1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Cải thiện điều kiện nuôi cấy Serratia marcescens SH1 và phương pháp thu hồi sắc tố prodigiosin từ canh trường

Đồ án tốt nghiệp: Cải thiện điều kiện nuôi cấy Serratia marcescens SH1 và phương pháp thu hồi sắc tố prodigiosin từ canh trường

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm khảo sát chủng Serratia marcescens xem xét độ thuần khiết, khảo sát kháng sinh đồ cải tiến điều kiện lên men Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin, cũng như phương pháp thu hồi sắc tố thô. Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SERRATIA MARCESCENS SH1 VÀ PHƯƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ CANH TRƯỜNG”. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chu

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 125

Ngày tạo 10/11/2021 12:14:19 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 1.94 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Cải thiện điều kiện nuôi cấy Ser... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SERRATIA MARCESCENS SH1 VÀ PHƯƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ CANH TRƯỜNG”. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện : Hồ Thị Bích Phương MSSV: 1151100246 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, trƣờng đại học Công nghệ TP.Hồ Chí Minh. Các số liệu và kết quả là trung thực, chƣa ai công bố. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về lời cam đoan của mình trƣớc quý thầy cô và nhà trƣờng. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8, năm 2015 Sinh viên thực hiện Hồ Thị Bích Phƣơng
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Tận đáy lòng con xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ đã gian lao nuôi dạy con thành ngƣời và là ngƣời thầy đầu đời của con. Cha mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc nhất của con, là ngƣời giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã, là nguồn động viên, động lực để con tiếp tục phấn đấu trong cuộc sống. Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô Khoa Công nghệ sinh học – Môi trƣờng – Thực phẩm, cùng toàn thể Thầy Cô Trƣờng Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu về cơ sở ngành cũng nhƣ chuyên ngành từ ngày em bƣớc chân vào giảng đƣờng đại học. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hƣơng ngƣời đã luôn tận tình chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành phần thực nghiệm của đồ án. Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Môi trƣờng – Thực phẩm, Trƣờng Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. Cảm ơn tất cả các bạn lớp 11DSH04 và các bạn làm đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Môi trƣờng – Thực phẩm đã luôn khích lệ, động viên và giúp đỡ mình trong suốt quá trình học tập tại trƣờng và trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn! TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015 SVTH: Hồ Thị Bích Phƣơng
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. v DANH MỤC HÌNH ẢNH ...................................................................................... vi MỤC LỤC BẢNG ................................................................................................ viii LỜI MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 9 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 12 1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật ........................................................... 12 1.1.1. Hợp chất thứ cấp .......................................................................................... 12 1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật .............. 12 1.2 Tổng quan prodigiosin ...................................................................................... 15 1.2.1. Khái niệm về prodigiosin ............................................................................. 15 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin .......................................................... 16 1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin .............................................................. 18 1.3. Tổng quan về Serratia marcescens .................................................................... 24 1.3.1. Phân loại Serratia marcescens ..................................................................... 24 1.3.2. Đặc điểm của Serratia marcescens ............................................................. 25 1.3.4 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp bởi Serratia marcescens ............................ 29 1.3.5 Tổng quan về quorum sensing trong S. marcescens ..................................... 31 1.4. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin ....................................................................... 32 1.4.1. Cơ chế tổng hợp prodigiosin ........................................................................ 32 1.4.2. Yếu tố ảnh hƣởng đến tổng hợp prodigiosin................................................ 34 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.4.3. Điều kiện tổng hợp prodigiosin.................................................................... 38 1.4.4. Thu nhận, tinh sạch và định lƣợng prodigiosin............................................ 39 1.5 Tiềm năng sản xuất prodigiosin của Serratia marcescens................................... 42 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU45 2.1. Thời gian và địa điểm.......................................................................................... 45 2.1.1. Thời gian ...................................................................................................... 45 2.1.2. Địa điểm ....................................................................................................... 45 2.2. Vật liệu ................................................................................................................ 45 2.2.1. Nguồn vi sinh vật ......................................................................................... 45 2.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy và hóa chất sử dụng.................................................... 45 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu..................................................................................... 46 2.4 Bố trí thí nghiệm .................................................................................................. 47 2.5.1 Khảo sát chủng nuôi cấy ................................................................................... 49 2.5.1 Kiểm tra độ thuần khiết ................................................................................. 49 2.5.2 Kháng sinh đồ ............................................................................................... 49 2.6 Xác định điều kiện lên men .................................................................................. 49 2.7.1 Khảo sát vận tốc lắc trong nuôi cấy .............................................................. 52 2.7.2 Xác định pH tối ƣu cho môi trƣờng lên men ................................................ 53 2.7.3 Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ muối NaCl .......................................... 53 2.7.4 Khảo sát sự ảnh hƣởng của phƣơng pháp đồng nuôi cấy ............................ 54 2.7.5 Khảo sát sự ảnh hƣởng của sản phẩm Quorum sensing................................ 55 2.8 Thu hồi sản phẩm thô ........................................................................................... 56 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.8.1 Xác định tỷ lệ trích ly dung môi đồng thời khảo sát thể tích lên men .......... 56 2.8.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia tăng nhiệt độ ......................................... 56 2.9 Các phƣơng pháp phân tích .................................................................................. 56 2.9.1 Xác định protein có trong mẫu ...................................................................... 57 2.9.2 Xác định lipid có trong mẫu .......................................................................... 57 2.10 Sắc ký bản mỏng TLC........................................................................................ 57 2.11 Phƣơng pháp phân tích ....................................................................................... 59 2.11.1. Phƣơng pháp định lƣợng hợp chất prodigiosin .......................................... 59 2.11.2. Phƣơng pháp xử lý số liệu thống kê ........................................................... 59 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 60 3.1 Kết quả kiểm tra độ thuần khiết ........................................................................... 60 3.2 Xác định điều kiện lên men thu prodigiosin ........................................................ 65 3.2.1 Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp ........ 65 3.2.2 Xác định vận tốc lắc ...................................................................................... 67 3.2.3 Kết quả xác định pH tối ƣu cho môi trƣờng MT3 ........................................ 69 3.2.4 Ảnh hƣởng của nồng độ muối lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp ............ 71 3.2.5 Kết quả thí nghiệm đồng nuôi cấy ................................................................ 73 3.2.6 Sử dụng dịch trong nuôi cấy ......................................................................... 76 3.3 Thu hồi sản phẩm lên men từ canh trƣờng........................................................... 77 3.3.1 Ảnh hƣởng của tỷ lệ canh trƣờng: dung môi trích ly lên hàm lƣợng prodigiosin thu hồi ................................................................................................. 77 3.3.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia nhiệt canh trƣờng .................................. 78 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp 3.4 Xác định thành phần hóa học trong mẫu.............................................................. 84 3.4.1. Phản ứng Biuret’s test .................................................................................. 84 3.4.2 Xác định lipid có trong mẫu .......................................................................... 86 3.5 Sắc ký bản mỏng TLC.......................................................................................... 88 Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 91 4.1 Kết luận............................................................................................................. 91 4.2 Kiến nghị .......................................................................................................... 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 93 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 1 iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EPN: Entomopathogenic nematodes OD: mật độ quang (Optical Density) λmax : bƣớc sóng hấp thụ cực đại TLC: Thin Layer Chromatogarphy v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) .............................................. 19 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học prodigiosin (Krishna,2008) ............................................... 20 Hình 1.3. Cơ chế kháng tế bào ung thƣ của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,2011) 23 Hình 1.4. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) ................. 29 Hình 1.5. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar ở 250C sau 48 giờ (David, 2012) ..................................................................................................... 28 Hình 1.6. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC 39.600, Sma 274 và các cụm sunh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001) ........................................ 35 Hình 1.7. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009) ........................................... 37 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm................................................................................... 51 Hình 2.2 Sơ đồ trích ly .................................................................................................. 54 Hình 2.3 Cách chuẩn bị giấy chạy sắc ký ..................................................................... 61 Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng SH1 nuôi cấy trên môi trƣờng NA ..................................... 63 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc soi thằng và soi nghiêng dƣới kính hiển vi vật kính 10X ...................................................................................................................................... .64 Hình 3.3 Kết quả nhuộm Gram chủng SH1 .................................................................. 65 Hình 3.4 Kết quả kháng kháng sinh của chủng SH1 .................................................... 65 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp ........ 69 Hình 3.6 Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc ............................................ 71 Hình 3.7 Ảnh hƣởng của pH lên sự tổng hợp prodigiosin của S. marcescens SH1. .... 73 Hình 3.8 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi bổ sung NaCl. ....................................... 75 Hình 3.9 Đồng nuôi cấy Serratia marcescens SH1 và Bacillus sp. .............................. 77 Hình 3.10 Kết quả đồng nuôi cấy E. coli ...................................................................... 78 Hình 3.11. Hàm lƣợng prodigiosin thu hồi sau trích ly nhờ tỷ lệ canh trƣờng: dung môi khác nhau....................................................................................................................... 81 Hình 3.12 Canh trƣờng sau khi ly tâm .......................................................................... 82 Hình 3.13. Sắc tố đỏ sau khi trích ly với dung môi Etanol:HCl (95:5) ........................ 83 Hình 3.14. Vi khuẩn S. marcescens đƣợc cấy trên môi trƣờng NA.............................. 84 Hình 3.15. Hàm lƣợng prodigiosin so với đối chứng. .................................................. 85 Hình 3.16. Kết quả quét quang phổ của sắc tố canh trƣờng không đun và đun 1000C 86 Hình 3.17 Biuret’s test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thô 87 Hình 3.18 Ninhydrin test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thô ở thí nghiệm đun và không đun canh trƣờng. ............................................................... 88 Hình 3.19. Kết quả mẫu phản ứng Coomassie brilliant blue trƣớc và sau khi phun thuốc thử.................................................................................................................................. 90 Hình 3.20. Kết quả sắc ký bản mỏng sử dụng hệ dung môi Petrolium ether: Ether : Acetic acid (70 : 40 : 2, v : v :v).................................................................................... 92 Hình 3.21 Sơ đồ quy trình S. marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin...........................93 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật ............... 15 Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) .. 19 Bảng 1.3. Các sản phẩm prodigiosin thƣơng mại hóa (Santa Cruz Biotechnology, Merck Millipore, Biovision incorporated).....................................................................25 Bảng 1.4. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens (Tariq và Jonh, 2010) 29 Bảng 1.5. So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các môi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau ( Chidambaram và Perumalsamy, 2009). ....... 40 Bảng 2.1. Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của máy lắc và chế độ lắc. ........................ 55 Bảng 3.1 Kết quả kháng kháng sinh ............................................................................. 66 Bảng 3.2 % Hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp so với đối chứng (thí nghiệm A) ........ 69 Bảng 3.3. Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc. ......................................... 70 Bảng 3.4 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu .................................................... 73 Bảng 3.5 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi bổ sung muối NaCl ............................... 75 Bảng 3.6. % prodigiosin tổng hợp so với đối chứng..................................................... 77 Bảng 3.7. Hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp khi bổ sung dịch nuôi cấy. ...................... 79 Bảng 3.8. % Ảnh hƣởng của tỷ lệ canh trƣờng : dung môi trích ly .............................. 80 Bảng 3.9. Kết quả hàm lƣợng prodigiosin trong thí nghiệm ........................................ 84 Bảng 3.10. Kết quả xác định protein và lipid ............................................................... 91 viii
  12. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn nhƣ thực vật, vi sinh vật, động vật có xƣơng sống và không xƣơng sống là những nguồn có giá trị của các hợp chất hoạt tính sinh học. Một số lƣợng lớn các loại thuốc đã đƣợc phát triển trong ngành y từ các sản phẩm tự nhiên. Kể từ khi phát hiện và thành công trong việc điều trị của peniciline, các vi sinh vật đã đƣợc sử dụng nhƣ một nguồn đặc biệt của các tác nhân hoạt tính sinh học có cấu trúc đa dạng. Các ứng dụng điều trị của các chất chuyển hóa của vi sinh vật cung cấp cơ hội cho việc phát hiện ra kháng sinh (ví dụ peniciline, erythromycin…), ức chế miễn dịch trong cấy ghép, các tác nhân giảm cholesterol (ví dụ lovastain và mevastatin) và tác nhân chống ung thƣ (ví dụ doxorubicin, daunorubicin, bleomycin và pentostatin). Từ khi nền khoa học hiện đại bắt đầu, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đƣợc chiết xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ,… đã đƣợc sử dụng trong việc làm thuốc đông y, mỹ phẩm, thực phẩm,... Nhƣng sau đó, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đã đƣợc nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hóa học cũng nhƣ cách tổng hợp bằng phƣơng pháp hóa học, bởi ngƣời ta cho rằng chúng bền hơn, có thể sản xuất trên quy mô lớn và chi phí sản xuất thấp. Tuy nhiên, các vấn đề ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe gây ra bởi các hợp chất tổng hợp hóa học đã bắt đầu đƣợc chú ý đến. Chính vì thế so với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh vật ngày càng đƣợc quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự nhiên và an toàn dễ sử dụng, sản xuất đƣợc quanh năm trong các điều kiện địa lý khác nhau và do sự tăng trƣởng nhanh chóng của vi sinh vật nên sẽ làm giảm thời gian sản xuất xuống còn chỉ một vài ngày. So với các nguồn khác từ thực vật hoặc động vật thì hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật có thể dễ dàng đƣợc kiểm soát và dự đoán sản 9
  13. Đồ án tốt nghiệp lƣợng (Francis, 1987; Taylor, 1984). Trong những sắc tố từ vi sinh vật thì hợp chất prodigiosin đƣợc biết đến với ý nghĩa quan trọng. Một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia marcenscens có khả năng tổng hợp sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N30 = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996; Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005). Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút đƣợc nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lãnh vực bảo vệ thực vật cũng nhƣ hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Sớm nhận thấy đƣợc lợi rất quan trọng của hợp chất prodigiosin đƣợc tách từ việc nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, Nguyễn Hoàng Anh Kha đã thu nhận sắc tố đỏ prodigiosin từ việc nuôi cấy trong môi trƣờng peptone glycerol đạt 10,575 mg/ml sắc tố ( ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2014). Sau đó ĐATN Trần Lâm Tú Quyên (2014) đã khảo sát trong quá trình lên men thu prodigiosin, môi trƣờng huyền phù đậu phộng MT1 (10%) cho hàm lƣợng prodigiosin là 248,4% so với môi trƣờng peptone glycerol là 100%. Cũng trong ĐATN Trần Lâm Tú Quyên (2014) kết luận môi trƣờng MT3 chứa 10% huyền phù đậu phộng 5% pepton và 1% dầu hƣớng dƣơng, tỉ lệ cấy giống 3%, lắc 180 vòng phút trong 24 giờ đầu sau đó giảm còn 150 vòng/phút là môi trƣờng và điều kiện tối ƣu nhất để tổng hợp sắc tố đỏ prodigiosin. Nhƣng quá trình lên men còn ở quy mô sản xuất nhỏ 20 ml/bình và còn nhiều yếu tố cần cải thiện. Dựa trên cơ sở này đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY Serratia mercescens SH1 VÀ PHƢƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ CANH TRƢỜNG” đƣợc tiến hành nhằm tăng nồng độ prodigiosin tổng hợp. 10
  14. Đồ án tốt nghiệp 2. Mục tiêu đề tài Cải tiến điều kiện lên men Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin, cũng nhƣ phƣơng pháp thu hồi sắc tố thô. 3. Nội dung đề tài Khảo sát chủng Serratia marcescens xem xét độ thuần khiết, khảo sát kháng sinh đồ. Cải tiến điều kiện nuôi cấy Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin: tăng thể tích lên men, ảnh hƣởng của vận tốc lắc, pH nuôi cấy, nồng độ muối % NaCl, thử áp dụng phƣơng pháp đồng nuôi cấy tăng hợp chất thứ cấp, thử áp dụng bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn Gram âm chứa phân tử tín hiệu Quorum sensing. Thiết lập quy trình trích ly sắc tố thô từ canh trƣờng nuôi cấy. 4. Ý nghĩa khoa học Áp dụng các kiến thức về công nghệ lên men sản xuất hợp chất thứ cấp vào tổng hợp prodigiosin. Xem xét khá năng sử dụng chủng Serratia marcescens SH1 phân lập từ tuyến trùng EPN vào sản xuất prodigiosin qua kháng sinh đồ khác biệt với chủng phân lập từ bệnh phẩm. Góp phần vào việc tăng quy mô và nồng độ sản phẩm prodigiosin tổng hợp bằng phƣơng pháp lên men. 5. Ý nghĩa thực tiễn Cung cấp sản phẩm prodigiosin thô cho nghiên cứu tinh sạch và khảo sát hoạt tính sinh học. 11
  15. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 1.1.1. Hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp là chất đƣợc tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lƣợng phân tử nhỏ, thƣờng đƣợc gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trƣờng xung quanh. Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất đƣợc vi sinh vật tạo ra từ quá trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp. 1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Vi sinh vật đã đƣợc sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử sinh học nhƣ thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn nhƣ hợp chất thứ cấp, đƣợc xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học nhƣ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến cá, ví dụ nhƣ để tăng màu hồng của cá hồi nuôi. Hơn nữa, một số hợp chất tự nhiên có tiềm năng thƣơng mại để sử dụng nhƣ chất chống oxy hóa. Ngành công nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh 12
  16. Đồ án tốt nghiệp vật cung cấp một số lƣợng hợp chất rất lớn nhƣ: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009). Các loại hợp chất này có tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng nhƣ có thể dễ dàng tối ƣu hóa quy trình công nghệ (Juailova và cộng sự, 1997). Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Williams và cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác nhƣ: Rhodotorula, Bacillus, Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số lƣợng lớn hợp chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây chết hoặc kìm hãm vi sinh vật phát triển, đƣợc một số vi sinh vật nhƣ nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của mình. Bảng 1.1 tóm tắt về một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật. Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật Vi sinh vật Hợp chất thứ cấp Ứng dụng Kiểu tác động ức chế Penicillium Penicillin Ức chế tụ cầu khuẩn, Ức chế tạo polymer notatum, nhiễm trùng kỵ khí, vách tế bào vi khuẩn, giang mai, hen suyễn. ức chế hấp thu amino Penicillium acid và protein, ức chế chrysogenum tạo enzyme 13
  17. Đồ án tốt nghiệp Streptomyces Streptomycin Ức chế vi khuẩn Ức chế ghép nối một griceus Gram âm và ram số amino acid vào dƣơng. Trị bệnh lao, protein, tác động lên bệnh viêm màng não, hệ enzyme của vi ho gà khuẩn tham gia chuyển pyruvate vào chu trình Creb… Steptomyces Chloramphenicol Ức chế đối với bệnh Ức chế đặc hiệu sinh venezuelae lỵ, sốt cao, sốt phát tổng hợp protein vi ban khuẩn liên quan đến peptidyl transferase trong tiểu đơn vị Ribosome 50s, ngăn không cho tạo liên kết peptide Streptomyces Tetracilin Ức chế phổ rộng vi Ức chế tổng hợp aureomycin khuẩn Gram âm, protein Gram dƣơng Streptomyces Erythromycin Chữa bệnh do tụ cầu ức chế vi khuẩn Gram erythraeus khuẩn streptococcal âm và Gram dƣơng gây ra 14
  18. Đồ án tốt nghiệp Streptomyces Neomycin Tác dụng vi khuẩn Hơi độc fradiae Gram âm và Gram dƣơng Streptomyces Kanamycin Điều trị lao, ức chế vi Tác động giống nhƣ kanamycetius khuẩn Gram âm và streptomycin và neomycin Gram dƣơng Streptomyces Cycloserine Điều trị bệnh lao Cản trở tổng hợp vách lavendulae tế bào 1.2 Tổng quan prodigiosin 1.2.1. Khái niệm về prodigiosin Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng túi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991). Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp, đƣợc sản xuất bởi các vi khuẩn nhƣ Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous, Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra và các xạ khuẩn Gram dƣơng, chẳng hạn Streptoverticillium rubrireticuli và Streptomyces longisporus (Khanafari và cộng sự, 2006). Hình 1.1 trình bày cấu trúc hóa học của các hợp chất đại diện của prodigiosin. 15
  19. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodigiosin đƣợc tổng hợp bởi Serrattia marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ ở những năm tiếp theo, mà cấu trúc của prodigiosin dần đƣợc nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000). Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2- ylidene)methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N30 và trọng lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006; Williamson và cộng sự, 2006). Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp với nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và đƣợc miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008). 16
  20. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Cấu trúc hóa học prodigiosin (Krishna, 2008). (Krishna Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan đƣợc trong nƣớc. Prodigiosin có thể tan tƣơng đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafari và cộng sự, 2006). Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Loài Tên sắc tố Danh pháp prodigiosin Trọng lƣợng phân tử và công thức Serratia marcescens Prodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 323,4 Da methoxy prodigiosene C20H25N30 Serratia marcescens Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 309,4 Da hydroxy-prodigiosene C10H23N30 Nocardia Nonylprodigiosin 2-Nonly-6- 363,5 Da (Actinomadura) methoxyprodigiosene C23H31N30 madurae 17
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược