1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn trắng Bemisia tabaci và rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces lilacinus

Đồ án tốt nghiệp: Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn trắng Bemisia tabaci và rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces lilacinus

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định khả năng gây chết bọ phấn trắng Bemisia tabaci và rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces lilacinus để làm cơ sở ứng dụng chúng trong phòng trừ các đối tượng này. Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY CHẾT BỌ PHẤN TRẮNG BEMISIA TABACI VÀ RỆP APHIS GOSSYPII CỦA NẤM PAECILOMYCES LILACINUS Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC G

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 130

Ngày tạo 10/11/2021 12:10:03 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 3.62 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Đánh giá khả năng gây chết bọ ph... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY CHẾT BỌ PHẤN TRẮNG BEMISIA TABACI VÀ RỆP APHIS GOSSYPII CỦA NẤM PAECILOMYCES LILACINUS Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ XUÂN HƯƠNG MSSV: 1151110153 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả trong Đồ án là trung thực. Mọi thông tin trích dẫn trong Đồ án đều được ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Xuân Hương
  3. LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn thành tốt khóa học 2011 – 2015. Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến những thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học, Thực phẩm và Môi trường đã giảng dạy em trong bốn năm qua, những kiến thức mà em nhận được trên giảng đường đại học sẽ là hành trang giúp em vững bước trong tương lai. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Thị Hai người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Huỳnh Văn Thành, cán bộ phòng thí nghiệm Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để em có thể hoàn thành tốt đồ án. Em xin cảm ơn các anh chị phòng vi sinh Khu Nông Nghiệp Công Nghệ Cao TPHCM đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đồ án. Và em cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn trong phòng thí nghiệm vi sinh, đặc biệt là bạn Huỳnh Thị Ngọc Trâm đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ cùng em trải qua những khó khăn trong quá trình thực hiện đồ án. Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đặc biệt là ba mẹ đã luôn bên cạnh, cổ vũ, động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để con có thể hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Xuân Hương
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC .................................................................................................................. i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.................................................................................. iv DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................v DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................................... vi LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ......................................................................................3 1. 1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces .................................................3 1.1.1. Phân loại khoa học ....................................................................................3 1.1.2. Đặc điểm sinh thái.....................................................................................4 1.1.3. Đặc điểm hình thái ....................................................................................4 1.1.4. Độc tố của nấm Paecilomyces spp. ...........................................................6 1.1.5. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp. đối với ký chủ ..7 1.2. Các chủng nấm Paecilomyces đã được phân lập ........................................9 1.3. Một số thành tựu và ứng dụng của nấm Paecilomyces spp. vào thực tiễn đời sống. ...............................................................................................................13 1.3.1. Sản xuất enzyme .....................................................................................14 1.3.2. Sản xuất kháng sinh và hợp chất thứ cấp ................................................15 1.3.3. Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật ...............................................................16 1.3.4. Xứ lý môi trường.....................................................................................16 1.4. Một số sản phẩm của Paecilomyces spp. ....................................................17 1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. .....17 1.6. Các nghiên cứu về sử dụng Paecilomyces spp. trong phòng trừ bọ phấn và các côn trùng chích hút khác. .......................................................................19 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.6.1. Tổng quan về bọ phấn trắng ....................................................................19 1.6.2. Tổng quan về rệp.....................................................................................25 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................30 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..............................................................30 2.2. Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu ....................................................30 2.2.1. Thiết bị - hóa chất ...................................................................................30 2.2.2. Vật liệu ....................................................................................................31 2.2.3. Các môi trường sử dụng ..........................................................................31 2.3. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................34 2.3.1. Phân lập nấm Paecilomyces lilacinus .....................................................34 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. .............................................................................37 2.3.3. Định tính khả năng sinh enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus. ............................................................................................................41 2.3.4. Đánh giá khả năng gây chết của bọ phấn và rệp của nấm Paecilomyces lilacinus. ............................................................................................................41 2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. .....................................................................................43 2.4 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................47 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................48 3.1. Phân lập nấm Paecilomyces lilacinus .........................................................48 3.2. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. ................................................................................51 3.2.1. Khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus trên môi trường thạch. ..............................................................................................51 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 3.2.2. Hoạt tính Chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. ............................53 3.3. Khả năng tổng hợp enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus. ..55 3.4. Đánh giá khả năng gây chết côn trùng chích hút của nấm Paecilomyces lilacinus.................................................................................................................58 3.4.1. Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn Bemisia tabaci của nấm Paecilomyces lilacinus ......................................................................................58 3.4.2 Đánh giá khả năng gây chết rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces lilacinus. ............................................................................................................60 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. ................................................................................62 3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus .............................................................................................................62 3.5.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. ..............................................................65 3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm Paecilomyces lilacinus. .....................................................................................68 3.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. .....................................................................................70 3.5.5. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. .....................................................................................72 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..............................................................75 4.1. Kết luận .........................................................................................................75 4.2. Đề nghị...........................................................................................................75 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................76 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CZ: Czapeck - Dox ĐC: Đối chứng MA: Malt NT: Nghiệm thức PDA: Potato D - Glucose Agar SA: Sabouraud + KC iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng nấm Paecilomyces lilacinus phân lập lại sau khi lây nhiễm trên bọ phấn. ...........................................................................49 Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. ..51 Bảng 3.3 Hoạt tính của enzyme chitinase sau 1,2,3,4,5 ngày nuôi cấy....................54 Bảng 3.4 Khả năng tổng hợp enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus ....56 Bảng 3.5 Số bọ phấn Bemisia tabaci chết ở các ngày sau chủng. ............................58 Bảng 3.6 Hiệu lực diệt bọ phấn của nấm Paecilomyces lilacinus ............................59 Bảng 3.7 Số rệp Aphis gossypii chết ở các ngày sau chủng .....................................61 Bảng 3.8 Hiệu lực diệt rệp của nấm Pacilomyces lilacinus .....................................61 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. ....................................................................................................................64 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển đường kính nấm Paecilomyces lilacinus qua các ngày. .......................................................................66 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển đường kính của Paecilomyces lilacinus ..............................................................................................68 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến sự phát triển đường kính của Paecilomyces lilacinus. .............................................................................................71 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển nấm Paecilomyces lilacinus. .............................................................................................73 Bảng 3.14 Tỷ lệ ức chế nấm Paecilomyces lilacinus của một số loại thuốc hóa học. ...................................................................................................................................73 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Đặc điểm đại thể của Paecilomyces spp. .....................................................5 Hình 1.2 Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp. ......................................................6 Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin. ....................................................7 Hình 1.4 Cành bào đài, thể bình, và bào tử của nấm Paecilomyces variotii ............10 Hình 1.5 Cành bào đài, thể bình, và bào tử của nấm Paecilomyces lilacinus ..........12 Hình 1.6 Cành bào đài, bào tử của nấm Paecilomyces fumosoroseus .....................12 Hình 1.7 Cành bào đài, bào tử nấm Paecilomyces amoeneroseus ...........................13 Hình 1.8 Các giai đoạn trong vòng đời của bọ phấn trắng .......................................20 Hình 1.9 Cấu tạo ngoài của rệp ................................................................................25 Hình 1.10 Cấu tạo ngoài của rệp ..............................................................................26 Hình 2.1 Hộp dùng để bố trí thí nghiệm…………………………………………...35 Hình 2.2 Các hộp dùng để đựng rệp bố trí thí nghiệm .............................................42 Hình 3. 1 Nấm phân lập lại từ bọ phấn Bemisia tabaci……………………………48 Hình 3.2 Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus (a, b, c, d là vòng phân giải chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus qua 1, 2, 3, 4 NSC) ..........................................................................................................................52 Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus qua 1,2,3,4 NSC ..................................................................52 Hình 3. 4 Hoạt độ enzyme chitinase sau các ngày nuôi cấy ....................................54 Hình 3.5 Sự phân giải casein của nấm Paecilomyces lilacinus (a, b, c, d là vòng phân giải protease của nấm Paecilomyces lilacinus qua 1, 2, 3, 4 ngày). ................56 Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện sự phân giải casein của nấm Paecilomyces lilacinus qua 1,2,3,4 ngày nuôi cấy ................................................................................................57 Hình 3.7 Mẫu bọ phấn không bị kí sinh (a) và mẫu bọ phấn bị kí sinh (b) được soi bằng kính lúp soi nổi .................................................................................................59 Hình 3. 8 Mẫu bọ phấn không bị ký sinh được soi bằng kính hiển vi quang học ....60 Hình 3. 9 Mẫu rệp không bị ký sinh được soi bằng kính hiển vi quang học ...........62 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10 Sự phát triển của Paecilomyces lilacinus trên môi trường có pH khác nhau ở 14 NSC (a: pH5, b: pH6, c: pH7, d: pH8) .....................................................63 Hình 3.11 Đường kính nấm Paecilomyces lilacinus ở các pH môi trường 5, 6, 7, 8 qua các ngày nuôi cấy. ..............................................................................................64 Hình 3.12 Nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 NSC ...................................65 Hình 3.13 Nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 sau khi cấy .........................66 Hình 3.14 Tản nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 sau nuôi cấy .................68 Hình 3.15 Sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau...................................................................................................................69 Hình 3.16 Tản nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 NSC .............................70 Hình 3.17 Sự phát triển đường kính của nấm Paecilomyces lilacinus dưới nguồn Cacbon khác nhau .....................................................................................................71 Hình 3.18 Nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 sau khi cấy .........................72 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Rau là loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn của người Việt Nam. Đặc biệt là các loại rau ăn quả họ cà như: cà chua, ớt, cà tím…lại càng được ưa chuộng vì chứa nhiều dinh dưỡng. Tại thành phố Hồ Chí Minh, diện tích trồng các cây ăn quả dài ngày như cà chua, ớt, cà tím… chiếm 8- 17% tổng diện tích trồng rau (Nguồn: Sở Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, 2013). Theo Chi cục Bảo vệ Thực vật thành phố, đây là các loại cây ký chủ chính của bọ phấn trắng. Nguyễn Đỗ Hoàng Việt (2009) cho biết, bọ phấn trắng Bemisia tabaci xuất hiện rất sớm (chỉ 7 ngày sau khi trồng) và gây hại nặng cho cây cà pháo ở Tây Ninh. Tại các tỉnh ở miền Bắc Việt Nam, bọ phấn trắng xuất hiện và gây hại cho sản xuất cà chua. Quan trọng hơn nữa, bọ phấn trắng là vecto duy nhất truyền virus gây bệnh xoăn vàng ngọn cà chua (Nguyễn Thơ, 1984; Ngô Bích Hào, Hà Viết Cường, 2010) với tỷ lệ phát bệnh từ 40-100%. Ngoài cây cà chua, virus còn lây nhiễm trên cây ớt cay, thuốc lá...Bọ phấn là loài đa thực nên số lượng phát triển quanh năm trên đồng ruộng và việc phòng trừ bọ phấn truyền bệnh gặp nhiều khó khăn. Tương tự như bọ phấn trắng, rệp Aphis gossypii là côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất trên thế giới. Rệp gây hại trực tiếp và truyền bệnh virus cho nhiều loại cây trồng. Biện pháp phòng trừ các loài sâu chích hút này hiện nay chủ yếu là dùng thuốc hóa học. Tuy nhiên, thuốc hóa học có độc tính rất cao, khó phân hủy trong điều kiện bình thường, sẽ tích tụ lại trong đất, nước, không khí và các sản phẩm nông nghiệp, làm ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của con người, và sinh vật có ích, gây hiện tượng kháng thuốc dẫn tới nguy cơ bùng phát dịch hại trên nhiều loại cây trồng. Trong số các tác nhân sinh học, nấm Paecilomyces spp. đang được quan tâm vì hiệu quả kí sinh cao đối với các loài côn trùng chích hút. Nhiều nước trên thế giới đã sản xuất sử dụng thành công nhiều loại chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ nấm Paecilomyces spp. để phòng trừ nhiều loại sâu hại cây trồng. Tuy nhiên, ở Việt 1
  12. Đồ án tốt nghiệp Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về loài nấm có ích này vẫn còn khá hạn chế. Với những lý do trên sinh viên chọn đề tài: “Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn trắng Bemisia tabaci và rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces lilacinus.” 2. Mục đích nghiên cứu Xác định khả năng gây chết bọ phấn trắng Bemisia tabaci và rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces lilacinus để làm cơ sở ứng dụng chúng trong phòng trừ các đối tượng này. 3. Nội dung nghiên cứu  Phân lập lại nấm Paecilomyces lilacinus trên bọ phấn trắng Bemisia tabaci.  Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của nấm Paecilomyces lilacinus.  Đánh giá khả năng ký sinh bọ phấn Bemisia tabaci và rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces lilacinus.  Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus.  Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. 2
  13. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1. 1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces 1.1.1. Phân loại khoa học Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Paecilomyces Chi Paecilomyces do Bainier mô tả vào 1907, sau đó được nhiều tác giả chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới. Chuyên luận về chi nấm này của Samson (1974) chấp nhận 16 loài đã mô tả, đồng thời tổ hợp mới 9 loài và đề nghị 6 loài mới, tất cả tập hợp trong 2 nhóm loài. Nhóm loài thứ nhất là nhóm loài Paecilomyces có các giai đoạn bào tử túi thuộc các chi Byssochlamys Westling, Talaromyces C.R.Benjamin và Thermoascus Miehe, gồm các loài ưa nhiệt ôn hòa (mesophile), chịu nhiệt và ưa nhiệt, có khuẩn lạc màu nâu vàng hay các màu nâu khác. Nhóm loài thứ hai là nhóm loài Isarioides gồm các loài không có giai đoạn bào tử túi, ưa nhiệt ôn hòa và có khuẩn lạc màu tím hồng, màu lục và màu vàng. Nhiều loài trong nhóm hai này kí sinh gây bệnh côn trùng (Samson R.A.,1974). Đến năm 2004, dựa trên các kỹ thuật phương tiện hiện đại các loài trong chi Paecilomyces được Samson R.A. hệ thống lại với 26 loài. Năm 2005 nhóm tác giả Liang Z.Q., Y.F., Chu, H.L. và Liu, A. Y. đã tiến hành đề tra và thu thập các nguồn nấm Paecilomyces tại Trung Quốc. Kết quả điều tra thu thập đã phát hiện ra một số loài mới như Paecilomyces cylindricosporus sp. nov, Paecilomyces gunnii Z. Q. Liang, v.v. Các loài này được thu thập từ đất và xác côn trùng bị nấm ký sinh tại vùng cao của tỉnh Hồ Bắc. Cùng với các loài đã được ghi nhận trước đó, nhóm tác giả đã xây dựng khóa định loại của 28 loài trong chi Paecilomyces thu thập tại Trung Quốc. 3
  14. Đồ án tốt nghiệp 1.1.2. Đặc điểm sinh thái Nấm Paecilomyces spp. sinh sống trong đất, trong xác bã thực vật, trong thức ăn, giấy…Một số loài được phân lập trên côn trùng ngủ nghỉ trong đất (theo trích dẫn Trần Ngọc Mai,2009). Trên thế giới có rất nhiều loài, có phổ ký sinh côn trùng rộng, cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Nấm Paecilomyces spp. dễ dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ, và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thực vật. Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên. Chi Paecilomyces có nhiều loài nhưng chủ yếu là hai loài Paecilomyces lilacinus và Paecilomyce variotii. Một vài loài Paecilomyces spp. có khả năng chịu nhiệt như: nhiệt độ tối ưu của Paecilomyces fulvus là 450C, Paecilomyces crustaceous là dưới 550C (Samson, 1974). Hai loài nấm chịu nhiệt trên có khả năng làm hư hỏng thực phẩm nhưng cũng là loài quan trọng ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các enzyme chịu nhiệt. Những nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều loài Paecilomyces đem lại nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích (Liang et al., 2003) . Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như:  Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết côn trùng.  Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất.  Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, côn trùng.  Paecilomyces lilacinus phân lập được từ xác bã hữu cơ, trứng tuyến trùng và đôi khi còn ở côn trùng chết, rừng cao su. (Crop Protection Compennium, 2002). 1.1.3. Đặc điểm hình thái 1.1.3.1. Đặc điểm đại thể Paecilomyces spp. là loại nấm sợi được tìm thấy trong đất hay xác côn trùng. Khi được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo nấm thường phát triển khá chậm, có dạng thảm nhung, dạng bó sợi và thường lúc đầu có màu trắng sau đó khi bào tử phát triển thì chuyển sang màu hồng nhạt, màu tím hay màu lục nhạt (nên thường 4
  15. Đồ án tốt nghiệp được gọi là nấm tím) tùy vào từng loài. Cũng có loài màu nâu hay vàng sẫm. Sợi nấm mềm, có vách, trong suốt và rộng từ 2,5 - 4 µm (Wikipedia). Khuẩn lạc thường mọc toả tròn, mép khuẩn lạc trơn nhẵn hoặc có răng cưa. Khuẩn lạc kết chặt tạo thành các cột bào tử đính theo các vòng tròn đồng tâm quanh điểm cấy. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả như Barnett và Barry (1972), Lawrence (1994), De Hoog (1972), Luangsa – Ard et al. (2006) thì ngoài đặc điểm khuẩn lạc, và kích thước cơ quan sinh bào tử, hình dạng và kích thước của bào tử là những chỉ tiêu cơ bản để phân biệt và định danh các loài khác nhau của Paecilomyces. . Hình 1. 1 Đặc điểm đại thể của Paecilomyces spp. (Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp) 1.1.3.2. Đặc điểm vi thể Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, nhẵn kích thước 4-7 x 30 -120 µm, mức độ phân nhánh của nấm phình to, phía trên nhỏ và uốn cong. Cuống bào tử bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều, ở đỉnh có nhiều thể bình mọc thành cụm vòng, thể bình có chiều dài 2-7µm, phân gốc phình to hình elip, phần cổ hình trụ dài. Phần đỉnh thể bình lần lượt kéo dài phân chia thành các bào tử phân sinh một tế bào hình trứng kích thước 2.5-4 x 3.5 -5 µm . Bào tử phân sinh đơn bào, 5
  16. Đồ án tốt nghiệp không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Đỗ Thị Hồng, 2007). Hình 1. 2 Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp. (Nguồn: http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com/2012_06_01_archive.html) 1.1.4. Độc tố của nấm Paecilomyces spp. Độc tố chính của nấm Paecilomyces spp. là paecilotoxin (leucinostatins), là một trong các tác nhân gây ra cái chết cho kí chủ. Paecilotoxin có cấu trúc cực kỳ phức tạp, là một chuỗi peptide thẳng gồm nhiều acid béo chưa bão hòa ở đầu N và amine ở đầu C. Paecilotoxin có pháp danh hóa học là (2S) - N- [(1S) - 1 - [[(1S) - 1- [[(1S)-1-[2[2- (3 - arbamoyl - propylcarbomoyl) - propan- 2ylcarbamoyl]propan - 2- ylcarbamoy]-3-methylbutylcarbomoy]-3-methyl-butyl] carbomoyl] propan-2- ycarbomoyl] - 2 - hydroxy - 3 - methyl - butyl] - carbomyl] - 5 - hydroxyl -3methyl - 7oxo-nonyl ] - 4 - methyl - 1 - [(E,4S) - 4 - methylhex – 2 - enoyl-pyrrolidin-2- carboxamide. (Nevalainen Helena, 1977). Sản phẩm của paecilotoxin có rất nhiều dạng, nhưng khá giống nhau ở mỗi chủng, thường thì độc tố chính là Paecilotoxin A hoặc Paecilotoxin B. Tùy từng loài khác nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriubin, viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hoá thứ cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng. 6
  17. Đồ án tốt nghiệp Hình 1. 3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin. 1.1.5. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp. đối với ký chủ Chu kỳ sống của Paecilomyces spp. có thể chia làm 3 giai đoạn: đầu tiên các bào tử sẽ tiếp xúc với côn trùng qua lớp vỏ và lớp chân lông. Các bào tử bám vào lớp vỏ của côn trùng, nảy mầm và phát triển một ống mầm trong 8 - 16 giờ. Ống mầm phát triển dưới dạng một vòi bám xuyên qua biểu bì côn trùng và đi vào trong xoang máu. Vòi bám là một tế bào có kích thước gấp 2 - 3 lần bào tử, có dịch nhầy để bám vào vỏ côn trùng. Sự xâm nhập của nấm đạt được bằng cách tiết ra hỗn hợp enzyme bao gồm chitinase, protease và áp lực cơ học. Sau khi tế bào đơn nảy mầm, bào tử sẽ xâm nhập và lưu thông trong xoang máu của côn trùng, nhân lên, và sử dụng chất dự trữ trong cơ thể côn trùng để sinh trưởng và sinh sản. Các sợi nấm phân nhánh tạo thành một mạng lưới chằng chịt trong cơ thể côn trùng. Paecilomyces spp. sản sinh ra các hợp chất, phá bỏ hệ thống miễn dịch của côn trùng, cạnh tranh với các vi sinh vật tiềm tàng, giết chết vật chủ trong 7 - 14 ngày. Cuối cùng sau khi ký chủ chết, nấm sẽ lan ra khỏi biểu bì rồi bao lấy cơ thể của côn trùng và phát triển thành đảm bào tử. Khi gặp điều kiện phù hợp sẽ sản sinh ra bào tử, bào tử sẽ được phát tán rồi lây nhiễm cho các vi sinh vật khác. Tuy nhiên, chu kỳ sống được hoàn thành trong điều kiện phải thích hợp, trong khoảng 48 - 72 giờ và không có sự có mặt của vi sinh vật hoại sinh. 7
  18. Đồ án tốt nghiệp Thông thường đối với các loại bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn hay do virus thì chúng lây truyền thông qua đường ruột hay đường thức ăn, nhưng đối với nguồn bệnh là vi nấm thì chủ yếu là do sự tiếp xúc trực tiếp hay qua trung gian truyền bệnh. Trung gian đó có thể là những loài ký sinh hay côn trùng ăn thịt. Nấm Paecilomyces spp. tấn công vào xoang máu của bọ phấn thông qua lớp biểu bì hoặc đường miệng. Bọ phấn chết là sự kết hợp của nhiều yếu tố như tổn thương mô cơ do sự xâm chiếm, suy giảm nguồn dinh dưỡng và nhiễm độc tố do nấm tiết ra khi ở trong cơ thể côn trùng. Quá trình bám của bào tử nấm vào cơ thể của côn trùng là một quá trình thụ động nhờ gió và nước. Đầu tiên bào tử của nấm sẽ bám lên thành biểu bì. Bào tử của nấm có một lớp bên ngoài là bó sợi đan xen là các đuôi kị nước. Độ bám dính của bào tử trên bề mặt biểu bì một phần là nhờ các đuôi kị nước. Lectins, một loại cacborhydrate glycoprotein được phát hiện có trên bào tử, giúp cho việc bám vào bề mặt biểu bì côn trùng dễ hơn. Khi đạt tới điều kiện thích hợp bào tử sẽ nảy mầm và tăng trưởng nhanh chóng với sự tác động của các điều kiện sẵn có của nước, chất dinh dưỡng, oxy cũng như pH, nhiệt độ và bởi sự tác động của hợp chất độc tố trên bề mặt côn trùng. Nấm nảy mầm trong phạm vi có đủ nguồn Carbon và Nitơ. Nấm xâm nhập vào côn trùng bằng quá trình lây nhiễm, xâm nhập qua lớp biểu bì hay tạo áp lực cơ học nhờ giác bám. Lớp biểu bì của côn trùng có hai lớp: ngoài là epicuticle và trong là procuticle. Epicuticle có cấu trúc phức tạp là một lớp mỏng không có chitin nhưng chứa protein, phenol ổn định và được bao phủ bởi một lớp sáp có chứa acid béo, lipid, sterol. Các procuticle phần lớn có các sợi chitin bên trong hỗn hợp protein, lipid, quinon. Nấm cần xuyên qua lớp biểu bì vào cơ thể côn trùng để có thể lấy được chất dinh dưỡng cần cho sự tăng trưởng và sinh sản. Sự xâm nhập vào cơ thể côn trùng bao gồm cả sự phân hủy của enzyme do nấm tiết ra và nhờ áp lực cơ học. Khởi đầu cho quá trình xâm nhiễm, nấm xâm nhập tại những vị trí dễ bị tổn thương trên lớp biểu bì. Nấm sẽ xuyên qua lớp biểu bì ngoài nhờ áp lực cơ học. Bào tử nảy mầm và hình thành các giác bám trên bề mặt biểu bì. Giác bám là đầu tận 8
  19. Đồ án tốt nghiệp cùng của ống mầm phát sinh từ bào tử. Giác bám gắn vào biểu bì côn trùng là nhờ tương tác kị nước giữa các thành bào tử và các lipid nằm trong lớp biểu bì trên. Sau đó, ống mầm xuyên qua lớp biểu bì dưới, nội bì rồi vào xoang máu. Các nghiên cứu còn cho thấy có sự tham gia của các chất truyền tin nội bào như Ca2+ và cAMP (cyclicadenosine monophosphate) trong sự hình thành giác bám trong trường hợp khi lớp biểu bì cứng khó xuyên qua. Sau khi xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng, nấm thường tạo ra rất nhiều sợi nấm ngắn. Những sợi nấm này được phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, chúng tiêu diệt dần các tế bào bạch huyết. Sau đó, sợi nấm xâm nhập mô, phá hủy tất cả các tế bào bạch huyết rồi làm chết vật chủ. Sự sinh sản của nấm trước hết là sự biến đổi thành phần dịch thể làm giảm tác dụng oxy hóa khử lympo trong máu. Do nấm sinh sản nhiều sẽ làm tắc hệ tuần hoàn của côn trùng, làm côn trùng biếng ăn, đồng thời chất độc sinh ra làm thay đổi sinh hóa của cơ thể và làm tê liệt thần kinh, từ đó làm rối loạn và mất chức năng sinh lý. Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục hoại sinh cơ thể côn trùng rồi phát triển sợi nấm ra toàn bộ cơ thể côn trùng và hình thành bào tử. Quá trình xâm nhập vào cơ thể côn trùng còn nhờ vào sự hỗ trợ mạnh mẽ của các enzyme và hệ enzyme. Một loạt các loại enzyme ngoại bào có thể thủy phân các thành phần chính của lớp biểu bì côn trùng như chitinase, lipase, esterase, lipoxygenase và ít nhất bốn loại protease khác nhau đã được ghi nhận có vai trò quan trọng trong việc xâm nhiễm. Do cấu trúc phức tạp của lớp biểu bì côn trùng nên cần có sự phối hợp hoạt động của nhiều enzyme khác nhau. Trong đó, chitanase và endoprotease là hai enzyme giữ vai trò quan trọng nhất. 1.2. Các chủng nấm Paecilomyces đã được phân lập Xếp theo hệ thống phân loại nấm của Anisworth, 1966, 1970, 1971, Mccoy và ctv (1988), Samson và ctv (1988) đã cho rằng Paecilomyces spp. thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn Deueromycetes, giống Paecilomyces. Có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 31 loài phân bố trê diện rộng trong đó có thể kể đến là 9
  20. Đồ án tốt nghiệp Paecilomyces farinosus, Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces lilacinus,… (trích dẫn bởi Nguyễn Phước Vĩnh, 2008)  Paecilomyces vatiotii Bainier (1907) Khuẩn lạc phát triển rất nhanh, có màu vàng nâu hoặc vàng đất. Cuống bào tử đính mọc rậm rạp. Thể bình có hình trụ hoặc elip. Bào tử có dạng hình cầu, elip, hình thoi, màu sắc từ trong suốt đến vàng, bề mặt trơn láng, kích thước 3 -5 x 2 4 µm, hình thành từ chuỗi phân ly dài. Hậu bào tử thường hiện diện đơn lẻ hay trong một chuỗi ngăn, màu nâu, có hình dạng từ hình cầu đến hình quả lê, đường kính 4 - 8 µm (theo trích dẫn của Domsch, Gam và Anderson,1980) Hình 1. 4 Cành bào đài, thể bình, và bào tử của nấm Paecilomyces variotii Nguồn: (http://www.cbs.knaw.nl/publications/1006/content_files/sim6fig1.jpg)  Paecilomyces lilacinus Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này được phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru. Hiện tại, có thể phân lập loài nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong côn trùng. Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ở nhiệt độ phòng 270C ± 20C. Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu hồng khi sinh bào tử. Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài. Các thể bình phình ra ở phần gốc và thon nhỏ lại ở cổ. Bào tử trần hình elip đến hình thoi (Samson, 1975). 10
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược