1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Natto

Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Natto

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm chọn được chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease cao từ các chủng nghiên cứu; xác định một số điều kiện nuôi cấy bán rắn để chủng B. subtilis Natto sinh tổng hợp enzyme protease có hoạt tính cao nhất; xác định ảnh hưởng của pH lên khả năng phản ứng protease của chủng B. subtilis Natto. Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ Ả

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 74

Ngày tạo 10/11/2021 12:20:06 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 1.24 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đế... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis Natto Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. NGUYỄN NHƯ NHỨT ThS. PHAN TRUNG HẢI Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ MINH TRANG MSSV: 1211100022 Lớp: 12DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của ThS. Nguyễn Như Nhứt và ThS. Phan Trung Hải. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kì hình thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong đồ án còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kì gian lận nào Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung đồ án của mình. TP. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực tập NGUYỄN THỊ MINH TRANG
  3. LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của quý thầy cô đã không quản công lao khó nhọc trang bị những kiến thức cần thiết cho chúng em, tạo điều kiện cho chúng em có cơ hội được áp dụng những kiến thức đó vào thực tiễn thông qua đợt thực tập này. Tuy thời gian thực tập ngắn ngủi nhưng đã trang bị cho em nhiều kiến thức thực tiễn bổ ích cho công việc sau này. Em xin chân thành biết ơn: - Ban giám hiệu cùng toàn thể giáo viên giảng dạy của trường Đại học Công Nghệ TP.HCM nói chung và thầy cô khoa Công nghệ sinh học nói riêng đã cho em có cơ hội được đi thực tập. - Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Như Nhứt, người đã tạo điều kiện, hướng dẫn và giúp em hoàn thành tốt bài đồ án của mình. - Em xin cảm ơn ThS. Phan Trung Hải đã hướng dẫn và hỗ trợ em hoàn thành đồ án này. Em xin tri ân sự giúp đỡ tận tình của: Các anh, chị phòng thí nghiệm Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương cùng toàn thể các anh, chị các phòng ban của Công ty đã tạo mọi điều kiện hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến những người bạn của tôi, đã chia sẻ, giúp đỡ và động viên tôi trong học tập và ngoài cuộc sống. Sinh viên thực tập NGUYỄN THỊ MINH TRANG
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................ i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................... v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH ........................................................... vi MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 1. Tính cấp thiết .................................................................................................. 1 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................... 2 3. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu ..................................................................................... 3 5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 3 6. Kết quả đạt được............................................................................................. 3 7. Kết cấu đề tài nghiên cứu ............................................................................... 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 5 1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis Natto .................................................................. 5 1.1.1. Hệ thống phân loại Bacillus subtilis Natto ............................................. 5 1.1.2. Lịch sử phát hiện .................................................................................... 5 1.1.3. Phân bố ................................................................................................... 7 1.1.4. Đặc điểm của Bacillus subtilis Natto...................................................... 7 1.2. Enzyme protease ........................................................................................... 10 1.2.1. Khái niệm về protease ........................................................................... 10 1.2.2. Phân loại ................................................................................................ 11 1.2.3. Nguồn thu nhận ..................................................................................... 12 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp protease của Bacillus subtilis ......... 14 1.4. Ứng dụng của protease.................................................................................. 18 1.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protease ................................................... 19 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.5.1.Trên thế giới ........................................................................................... 19 1.5.2. Tại Việt Nam ......................................................................................... 20 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 22 2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm.................................................. 22 2.1.1. Địa điểm ................................................................................................ 22 2.1.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................. 22 2.2. Vật liệu thí nghiệm........................................................................................ 22 2.2.1. Nguồn vi sinh vật................................................................................... 22 2.2.2. Cơ chất dùng trong thí nghiệm .............................................................. 22 2.2.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng .................................................................. 23 2.3. Môi trường nuôi cấy...................................................................................... 23 2.3.1. Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton agar (MT1) ................... 23 2.3.2. Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton (MT2) ........................... 23 2.3.3. Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease (MT3) ............ 24 2.3.4. Môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease (MT4) ............................... 24 2.4. Phương pháp tiến hành ................................................................................. 25 2.4.1. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật .............................................. 25 2.4.2. Phương pháp tăng sinh .......................................................................... 25 2.4.3. Phương pháp xác định mật độ tế bào .................................................... 25 2.4.4. Phương pháp định tính khả năng tổng hợp protease ............................. 26 2.4.5. Phương pháp nuôi cấy bán rắn .............................................................. 27 2.4.6 Phương pháp thu nhận dịch chiết từ nuôi cấy bán rắn ........................... 27 2.4.7. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease .................................. 27 2.4.8. Phương pháp tủa enzyme protease ........................................................ 30 2.4.9. Phương pháp xử lý thống kê .................................................................. 30 2.5. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 30 2.5.1. Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng tổng hợp enzyme protease cao ..................................................................................................... 30 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.5.2. Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease của các chủng Bacillus subtilis Natto trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau ....... 30 2.5.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme protease của chủng Bacillus subtilis Natto ..................................................... 31 2.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác protease của chủng Bacillus subtilis Natto ...................................................................................... 32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 33 3.1. Sàng lọc chủng B. subtilis Natto có khả năng tổng hợp protease cao .......... 33 3.2. Khảo sát hoạt độ protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau ............................................................ 35 3.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 ........................................................................................ 37 3.3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất trong môi trường bán rắn lên khả năng tổng hợp protease ..................................................................................................... 37 3.3.2. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease ........................ 39 3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease ..... 41 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác protease của chủng B.subtilis Natto BN2.1 ......................................................................................... 43 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 45 4.1. Kết luận ......................................................................................................... 45 4.2. Kiến nghị ....................................................................................................... 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 46 PHỤ LỤC iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A. candidus Aspergillus candidus A.oryzae Aspergillus oryzae B. Bacillus B. subtilis Bacillus subtilis BDN Bã đậu nành CB Cám bắp CG Cám gạo CM Cám mì CFU Colony Foming Unit DX Đậu xanh kDa kiloDalton nKat nanoKatal OD Optical Density pI Điểm đẳng điện của protein P. roquerti Penicillium roqueforti UI Đơn vị hoạt độ SPSS Phần mềm xử lý thống kê (Statistical Package for the Social Science) TLPT Trọng lượng phân tử iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Kết quả phản ứng sinh hóa của chủng B. subtilis ................................... 8 Bảng 1.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt độ protease của chủng Bacillus licheniformis N-2 ................................................................................... 15 Bảng 1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen vô cơ lên hoạt độ protease của chủng Bacillus licheniformis N-2 ..................................................................... 16 Bảng 1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen hữu cơ lên hoạt độ protease của chủng Bacillus licheniformis N-2 ..................................................................... 17 Bảng 2.1. Danh sách các chủng nghiên cứu ............................................................ 22 Bảng 2.2. Dựng đường chuẩn Tyrosine ................................................................... 28 Bảng 2.3. Xác định lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu ........................... 29 Bảng 2.4. Thành phần khối lượng của các cơ chất trong môi trường bán rắn ........ 31 Bảng 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng B. subtilis Natto ..................................................................................... 34 Bảng 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng BN2.1 khi sử dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau ................................................................................. 35 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease ................................................................................................... 38 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease ......................... 40 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease ....... 41 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease .................. 43 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1. Sản phẩm Natto ....................................................................................... 6 Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis Natto.................................................. 7 Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide. ................................................... 10 Hình 1.4. Cấu trúc không gian enzyme protease ................................................... 11 Hình 3.1. Khả năng phân giải casein trên môi trường thạch đĩa của các chủng Bacillus subtilis Natto ........................................................................... 33 Biểu đồ 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng B. subtilis Natto. ............................................................................... 34 Biểu đồ 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 khi sử dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau. ........................................ 36 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease. ............................................................................................ 38 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease. ................... 40 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease. ....................................................................................... 42 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease. ........... 43 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Một trong số các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease và được ứng dụng nhiều là vi khuẩn thuộc chi Bacillus[40]. Bacillus subtilis Natto là một chủng vi khuẩn có ích, rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng có khả năng phát triển rất nhanh và sinh tổng hợp nhiều loại enzyme thủy phân như amylase, protease, phytase, hemicellulase, glucannase… Chủng vi khuẩn này đã được sử dụng trong món ăn truyền thống của Nhật Bản từ lâu. Khi ủ ấm với hạt đậu nành, chúng sẽ sản sinh ra enzyme nattokinase hoạt huyết mạnh, có khả năng phòng và chữa các bệnh chống viêm, ngừa bệnh tả[54]... Nhiều nghiên cứu về B. subtilis Natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra nhiều enzyme nhóm protease như nattokinase[33], elastase[32], bacillopeptidase F [45] … Chủng vi khuẩn này có thể đáp ứng nhu cầu lớn về protease của ngành chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản trong lĩnh vực chế biến thức ăn chăn nuôi, bổ sung men tiêu hóa, giúp vật nuôi nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh... Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn này tạo sản phẩm protease ở Việt Nam chưa nhiều. Do đó nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Natto”. Ý nghĩa đề tài nghiên cứu: - Về khoa học: Cung cấp thông tin về khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus subtilis Natto trên môi trường nuôi cấy bán rắn với thành phần là các phế phụ liệu của ngành nông nghiệp Việt Nam. - Về thực tiễn: Góp phần xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm giàu protease, giúp đa dạng hóa sản phẩm. 1
  11. Đồ án tốt nghiệp 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước Do có những ưu điểm vượt trội, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Natto vẫn luôn được quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới cũng như tại Việt Nam, một số công trình và ứng dụng tiêu biểu: - Đinh Thu Hương (2013) nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và chiết enzyme protease từ vi khuẩn B. subtilis Natto. Kết quả cho thấy, môi trường kết hợp có 2% maltose, 0,5% casein, CaCl2 0,05% giúp tăng tiết enzyme protease 21,7% so với môi trường canh thang , nồng độ amoni sulfat 60% bão hòa là nồng độ tối ưu để thu được tủa enzyme có hoạt độ protease cao nhất: 172,5 nKat. Sau khi tinh chế bằng phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75, lựa chọn được phân đoạn 10 là phân đoạn có hoạt độ protease cao nhất 27,2 nKat. Đã xác định được phân đoạn này có khả năng phân giải mạnh cơ chất fibrin và có trọng lượng phân tử khoảng 29 kDa nên có thể là enzyme nattokinase, hoạt độ enzyme khoảng 300 FU/5 ml [5]. - Junguo Liu và cộng sự (2005) nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh dưỡng cho sinh tổng hợp nattokinase sử dụng chủng B. subtilis Natto NLSSE. Kết quả nguồn carbon tốt nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu nành[27]. - LiHui Rong (2011) xác định môi trường tối ưu cho sản xuất nattokinase từ vi khuẩn B. subtilis Natto gồm: MgSO4 0,02%, K2HPO4 0,02%, KH2PO4 0,01%, CaCl2 0,05%, maltose 3%, pepton từ đậu nành: 3%[24]. - Ứng dụng khả năng làm tan và chống hình thành máu đông của chủng B. subtilis Natto vào các lọai thực phẩm chức năng trên thị trường Việt Nam như: Nattospes của Công ty TNHH dược phẩm Á Âu; Đậu tương Lên Men Natto Kinaza của công ty TNHH Khoa Học Xanh Đức Thanh Mai; DOSAKA của Công ty cổ phần xuất nhập khẩu y tế DOMESCO… 3. Mục tiêu nghiên cứu Chọn được chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease cao từ các chủng nghiên cứu. 2
  12. Đồ án tốt nghiệp Xác định một số điều kiện nuôi cấy bán rắn để chủng B. subtilis Natto sinh tổng hợp enzyme protease có hoạt tính cao nhất. Xác định ảnh hưởng của pH lên khả năng phản ứng protease của chủng B. subtilis Natto. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh protease cao. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis Natto khi được nuôi cấy trên môi trường bán rắn ở các điều kiện khác nhau như thành phần cơ chất, tỉ lệ cơ chất, độ ẩm và thời gian nuôi cấy. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng phản ứng protease của chủng Bacillus subtilis Natto. 5. Phương pháp nghiên cứu Thu thập thông tin từ sách báo và các trang mạng điện tử. Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0. Các phương pháp nghiên cứu thực hiện trong đề tài: - Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật. - Phương pháp tăng sinh. - Phương pháp xác định mật độ tế bào (Phương pháp đếm khuẩn lạc). - Phương pháp định tính khả năng tổng hợp protease. - Phương pháp nuôi cấy bán rắn. - Phương pháp thu nhận dịch chiết từ nuôi cấy bán rắn. - Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease (Phương pháp Anson). - Phương pháp tủa enzyme protease. 6. Kết quả đạt được Đề tài với mục đích nghiên cứu thu nhận protease từ chủng cho hoạt độ enzyme protease cao nhất trong năm chủng nghiên cứu là BN1, BN2.1, BN2.2, BN2.3 và BN3. Kết quả thí nghiệm cho thấy chủng Bacillus subtilis Natto BN2.1 có khả năng sinh tổng hợp protease cao hơn so với các chủng còn lại. Môi trường nuôi cấy thích 3
  13. Đồ án tốt nghiệp hợp cho hoạt độ protease tốt nhất là bã đậu nành và cám bắp. Với các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp protease cao của chủng BN2.1 như: tỉ lệ cơ chất bã đậu nành: cám bắp là 5:5, thời gian nuôi cấy là 60 giờ và độ ẩm môi trường ban đầu thích hợp nhất là 60%. Chế phẩm enzyme protease tinh sạch sơ bộ từ chủng Bacillus subtilis Natto BN2.1 có khả năng xúc tác tốt nhất tại pH 7. 7. Kết cấu đề tài nghiên cứu Đề tài nghiên cứu bao gồm 3 chương: Chương 1: TỔNG QUAN - Sơ lược về chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Natto và enzyme protease. - Giới thiệu ứng dụng và tình hình nghiên cứu, sản xuất enzyme protease trong và ngoài nước. Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU - Trình bày địa điểm, thời gian thí nghiệm, vật liệu thí nghiệm, môi trường nghiên cứu, các phương pháp tiến hành và các phương pháp nghiên cứu. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - Trình bày kết quả đạt được và nêu ý kiến thảo luận về đề tài nghiên cứu. Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - Nêu kết luận và kiến nghị của nhóm thực hiện đề tài. 4
  14. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis Natto 1.1.1. Hệ thống phân loại Bacillus subtilis Natto Giới Bacteria Ngành Firmicutes Lớp Bacilli Bộ Bacillales Họ Bacillaceae Giống Bacillus Loài subtilis Phân loài Bacillus subtilis Natto. “Nguồn: Keith H. Steinlraus (2004)” 1.1.2. Lịch sử phát hiện B. subtilis Natto được sử dụng trong sản xuất thương mại thực phẩm Natto của Nhật Bản. Chúng được tìm thấy bởi tiến sĩ Sawamura vào năm 1906 và được đặt tên là Bacillus Natto Sawamura. Kể từ đó B. subtilis Natto được chấp thuận để dùng cho việc nghiên cứu và sản xuất thuốc tác dụng lên hệ thần kinh vào năm 1968, thuốc thú y vào năm 1990, phụ gia dinh dưỡng vào năm 1996. Và hiện đang thu hút sự chú ý vì gần đây đã bắt đầu được sử dụng làm thực phẩm dành cho sức khỏe[55]. Khi mới được phát hiện ra, B. subtilis Natto được coi như là một loài vi sinh vật mới. Hiện nay, dựa trên kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B. subtilis của [28], [50] Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 , các khóa phân loại đã xếp B. subtilis Natto là một dòng thuộc loài B. subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác nhờ khả năng lên men tạo sản phẩm Natto [40]. Trong dòng B. subtilis Natto còn có nhiều loại [21] [47] như B. subtilis Natto B – 12 , B. subtilis Natto OK2 , B. subtilis Natto NRRL 3666 [39]… 5
  15. Đồ án tốt nghiệp Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản, những hạt đậu nành đã luộc chín và lên men với vi khuẩn B. subtilis Natto ở nhiệt độ khoảng 40oC trong vòng 14 - 18 giờ[25],[46]. Năm 1905, tiến sĩ Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã tách được hai loại vi khuẩn từ Natto gồm vi khuẩn B. subtilis Natto có vai trò lên men hạt đậu, gây ra mùi hương đặc biệt và vi khuẩn B. mesentericus vulgaris tạo chất chất nhớt đặc trưng và vị ngọt. Năm 1913, Sawamura công bố kết quả nghiên cứu của mình qua nhiều mẫu Natto và kết luận vi khuẩn chủ yếu trong các mẫu chính là B. subtilis Natto. Ông đã đưa ra mô tả chi tiết về đặc điểm vi khuẩn, enzyme và nhu cầu dinh dưỡng của nó. Ngày nay, các sản phẩm Natto trên thị trường được lên men với vi khuẩn B. subtilis Natto[46]. Hình 1.1. Sản phẩm Natto. (Nguồn: healthplus.vn) Chức năng của B. subtilis Natto[55]: - Tăng cường vi khuẩn có lợi. - Ức chế vi khuẩn đường ruột có hại. - Sản xuất các enzyme phân hủy protein và tinh bột - Xây dựng hệ thống vitamin nhóm B 6
  16. Đồ án tốt nghiệp 1.1.3. Phân bố B. subtilis Natto được giáo sư Sawamura tìm thấy trong Natto, một món ăn truyền thống có từ hàng ngàn năm trước của người Nhật. B. subtilis Natto có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô... và phát triển tốt trong các loại đậu, đặc biệt là đậu tương. Vi khuẩn này cũng phát triển trên thực phẩm có nguồn gốc động vật và thực vật khác như: tảo biển, cá, thịt, tôm, cua... [40]. 1.1.4. Đặc điểm của Bacillus subtilis Natto 1.1.4.1. Đặc điểm hình thái B. subtilis Natto là trực khuẩn hiếu khí bắt màu tím khi nhuộm Gram, nội bào tử hình que có kích thước dưới 1μm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành chuỗi. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, có kích thước lớn và hình dạng bất định. Bề mặt hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [22],[23]. Bào tử Tế bào vi khuẩn Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis Natto (độ phòng đại 100 lần). “Nguồn: Đinh Thu Hương (2013)[7]” 1.1.4.2. Đặc điểm sinh lý B. subtilis Natto là sinh vật hiếu khí bắt buộc, cần oxy để sinh trưởng và có thể phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn 3%. B. subtilis Natto phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (30 – 50oC), tối thích là 37oC. Ở 55oC, vi khuẩn ngừng phát triển và sự ly 7
  17. Đồ án tốt nghiệp giải tế bào sinh dưỡng diễn ra. Nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm của bào tử là 40oC, bào tử vẫn có thể nảy mầm sau khi bảo quản ở 0oC. B. subtilis Natto phát triển ở pH trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2 - 7,6. Sự nảy chồi và phát triển bị ức chế ở pH ≤ 4,5 [23]. 1.1.4.3. Đặc điểm sinh hoá B. subtilis Natto là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn hydratcarbon: đường đơn như glucose, fructose..., đường đôi như maltose, lactose, saccharose..., polysaccharid như tinh bột... Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn là protein và amino acid. B. subtilis Natto có thể sử dụng dễ dàng acid glutamic, arginin, acid aspartic... nhưng không sử dụng được threonin, tryptophan, phenylalanin và methionin [23]. Bảng 1.1. Kết quả phản ứng sinh hóa của chủng B. subtilis Phản ứng sinh hóa Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Tan chảy gelatin + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + 8
  18. Đồ án tốt nghiệp Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Theo Holt, 1992) 1.1.4.4. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis Natto Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B. subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp nhiều nhóm enzyme ngoại bào khác nhau như: Nhóm enzyme γ– transpeptidase theo Noda năm 1989[30] và Ogawa năm 1991[52]; amylase theo [31] [29] Yamane K năm 1974 ; phytase theo Kerovuo J năm 1998 , Shimizu M năm [36] [48] 1992 ; cellulase theo Sun Yan năm 2011 ; và nhóm enzyme được nghiên cứu nhiều nhất là protease [21],[ [33],[34],[50],[53]. Đặc điểm của một số protease ngoại bào của B. subtilis Natto như sau: o Nattokinase: là một enzyme thuộc họ subtilisin; tên khác: subtilisin NAT hay subtilisin BSP. Kí hiệu: EC 3.4.21.62. Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có 275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử. TLPT: 27,7 kDa đến [21],[33] 29 kDa . Nattokinase là protease ngoại bào có ý nghĩa nhất và đang được nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược học. o Elastase: Theo nghiên cứu của Sumi, elastase có TLPT: 20 kDa, pI = 8,7 [42]. Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8 kDa, pI = 8,5; ổn định hoạt tính trong khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 50oC; bị bất hoạt bởi diisopropyl fluorophosphat, phenyl methyl sulphonyl fluorid và ion kim loại [32]. o Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34 kDa. Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Ser, His, Asp[45]. o Protease serin: có TLPT khoảng 90 kDa; pH 10 và nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme là 55oC, pI = 3,9. Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Asp33, His81, Ser259 [49],[53]. 9
  19. Đồ án tốt nghiệp 1.2. Enzyme protease 1.2.1. Khái niệm về protease[1] Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO - NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự. Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide. “Nguồn: Đinh Thu Hương (2013)[7]” Nhóm enzym protease (peptit – hydrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein,“polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển amino acid. Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm phụ:  Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch polypeptit  Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của mạch polypeptit. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – peptidase.  Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit.  Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc 10
  20. Đồ án tốt nghiệp điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Hình 1.4. Cấu trúc không gian enzyme protease. “Nguồn: Tống Ngọc Triêm(2010)[16]” 1.2.2. Phân loại [9] Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp… các nhà khoa học đã phân loại các proteinase vi sinh vật thành bốn nhóm như sau: o Protease – xerin o Protease – thiol o Protease – kim loại o Protease – acid Một số tác giả khác chia protease ra ba nhóm dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm: o Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo. 11
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược