1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum và ứng dụng trong bảo quản thịt

Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum và ứng dụng trong bảo quản thịt

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính và bước đầu đánh giá hiệu quả bảo quản thịt heo của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01. Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỊT Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SI

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 111

Ngày tạo 10/10/2021 11:59:13 PM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 2.08 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đế... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỊT Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Phạm Khánh Hưng MSSV: 105111082 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
  2. LỜI CẢM ƠN Qua hơn 4 tháng thực hiện đề tài, em đã học hỏi được rất nhiều điều trong việc làm một người nghiên cứu khoa học, trong cách giao tiếp ứng xử hằng ngày, cách làm việc một mình cũng như trong tập thể. Tuy có những thành công và cũng không tránh khỏi những thất bại nhưng điều đó đã giúp em trưởng thành hơn rất nhiều. Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy Ths. Phạm Minh Nhựt. Chính sự quan tâm, động viên, chỉ bảo hướng dẫn tận tình của thầy đã giúp em rất nhiều trong bước đầu nghiên cứu khoa học. Những lời khuyên, kinh nghiêm của thầy không chỉ giúp em trong học tập, trong nghiêng cứu mà còn giúp em ngày càng hoàn thiện mình hơn trong cuộc sống. Em cảm ơn thầy! Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến chị Lê Ngọc Thùy Trang. Chính lòng nhiệt tình và sự tận tâm của chị đã giúp em hiểu nhiều hơn về công việc của một người làm nghiên cứu, cũng như là người động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đồ án. Em cảm ơn chị rất nhiều! Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy, cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, đặc biệt là thầy Ths. Huỳnh Văn Thành đã tạo điều kiện cho em nghiên cứu, giúp đỡ em trong quá trình làm đồ án tại phòng thí nghiệm. Em xin cảm ơn Hội đồng bảo về đồ án và quý thầy cô phản biện đã dành thời gian đọc, nhận xét và góp ý cho đồ án của em được hoàn chỉnh hơn. Cảm ơn tập thể lớp 10DSH1 đã luôn bên cạnh, giúp đỡ và động viên trong quá trình thực hiện đồ án cũng như trong suốt 4 năm học qua. Xin gửi lời cảm ơn đến hai em Nguyễn Thị Bích Thưởng và Nguyễn Thị Dung đã phụ giúp và động viên trong suốt quá trình làm đồ án. Đặc biệt, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, những người đã luôn sát cánh bên con, luôn quan tâm, ủng hộ, tạo điều kiện và động viên con trong suốt thời gian qua. Con xin chân thành cảm ơn mọi người!
  3. Tp, Hồ Chí Minh, ngày…, tháng…, năm 2014 Sinh viên Phạm Khánh Hưng
  4. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do tôi thực hiện. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong đồ án này chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Tp, Hồ Chí Minh, ngày…, tháng…, năm 2014 Sinh viên, Phạm Khánh Hưng
  5. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngày nay, hòa mình vào xu thế phát triển chung của xã hội, cuộc sống của con người ngày càng được nâng cao, nhu cầu càng ngày được cải thiện, trong đó nhu cầu ăn uống của con người cũng được nâng cao. Cũng từ đó, công tác bảo quản thực phẩm luôn là mối bận tâm của các nước trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Đặc biệt là các nhu cầu bảo quản các sản phẩm tươi sống tránh khỏi sự xâm nhiễm của các vi sinh vật gây bệnh cho người. Hiện nay, thực phẩm tiêu thụ trên thị trường đang được bảo quản bằng nhiều phương pháp khác nhau như: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học… trong đó, việc bảo quản bằng các chất hóa học được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên, do sự thiếu hiểu biết cũng như lạm dụng vì mục đích kinh tế, nhiều nơi đã sử dụng các hóa chất không được phép sử dụng hoặc dùng quá liều lượng quy định. Trong khi đó, các phương pháp vật lý thường không mang lại mùi vị, chất lượng như ban đầu, đồng thời trạng thái cũng có phần thay đổi và đòi hỏi quy trình cần nhiều thời gian. Các phương pháp bảo quản này còn rất nhiều hạn chế, đặc biệt bảo quản bằng phương pháp hóa học có thể làm ảnh hưởng dài lâu tới sức khỏe con người và môi trường. Nếu như những chất phụ gia thực phẩm có nguồn gốc hóa học có tác dụng bảo quản tốt, ngăn chặn sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây ảnh hưởng đến sức khỏe thì hướng nghiên cứu tìm đến những chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và đặc hiệu đối với từng loại vi sinh vật gây hại đang được quan tâm. Do đó, việc nghiên cứu tìm ra và sử dụng các chất có nguồn gốc sinh học để bảo quản các thực phẩm ngày được quan tâm phát triển. Và việc tìm ra bacteriocin là một bước ngoặt lớn trong bảo quản thực phẩm. Đây là những chất có nguồn gốc sinh học đã được cho phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm. Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cũng không xa lạ với chúng ta, đó là vi khuẩn lactic, những vi khuẩn này được con người chúng ta sử 1
  6. Đồ án tốt nghiệp dụng phổ biến trong thực phẩm từ hàng ngàn năm nay. Bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn có bản chất là các peptide được tổng hợp ở ribosome của vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương, có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác. Ngoài bacteriocin, các chủng LAB trong quá trình sinh trưởng và phát triển, LAB còn sản sinh ra môi trường một số hợp chất thứ cấp như các loại acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic, acid propionic, ethanol, CO2, H2O2… Nhờ giá trị đặc biệt của bacteriocin nói riêng và các hoạt chất có hoạt tính sinh học nói chung mà các chế phẩm bảo quản thực phẩm mang hoạt tính sinh học ngày càng được chú trọng phát triển và không ngừng khẳng định vị thế trên thị trường đem lại lợi ích ngày càng cao. Năm 2013, Lê Ngọc Thùy Trang thực hiện nghiên cứu “Phân lập và khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum” với mục tiêu chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh các hợp chất kháng khuẩn có tính đối kháng mạnh đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị từ các nguồn thực phẩm lên men truyền thống. Kết quả đã phân lập được chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01 từ sữa chua lên men truyền thống cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn rất cao, đồng thời xác định được thành phần môi trường MRS OPTSC01 là tối ưu cho sự sản sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01. Từ nghiên cứu này đã thu được dịch nuôi cấy L. plantarum SC01 có hoạt tính kháng khuẩn cao. Tuy nhiên, việc duy trì hoạt tính kháng khuẩn cũng như mức độ ứng dụng của dịch kháng khuẩn này vẫn chưa được xác định. Việc đánh giá hoạt tính cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của các hợp chất kháng khuẩn từ L. plantarum SC01 là điều hết sức cần thiết để có thể làm tiền đề cho các ứng dụng sau này. Với ý nghĩa thực tiễn và ý nghĩa khoa học như vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum và ứng dụng trong bảo thịt”. Nghiên cứu này hy vọng sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc tạo ra các chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học ứng dụng trong quá trình bảo quản thực 2
  7. Đồ án tốt nghiệp phẩm. Đề tài mang tính kế thừa và được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. 2. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính và bước đầu đánh giá hiệu quả bảo quản thịt heo của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01. 3. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01. - Đánh giá hiệu quả bảo quản thịt heo của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01. 4. Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu chỉ tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01 được phân lập bởi Lê Ngọc Thuỳ Trang (2013). - Đánh giá hiệu quả bảo quản của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01 đối với thịt heo. 3
  8. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan vi khuẩn lactic 1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 1.1.1.1. Lịch sử phát hiện và sự phân bố của vi khuẩn lactic Qua nhiều thế kỷ, các nhà khoa học trên thế giới đã phân lập và giải thích được quá trình sinh hóa của nhiều chủng vi khuẩn lactic. Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Carl Wilhemlm Scheele lần đầu tiên tách được acid lactic từ sữa bò lên men và gọi là “acid sữa” (Nguyễn Lân Dũng, 2002). Năm 1874, Blondeau mới công nhận acid lactic là sản phẩm cuối cùng của chuỗi phản ứng của quá trình lên men. Năm 1857, Louis Pasteur chứng minh được việc làm chua sữa là kết quả hoạt động của một nhóm vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn lactic. Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactic (nay còn gọi là Streptococcus lactic) (Nguyễn Thành Đạt, 2001). Từ đó đến nay, nhiều loại vi khuẩn lactic đã được phân lập và nghiên cứu. Công nghiệp lên men để sản xuất acid lactic có thể nói được bắt đầu từ năm 1881 (Nguyễn Lân Dũng, 2002). Ngày nay quá trình lên men lactic được ứng dụng ở quy mô lớn. Do đó, các chủng vi khuẩn lactic được sử dụng phải thuần và có hoạt tính sinh học cao. Trong đó, được sử dụng nhiều nhất là một số loài thuộc chi Lactobacillus và Streptococcus. Vi khuẩn lactic là tên gọi của những vi khuẩn sinh ra acid như là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hóa cacbon hydrat. Vi khuẩn lactic phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trên bề mặt rau, củ, quả, thịt, cá, tôm; trong phân, rác, xác động vật và thực vật; trên niêm mạc miệng và niêm mạc ruột của người, gia súc, gia cầm. Đặc biệt, trong sản các sản phẩm muối chua như dưa cà muối, tôm chua, sữa chua, nem chua… có rất nhiều vi 4
  9. Đồ án tốt nghiệp khuẩn lactic. Ngoài ra, có một số loài vi khuẩn lactic sống kí sinh trên thực vật, hút các chất tiết từ mô cây (Salmen và Deighton, 1998). Có thể nhắc đến một số loài trong các sản phẩm sau: - Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thường gặp L. bulgarius, L. helviticus, L. casei, L. ferment, L. brevis. Để tồn tại trong môi trường này vi khuẩn lactic phải tổng hợp được ATP từ cơ chất lactose. - Trên bề mặt thực vật, xác thực vật đang bị phân hủy và trên các loại rau quả, trái cây: L. plantarum, L. delnikii, L. ferment, L. brevis. - Trong ruột và các niêm dịch ở người và động vật có: L. acidophilus, S. faecalis, S. bovis, S. salivanius, S. pyogenes. 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái Các vi khuẩn lactic khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau. Ngoài ra hình dạng và kích thước của tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy và sự có mặt của oxi. - Giống Streptococcus có dạng tế bào hình tròn hoặc hình ovan đường kính khoảng 0,5 – 1,0 µm, sắp xếp riêng biệt, theo cặp đôi hoặc chuỗi dài. Hình 1.1. Tế bào Streptococcus - Giống Pediococcus có dạng cầu khuẩn, dạng bát cầu khuẩn hay tụ cầu khuẩn. 5
  10. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Tế bào Pediococcus - Giống Bifidobacterium có hình dạng biến đổi, đôi khi có hình que, có lúc lại có hình ovan. Hình 1.3. Tế bào Bifidobacterium - Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5 – 0,8 µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành đám tập trung. Hình 1.4. Tế bào Leuconostoc 6
  11. Đồ án tốt nghiệp - Giống Lactobacillus có hình que, hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn cho đến que dài (que ngắn khoảng 0,5 – 0,7 µm và que dài khoảng 3 – 8 µm). Các tế bào có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng lẻ, đây là loại vi khuẩn phổ biến nhất. Hình 1.5. Tế bào Lactobacillus 1.1.1.3. Đặc điểm sinh hóa Mặc dù không đồng nhất về hình thái nhưng vi khuẩn lactic tương đối thống nhất về một số đặc điểm sinh hóa như sau: Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae. Các chủng vi khuẩn thuộc nhóm này có đặc điểm sinh hóa khác nhau nhưng đặc tính sinh lý tương đối giống nhau. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương, thường không di động, không sinh bào tử. Đa số vi khuẩn lactic lên men được mono và disaccharide, một số không lên men được saccharose và một số khác không lên men được maltose. Một số vi khuẩn lactic không có khả năng lên men tinh bột và các polysaccharide khác (chỉ có loài L.delbruckii là đồng hóa được tinh bột). Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh, không chứa cytochrome, oxydase và catalase. Vi khuẩn lactic không có khả năng tổng hợp cytochrome và porphyrin (thành phần của chuỗi hô hấp), do đó chúng không thể tạo ra ATP. Các LAB chỉ có thể tạo ra ATP bằng quá trình lên men đường và nguồn năng lượng chính lấy từ nguồn 7
  12. Đồ án tốt nghiệp cacbon. Vi khuẩn lactic thích hợp phát triển trong điều kiện yếm khí, nhưng cũng có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí. Hai con đường lên men chính có thể phân biệt giữa các vi khuẩn lactic là con đường Embden – Meyerhoff – Parnas (EMP) và con đường Pentose phosphate. Con đường EMP tạo ra sản phẩm cuối cùng hầu như là acid lactic, trong khi đó con đường pentose phosphate tạo ra sản phẩm cuối cùng là acid lactic, khí CO2, ethanol, acetate… (Khalid, 2011). 1.1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp và không thể phát triển được trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucoza và NH4+. Vi khuẩn lactic cần vitamin, acid amin và nhiều chất khác cho quá trình sinh trưởng và phát triển. Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các đường đơn (glucose, fructose, manose), các đường đôi (saccarose, lactose, maltose) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin). Tuy nhiên, khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau còn tùy thuộc vào các vi khuẩn khác nhau. Nguồn cung cấp năng lượng quan trọng nhất với vi khuẩn lactic là monosaccarit và disaccarit trong việc cung cấp nguyên liệu xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các acid hữu cơ như acid lactic, acid malic, acid fumaric, acid acetic... (Tortora và Funke, 1992). Về nhu cầu nguồn nitơ, thì hầu hết các vi khuẩn lactic đều không tự tổng hợp được các hợp chất nitơ hữu cơ phức tạp. Do đó, để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn lactic phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ có một số ít loài có khả năng tự tổng hợp từ nguồn nitơ vô cơ. Căn cứ vào nhu cầu dinh dưỡng nitơ có thể chia vi khuẩn lactic thành 3 nhóm (Lê Thị Châu và Tạ Kim Chính, 1994): - Nhóm cần phức hợp các acid amin. - Nhóm phát triển tốt trên môi trường chỉ có cistein và muối amon. - Nhóm phát triển tốt trên môi trường chỉ có muối amon là nguồn nitơ duy nhất. 8
  13. Đồ án tốt nghiệp Nguồn nitơ phổ biến là hỗn hợp acid amin, cao thịt, cao nấm men, pepton, peptit, cazein... Đối với nguồn vitamin có vai trò đồng xúc tác trong nhiều phản ứng. Các vi khuẩn đặc biệt là Lactobacillus rất cần vitanim cho sự phát triển vì vitamin đóng vai trò coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào. Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp được vitamin. Vitamin thường được bổ sung vào môi trường bằng các chất chứa vitamin như nước khoai tây, ngô, cà rốt, cà chua, cao nấm men... Vi khuẩn lactic cần hàng loạt các vitamin như: lactoflavin, thiamin, acid pantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin... Các acid nicotinic và acid pantotenic đặc biệt cần cho sự phát triển của tất cả các vi khuẩn lactic (Vũ Hồng Thắng, 1998). Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic chịu ảnh hưởng bởi thành phần, nhiệt độ, độ pH, nồng độ CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử trong môi trường nuôi cấy. Đối với các hợp chất hữu cơ, vi khuẩn lactic có nhu cầu rất lớn vì chúng có ảnh hưởng mạnh đến sự phát triển hoặc kích thích sự phát triển của các vi khuẩn này. Các hợp chất hữu cơ thường tồn tại dưới các dạng: - Các bazơ nitơ: adenin, hypoxanthine, guanin, uraxin, thiamin, thimidin... - Các chất amin: L – asparagin, L – glutamin... - Các acid hữu cơ: acid acetic, acid citric, acid oleic. Protein chưa thủy phân cũng cần cho vi khuẩn lactic. Chúng vừa có vai trò cung cấp acid amin, vừa kích thích sự phát triển của tế bào hiệu quả hơn so với các acid amin tự do. Trong thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập các vi khuẩn lactic người ta thường thấy có mặt citrate và Tween 80 với vai trò chất dinh dưỡng, acetat với vai trò là chất đệm. Bên cạnh đó, Tween 80 (một dẫn xuất của acid oleic) còn có hoạt tính bề mặt giúp vi khuẩn sinh trưởng và khuếch tán đồng đều trong dung dịch. Các chất khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, đặc biệt là magiê và mangan rất cần cho sự phát triển bình thường của các vi khuẩn lactic. Trong đó, mangan có vai trò ngăn cản sự tự phân của tế bào, giải độc cho tế bào khi có mặt oxy và tham gia duy trì sự ổn định của riboxom. Mangan và magiê còn là 9
  14. Đồ án tốt nghiệp yếu tố cấu trúc và hoạt động của các emzyme. Magiê còn có tác dụng làm tăng khả năng hấp thu đường của vi khuẩn lactic. Phức hợp các chất khoáng còn có tác dụng làm giảm độ acid trong môi trường nuôi cấy của các vi khuẩn lactic (Trần Thanh Thủy, 2003). 1.1.3. Cơ chế trao đổi chất của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic có khả năng phân giải carbohydrat để tạo ra acid lactic. Tùy theo cách phân giải đường, vi khuẩn lactic được chia thành 2 nhóm: vi khuẩn lên men đồng hình và vi khuẩn lên men dị hình. Lên men lactic là quá trình chuyển hóa sinh học kị khí đường thành acid lactic và một số sản phẩm khác với sự tham gia của vi khuẩn lactic (Nguyễn Lân Dũng, 2002). Tùy từng loài, từng nhóm vi khuẩn lactic khác nhau mà quá trình lên men lactic xảy ra theo phương thức đồng hình hay dị hình hoặc kết hợp cả hai phương thức trên. 1.1.3.1. Lên men lactic đồng hình Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men cho sản phẩm chính là acid lactic (90 – 98%) và một lượng nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl… Vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMB (Embden – Meyerhof – Parnas). Mặc dù chỉ tạo thành 2 ATP khi phân giải 1 phân tử glucose thành 2 phân tử acid lactic nhưng các vi khuẩn này lại có ý nghĩa lớn trong công nghiệp thực phẩm. Phương trình tóm tắt: Vi khu ẩn lactic C6H6O6 + 2ADP + 2Pv 2CH3-CHOH-COOH + 2ATP Lên men đồng hình 10
  15. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6. Sơ đồ chuyển hóa năng lượng lên men lactic đồng hình Các vi khuẩn lactic đồng hình thường gặp: Lactobacillus cremoris, L. acidophilus, L. plantarum, L. bulgaricus, L .casei, Streptococus, S. cremoris, S. thermophilus (Nguyễn Lân Dũng, 2002). 1.1.3.2. Lên men lactic dị hình Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài sản phẩm acid lactic thì chúng còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như acid acetic, etanol, acid xucxinic, CO2… Thông thường, 50% đường được chuyển hóa thành các sản phẩm phụ này (Jong Won Jun, Sun Chul Kang và Seung Koo, 1997). Phương trình tóm tắt: 2C6H6O6 2C3H6O3 + C2H4O2 + C2H5OH + C4H6O4 + CO2 + Q Trong đó, tỷ lệ các sản phẩm tạo ra là: acid lactic 40%, acid cucinic và etanol 20%, acid acetic 10%, các chất khí còn lại 20%. Quá trình lên men dị hình diễn ra theo tru chình PP (Pentose - photphat). Nguyên nhân do thiếu 2 enzyme chủ yếu của con đường EMP là aldolase và trizophotphat – isomeraza nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải diễn ra theo con đường PP. Sau đó, quá trình chuyển hóa từ trizophotphat thành acid lactic xảy ra tương tự như lên men đồng hình. Sản phẩm sinh ra phụ thuộc vào giống vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng và ngoại cảnh (Phạm Ngọc Lan và ctv, 1999). 11
  16. Đồ án tốt nghiệp Các vi khuẩn lên men lactic dị hình thường gặp: Leuconostoc mesenteroides, L. oenos, L. cremoris, Lactobacillus brevis, L. fermentum, Bifidobacterium bifidum. Lên men lactic dị hình bởi Bifidobacterium đặc biệt ở chỗ không tạo ra CO2 như sự lên men lactic dị hình thông thường. Hình 1.7. Sơ đồ chuyển hóa năng lượng lên men lactic dị hình 1.2. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum 1.2.1. Phân loại Theo Orla – Jensen (1919) và Bergey (1923) vi khuẩn Lactobacillus plantarum thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Chi: Lactobacillus Loài: Lactobacillus plantarum 12
  17. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2. Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus plantarum L. plantarum là vi khuẩn gram dương, có hình que, kích thước tế bào từ 0,7 – 1,0 µm đến 3,0 – 8,0 µm. Chúng có hệ gen lớn nhất trong tất cả các vi khuẩn lactic và đã được giải mã hoàn toàn. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C và có khả năng chịu nồng độ NaCl 5,5 %. Lactobacillus spp được phân chia thành 3 nhóm chính tùy thuộc vào khả năng lên men. - Nhóm I chỉ lên men hexose duy nhất thành axid lactic và không thể lên men gluconate hay pentoses. - Nhóm II vừa có thể lên men hexose thành axid lactic, vừa có thể lên men gluconate hay pentose. - Nhóm III lên men hexose thành axid lactic, axid axetic, ethanol và CO2. Là vi khuẩn không gây bệnh, tồn tại trong tuyến nước bọt và đường tiêu hóa của con người. L. plantarum là một trong những vi khuẩn lactic được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm như sữa chua, phô mai, kim chi, dưa cải… L. plantarum có khả năng lên men được nhiều nguồn carbohydrate, được dùng như một probiotic và có nhiều ứng dụng ngày càng phổ biến. L. plantarum có khả năng dị hóa arginine sinh ra nitrite ocid. Chúng không có khả năng phân giải amino acid ngoại trừ tyrosine và arginine. Có đến 6 con đường khác nhau chuyển hóa arginin, đều sinh ra nitric ocid. Việc sinh ra NO giúp ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh như Candida albicans, E. coli, Shigella, Helicobacter pylory, các amip và kí sinh trùng (Phạm Thị Nga, 2011). L. plantarum là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi chịu oxy. Khi có oxy, L. plantarum có thể chuyển oxygen thành hydrogen peroxide. Khi không có oxy, L. plantarum sẽ lên men và biến đổi đường thành acid lactic, ethanol (quá trình lên men dị hình). L. plantarum cần mangan cho sự tăng trưởng. Mangan giúp cho L. plantarum chống lại độc tính của oxy bằng cách giảm các gốc hydrogen peroxide như H2O2. H2O2 được tạo ra sau đó có thể được chuyển đổi thành O2 và nước bởi manganese cofactored pseudocatalase (Kono và Fridovich, 1983). 13
  18. Đồ án tốt nghiệp L. plantarum có khả năng chịu được pH thấp, có khả năng sống trong các điều kiện acid của dạ dày người và chịu được tác động của acid mật trong ruột non. Kí sinh trong đường tiêu hóa bằng cách gắn vào niêm mạc và đại tràng, có ảnh hưởng tích cực đến tế bào vật chủ. L. plantarum có trong các thực phẩm lên men, đặc biệt là trong thực phẩm lên men từ nguyên liệu thực vật như trong ôliu, bạch quả, bắp cải, dưa chuột và sắn (Molin, 2010). 1.2.3. Khả năng sản sinh các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum Cũng như các chủng LAB khác, L. plantarum đều trải qua quá trình lên men lactic. Trong quá trình lên men lacti đồng hình và dị hình, lượng acid lactic tạo ra chiếm khá lớn, chỉ một lượng nhỏ pyruvate bị khử carbon tạo thành acid acetic, ethanol, CO2… Acid hữu cơ được sản xuất trong quá trình lên men như acid lactic, acid acetic và acid propionic tạo môi trường không thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh và hư hỏng thực phẩm. Ngoài các acid hữu cơ, các hợp chất kháng khuẩn khác như ethanol từ con đường lên men dị hình, H2O2 được tạo ra trong quá trình tăng trưởng hiếu khí và diacetyl được hình thành từ sự phân hủy pyruvate. Plantaricin là một hợp chất kháng khuẩn được sản xuất từ L. plantarum, plantaricin có bản chất là polypeptide nên chúng sinh tổng hợp theo cơ chế sinh tổng hợp protein nhờ ribosome. Trong tế bào L. plantarum có mang các gene mã hóa cho các protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp plantaricins. Qua quá trình phiên mã, dịch mã sẽ tạo ra các protein và đi vào các giai đoạn khác tạo ra plantaricins hoàn chỉnh sau đó được giải phóng khỏi tế bào vi khuẩn. 1.3. Một số hợp chất kháng khuẩn do vi khuẩn L. plantarum sản sinh ra 1.3.1. Plantaricin Đến nay, theo các nhà nghiêng cứu thì L. plantarum sản xuất ra ít nhất 6 bacteriocins khác biệt. Tất cả các peptide này chủ yếu được tổng hợp từ các tiền chất có chứa glycine. L. plantarum tổng hợp các bacteriocins thông qua các gen PlnE và PlnF. Các peptide này sau đó được xử lý bởi các protein PlnG và 14
  19. Đồ án tốt nghiệp PlnH. Pheromone peptide của hệ thống này được mã hóa bởi một gen riêng biệt (PlnA) và phát hiện bởi protein histidine kinase PlnB bằng cách phosphoryl hóa hai vùng điều hòa PlnC và PlnD. Plantaricins là hợp chất được sản xuất bởi L. plantarum chúng ức chế một loạt các LAB bao gồm cả các vi khuẩn cạnh tranh với L. plantarum và các vi khuẩn khác như Pediococcus, Carnobacteria, Clostiridia và Propionobacteria. Plantaricins JK, EF: các bacteriocins hoạt động hổ trợ lẫn nhau. Chúng gồm 30 hoặc 40 gốc tự do trong một đoạn và biểu hiện thành nhiều chuỗi nối tiếp tương tự nhau tạo thành những hợp chất plantaricin khác nhau. Các bacteriocins hoạt động với tính đặc hiệu và kết hợp chặt chẽ. Plantaricin JK và EF có thể hoạt động riêng lẻ hoặc chúng có thể liên hiệp khi hoạt động cùng nhau một cách rất hiệu quả. Plantaricin S và Plantaricin W: Plantaricin S là một hệ thống hai gồm peptide phân lập từ L. plantarum được sử dụng để lên men ô liu xanh. Các gen cấu trúc chỉ ra rằng mỗi peptide ban đầu được sản xuất dựa trên một gốc có chứa glycine motif đôi. Các peptide này gồm 26 và 27 gốc tự do amino. Plantaricin S được coi là kiểm soát quá trình lên men và bảo quản ô liu. Một bacteriocin gồm hai peptide khác là plantaricin W bao gồm các phân tử protein Plwa và Plwb. Các thành phần lantibiotic bao gồm 29 và 32 đơn vị amino acid được sắp xếp theo trình tự (Zacharof và Lovitt, 2012). 1.3.2. Các hợp chất kháng khuẩn khác Các acid hữu cơ được sinh ra trong quá trình trao đổi chất bởi vi khuẩn L. plantarum chủ yếu là acid lactic và acetic, các acid này góp phần giảm pH ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn có hại như vi khuẩn E. coli, Salmonella, S. aureus… Do nội bào vi khuẩn có pH = 7 nên khi có sự chênh lệch pH so với môi trường acid bên ngoài, H+ từ môi trường sẽ đi vào bên trong tế bào vi khuẩn làm pH nội bào giảm. Vi khuẩn phải sử dụng cơ chế bơm ATPase để đẩy H+ ra khỏi tế bào làm cho vi khuẩn bị mất năng lượng. Mặt khác pH giảm thì cũng ức chế quá trình đường phân làm tế bào vi khuẩn cạn kiệt năng lượng dẫn đến bị tiêu diệt. Ngoài ra, các 15
  20. Đồ án tốt nghiệp anion của acid còn gây rối loạn sự thẩm thấu của màng tế bào làm gây bệnh bị ức chế sinh trưởng hoặc có thể chết. Ngoài các acid hữu cơ, các hợp chất kháng khuẩn khác như ethanol từ con đường lên men dị hình, hydrogen peroxide được tạo ra trong quá trình tăng trưởng hiếu khí của L. plantarum. Hydrogen peroxide tạo các chất oxy hóa mạnh có tác động diệt vi khuẩn gram âm và tác động kìm hãm các vi khuẩn gram dương phát triển. Một số vi khuẩn như Streptococcus và Lactobacillus sẽ bị ức chế tạm thời, các vi khuẩn gây bênh như Escherichia coli, Salmonella và Pseudomonas spp có thể bị tiêu diệt. 1.4. Bacteriocin và quá trình thu nhận, tách chiết, tinh sạch các hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn lactic 1.4.1. Hợp chất bacteriocin Bacteriocin được Gratia tìm thấy đầu tiên vào năm 1925 trong quá trình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn. Kết quả của công trình này đã thúc đẩy sự phát triển những nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn. Gratia gọi chất phát hiện ra đầu tiên là Colicin vì nó có khả năng tiêu diệt vi khuẩn E. coli. Bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn có bản chất là các peptid được tổng hợp ở riboxom của vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương. Bacteriocin có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác. Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng không có hoạt tính kháng sinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kìm hãm mà không trực tiếp làm chết vi sinh vật. Bacteriocin được tổng hợp khi vi khuẩn gặp các điều kiện ức chế - tác động của môi trường sống, cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng, không gian sống…Các bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thậm chí ở nồng độ rất thấp. Đặc tính diệt khuẩn cao hơn ở pH thấp, tương đối bền ở nhiệt độ cao và không bị ảnh hưởng bởi các dung môi hữu cơ. Các enzyme thuỷ phân protein có điện tích âm có thể thuỷ phân các peptid này dẫn đến sự mất hoạt tính. Do có bản chất protein nên 16
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược