- Trang Chủ
- Luận Văn - Báo Cáo
- ĐỀ TÀI: Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire (part 6)
Xem mẫu
- 46
MỤC LỤC
PHẦN MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề ..............................................................................................................1
1.2 Mục đích - yêu cầu.................................................................................................1
1.2.1 Mục đích..........................................................................................................1
1.2.2 Yêu cầu............................................................................................................1
PHẦN 2: TỔNG QUAN ................................................................................................. 3
2.1 Giới thiệu sơ lƣợc về giống heo Yorshire ..............................................................3
2.1.1 Prolactin ..........................................................................................................3
2.1.1.1 Nguồn gốc, cấu tạo ...................................................................................3
2.1.1.2 Tác dụng của prolactin .............................................................................3
2.1.1.3 Cơ chế tác động của prolactin ..................................................................4
2.1.1.4 Gen thụ thể prolactin ................................................................................5
2.2 Giới thiệu về DNA (Deoxiribonucleotide acid) ....................................................6
2.2.1 Cơ chế tự nhân đôi của DNA ..........................................................................8
2.2.2 Gen, allen và sự đa hình của gen...................................................................10
2.2.2.1 Gen .........................................................................................................10
2.2.2.1.1 Sự biểu hiện của gen hay sự điều hoà hoạt động của gen ...............10
2.2.2.1.2 Sự liên kết giữa gen và marker ........................................................11
2.2.2.2 Allen và sự đa hình của gen ...................................................................11
2 .2.3 Phƣơng pháp chiết tách DNA từ mô động vật ....................................12
2.2.4 Phƣơng pháp định tính và định lƣợng cho DNA ..........................................13
2.2.4.1 Định lƣợng bằng phƣơng pháp đo OD (optical density) ........................13
2.2.4.2 Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di ............................................13
2.3 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .......................................................14
2.3.1 Giới thiệu về phản ứng PCR .........................................................................14
2.3.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR .......................................................14
2.3.2.1 Taq polymerase ......................................................................................14
2 .3.2.2 Các nucleotid .....................................................................................15
2 .3.2.3 Primer (mồi) .......................................................................................15
2 .3.2.4 Dung dịch đệm ...................................................................................15
- 47
2 .3.2.5 DNA khuôn .........................................................................................16
2.3.2.6 Số chu kỳ phản ứng ................................................................................16
2.3.2.7 Nhiệt độ và pH .......................................................................................16
2.3.2.6 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục .............16
2.3.2.7 Ứng dụng của PCR .................................................................................18
2.4 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật PCR – RFLP .......................................18
2.4.1 Kỹ thuật RFLP ( restricton fragment length polymorphism)........................18
2.4.2 Kỹ thuật PCR – RFLP ...................................................................................19
2 .5 Các enzyme giới hạn .......................................................................................20
PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT .......................................... 21
3.1 Thời gian, địa điểm .............................................................................................21
3.1.1 Thời gian ......................................................................................................21
3.1.2 Địa điểm .......................................................................................................21
3.2 Đối tƣợng khảo sát .............................................................................................21
3.3 Nội dung thực hiện .............................................................................................21
3.4 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................21
3.4.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm ...........................21
3.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu...............................................................................22
3.4.2.1 Thu thập mẫu ..........................................................................................22
3.4.2.2 Ly trích DNA ..........................................................................................23
3.4.2.3 Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế.....................................................24
3.4.2.4 Ứng dụng phƣơng pháp PCR – RFLP khảo sát sự đa hình của gen PRLR ....24
3.4.2.4.1 Xây dựng qui trình khuyếch đại PCR và cắt enzyme giới hạn........24
3.4.2.5 Ứng dụng PCR phát hiện ra gen thụ thể prolactin và xác định tần số các
kiểu gen PRLR trên các mẫu phân tích ..................................................................27
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................... 30
4.1 Hiệu quả ly trích DNA từ mẫu máu và mẫu da tai ..............................................30
4.1.1 Mẫu máu........................................................................................................30
4.1.1 Mẫu da tai ......................................................................................................31
4.2 Kết quả việc thực hiện phản ứng PCR .................................................................33
4.2.1 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo các qui trình khác nhau ...................33
4.2.1.1 Qui trình phản ứng PCR theo nhiệt độ bắt cặp khác nhau .....................33
- 48
4.2.1.2 Qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau ......................35
4.3 Kết quả thực hiện cắt enzyme giới hạn trên các qui trình khác nhau ..................38
4 .4 Tần số x uất hiện của các kiểu gen trong quần thể .......................................40
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 43
5.1 Kết luận ................................................................................................................... 43
5.2 Kiến nghị ................................................................................................................. 43
- 49
PHỤ LỤC
Khối lƣợng phân tử của một số hoá chất sử dụng trong thí nghiệm
Tris HCl ( pH = 8) 157.64 g / mol
Na2EDTA 372,24 g / mol
SDS 288,38 g / mol
MgCl2.6H2O 203,3 g / mol
KCl 74,55 g / mol
NaCl 58.5 g / mol
H3PO4 61.81 g / mol
Sodium acetat 163.1 g / mol
Hoá chất cho ly trích
TE 1X
Tris HCl
Na2EDTA
Nƣớc cất 2 lần vô trùng vừa đủ
Proteinase K
Phenol / chloroform / isoamyl (25:24:1)
Ethanol lạnh
Ethanol tuyệt đối
Hoá chất dùng cho PCR
Taq polymerase
Primer F
Primer R
dNTPs
PCR buffer 10X
Tris HCl
Hoá chất dùng cho cắt enzyme
Buffer 10 X
BSA (Bovine serum albumin)
AluI
- 50
Hoá chất dùng cho điện di
TBE 0.5 X 0.9 M
Na2EDTA 20 mM
Tris bazơ 0.9 M
Nƣớc cất vô trùng vừa đủ
Hoá chất dùng cho nhuộm gel
Dung dịch ethium bromide 10 mg / ml
TBE 1X
Loading dye
Bromophenol blue 0.25 %
Sucrose 40 %
TE 1X vừa đủ 100 %
DANH MỤC CÁC HÌNH
- 51
Hình 2.1: Cơ chế tác động của prolactin tại tế bào mục tiêu .......................................... 4
Hình 2.2: Cấu trúc của các loại bazơ hữu cơ ................................................................... 7
Hình 2.3: Cấu trúc tổng quát của 4 loại nucleotide ......................................................... 7
Hình 2.4: Sự nhân bản DNA ........................................................................................... 9
Hình 2.5: Các chu kỳ của phản ứng PCR ...................................................................... 14
Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 1 với nồng độ gel 1,5 %......... 34
Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 2 với nồng độ gel LMP 1,5 %... 34
Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 1 với nồng độ gel LMP 1,5 % ........ 36
Hình 4.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 2 với nồng độ gel LMP 1,5 % ........ 36
Hình 4.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 3 với nồng độ gel 1,5 % ................ 37
Hình 4.6: Kích thƣớc của sản phẩm PCR ...................................................................... 38
Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme giới hạn AluI với nồng độ gel 2 % ........ 39
Hình 4.8: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme với gel LMP 3,5 % ........................ 40
Hình 4.9: Tỉ lệ % xuất hiện của các kiểu gen PRLR ..................................................... 42
DANH MỤC CÁC BẢNG
- 52
Bảng 2.1: Các thông số của gen thụ thể prolactin lấy từ genbank .................................. 6
Bảng 2.2: Các yếu tố cần thiết cho sự tự nhân đôi của DNA .......................................... 9
Bảng 2.3: Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục ................... 17
Bảng 3.1: Nhiệt độ và thời gian của 2 qui trình phản ứng PCR .................................... 25
Bảng 3.2: Nồng độ cuối của 3 qui trình thực hiện phản ứng PCR ................................ 26
Bảng 3.3: Nồng độ và thể tích của các qui trình cắt enzyme AluI ................................ 27
Bảng 4.1: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu máu ............................. 30
Bảng 4.2: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu da tai ........................... 32
Bảng 4.3: So sánh tỉ lệ thành công giữa hai qui trình nhiệt độ khác nhau .................... 33
Bảng 4.4: So sánh tỉ lệ thành công giữa ba qui trình phản ứng PCR theo nồng độ
primer khác nhau ...........................................................................................................35
4.2.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo hai loại mẫu khác nhau ........................... 37
Bảng 4.5: So sánh tỉ lệ thành công của phản ứng PCR với hai loại mẫu khác nhau ..... 37
Bảng 4.6: So sánh tỉ lệ thành công giữa các qui trình cắt enzyme khác nhau ................... 38
Bảng 4.7: Tỉ lệ % xuất hiện của gen PRLR................................................................... 41
Bảng 4.8: Tỉ lệ % xuất hiện của gen PRLR................................................................... 41
nguon tai.lieu . vn
