năng chống ung thư, cao huyết áp, kháng viêm và được dùng làm thuốc giảm đau. Các nghiên cứu đã tìm ra được khoảng 341 thành phần có trong cây bao gồm sesquiterpenoids, alkaloids, butanolides, lucidones, flavonoids và phenylpropanoids. Butanolides và lucidones quyết định khả năng chống ung thư, trong khi aporphine alkaloids lại quyết định khả năng kháng viêm và giảm đau. Tuy vậy, những hợp chất này cần được đánh giá thêm, thông qua các nghiên cứu chuyên sâu. Cây thuộc họ Lauraceae mang giá trị kinh tế cao vì một số loài của chúng được ứng dụng rộng rãi làm nguồn gia vị, dầu thơm và đặc biệt là dược liệu. Hơn nữa, chúng còn đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái vì là loài cây chiếm ưu thế trong các khu rừng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Gentry, 1988; Van der Werff và Richter, 1996). Lindera, một chi chính trong họ Lauraceae, phân bố rất rộng rãi ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới ở Châu Á và Trung Tây Mỹ, bao gồm khoảng 100 loài (Flora Republicae Popularis Sinicae, 1982). 6
  19. Đồ án tốt nghiệp Hầu hết các loài trong chi Lindera chứa một lượng dầu rất lớn, ứng dụng tốt trong việc sản xuất xà phòng, chất bôi trơn và dùng để tách chiết acid lauric. Nhiều loài khác thì được dùng trong việc sản xuất gia vị, nước hoa và vật liệu xây dựng. Đáng nói nhất đó là tính dược liệu của chi. Những chiết xuất từ củ, thân, lá, rễ…có công dụng ấm thận, giảm đau, chán nản (17 công thức trong “Dược điển Trung Quốc”); điều trị các bệnh tiết niệu như đái dầm, sỏi thận và dùng để chữa trị viêm khớp, viêm dạ dày mãn tính. Ngoài ra, lá của một số loài thuộc chi Lindera như L. aggregate còn điều trị viêm vú, viêm tế bào da, mụn nhọt (Han và cộng sự, 2008). Lá tươi xào với rượu gạo có thể điều trị bệnh thấp khớp. Chiết xuất của L. aggregate tại Nhật Bản được dùng để điều trị bệnh đột quỵ và bệnh tả (Chou và cộng sự, 2000). Vỏ cây của loài L. obtusiloba dùng làm tan máu bầm, thông cổ. Rễ của L. glauca điều trị mệt mỏi, viêm khớp (Zang và Wang, 2000). Rễ, vỏ cây và cành của L. umbellata chữa loét dạ dày, đau bụng, bệnh tả, tê phù, chống co thắt (Tanaka và cộng sự, 1985). Lindera glauca Lindera aggregate Lindera myrhaa Lindera obtusiloba 7
  20. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Lindera 1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hoá học Trong tổng thể, 341 chất chuyển hóa thứ cấp đã được cô lập và xác định từ chi Lindera cho đến nay. Những thành phần chủ yếu gồm có bảy loại: sesquiterpenoids, alkaloids, butanolides, lucidones, flavonoids, phenylpropanoids và các loại khác. Trong đó, sesquiterpenoids và alkaloids là thành phần chiếm ưu thế (Hình 1.2, hình 1.3). 1.1.2.1. Sesquiterpenoids Năm 1925, Kondo và cộng sự lần đầu tiên đã xác định được hợp chất lindeneol từ loài L. strychnifolia. Năm 1964, Takeda và cộng sự đã xác định được hơn 100 chất tương tự. Nhìn chung, những hợp chất này được phân lập từ L. strychnifolia, L. chunii, và L. aggregata. Một số hợp chất có đặc tính kháng ung thư, kháng viêm và R1: OH R1: OH R2: H R2: H R: H Lindeneol Linderene Lindenenone Lindestrene Linderalactone 1,4-Dimethyl-7- Linderazulene ethylazulene Hình 1.2. Một số hợp chất Sesquiterpenoids được xác định trong chi Lindera kháng vi-rút. 8
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược