1. Trang Chủ
  2. Luận Văn - Báo Cáo
  3. ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ (part 7)

ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ (part 7)

E. coli được xem là vi khuẩn chỉ danh ô nhiễm thực phẩm và nước dựa vào số lượng của chúng. E. coli thải qua phân ra môi trường bên ngoài. Nếu quá trình vệ sinh kém thì E. coli dễ vấy nhiễm vào thịt tươi, nhất là trong quá trình giết mổ. Từ đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm không thích hợp thì ngộ độc thực phẩm do E. coli hoàn toàn có thể xảy ra. 55 22. Donnenberg M. S., Tzipori S., McKee M. L., O Brien A. D., Alroy J., and Kaper J. B., 1993. The role of the eae gene of enterohemorrhagi

Thể loại Tài liệu miễn phí Luận Văn - Báo Cáo

Số trang 8

Ngày tạo 8/29/2018 9:09:34 PM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước

Tên tệp

Tải ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT ... (.pdf)

Xem mẫu

  1. 55 22. Donnenberg M. S., Tzipori S., McKee M. L., O Brien A. D., Alroy J., and Kaper J. B., 1993. The role of the eae gene of enterohemorrhagic Escherichia coli in intimate attachment in vitro and in a porcine model. J Clin. Invest. 92:1418-1424. 23. FAO, 1992. Microbiological analysis in the food control laboratory. 24. FDA, 2002. “Diarrheagenic Escherichia coli”, Bacteriological Analytical manual Online, CFSAN. September 2002.
  2. 56 34. Leung P. H. M., Peiris J. S. M., Ng W. W. S., Robin -Browne R. M., Bettelheim K. A., and Yam W., C., 2003. A newly discovered verotoxin variant, VT2g, produced by bovine verocytotoxigenic Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 69: 7549 -7553. 35. Levine M. M., Xu J., Kapper J. B., Lior H., Prado V., Tall B., Nataro J. P., Karch H., and Wachsmuth K., 1987. A DNA probe to identify enterohemorrhagic Escherichia coli of O157:H7 and other serotypes that cause hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome. J. Infect. Dis. 156:175-182. 36. Makino S., Kobori H., Asakura H., Watarai M., Shirahata T., Ikeda T., et al, 2000. Detection and characterization of Shiga toxin-producing Escheichia coli from seagulls. Epidemiol. Infect. 125:55 -61. 37. Moon H. W., Schneider R. A., and Moseley S. L., 1986. Comparative prevalence of four enterotoxin genes among Escherichia coli isolated from swine. Am. J. Vet. Res. 47:210-212. 38. Nataro J. P. and Kaper J. B., 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. 11(1):142 -201. 39. Neter E., Westphal O., Lud eritz O., Gimo R. M., and Gorzynski E. A., 1995. Demonstration of antibod ies against enteropathogenic Escherichia coli in sera of children of various ages. Pediatrics. 16:801-808. 40. Paton A. W. and Paton J. C., 1998 a. Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli b y using multiplex - PCR assay for stx1, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E. coli h lyA, rfb0111, and rfbo157. J. Clinical Microbiol. 36(2):598-602. 41. Paton J. C. and Paton A. W., 1998b. Phathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infection. Clin. Microbiol. Rev. 11:450-479. 42. Pierard D., Muyldermans G., Moriau L., Stevens D., and Lauwers S., 1998. Identification of new verocytotoxin type 2 variant B-subunit genes in human and animal Echerichia coli isolates. J. Clin. Microbiol. 36:3317-3322. 43. Protocol online
  3. 57 45. Schmidt H., Beutin L., and Karch H., 1995. Molecular Analysis of the Plasmid-encoed Hemolysin of Escherichia coli O157:H7 strain EDL 933. Infec. Immunity. 63:1055-1061. 46. Smith H. R., and Scotland S. M., 1998. Vero cytotoxin-producing strains of Escherichia coli. J. Med. Microbiol. 26:77-85. 47. Timisjarvi A. T., Alatossava T., 2004. Rapid DNA preparation from milk and dairy process samples for the detection of bacteria by PCR. Food Microbiol. 21:365 -368. 48. Thomas A., Cheasty T., Chart H., and Rowe B., 1994. Isolation of vero cytotoxin-producing Escherichia coli serotypes O9ab:H- and O101:H- carrying VT2 variant gene sequences from a patient with haemolytic uraemic syndrome. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 13:1074-1076. 49. Toma C., Lu Y., Higa N., Nakasone N., Chinen I., Baschkier A., Rivas M., and Iwanaga M., 2003. Multipex – PCR Assays for identification of human diarrheagenic Escherichia coli. J. Clin . Microbiol. 41:2669 -2671. 50. Wang G., Clark C. G., and Rodgerst F. G., 2002. Detection in Escherichia coli of the genes defining the O157:H7 serotype, and components of the type 2 shiga toxin family by multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 40:3613-3619. 51. Wieler L. H., Vieler E., Erpenstein C., Schlapp T., Steinruck H., Bauerfeind R., Byomi A., and Baljer G., 1996. Shiga toxin-producing Escherichia coli strains from bovines: Association of adhesion with carriage of eae and other genes. J. Clin. Microbiol. 34:2980-2984.
  4. 58 PHỤ LỤC 1 MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ Môi trường CT-SMAC SMAC Peptone 20 g Sodium chloride 5g Bile salts 1,5 g Sorbitol 10 g Crystal violet 0,001 g Neutral red 0,03 g Agar 15 g Nư ớc cất vừa đ ủ 1.000 ml CT – SUPPLEMENT Cefixime 0,05 mg/l Potassium tellurite 2,5 mg/l MAC Bacto peptone 17 g Bacto Proteose peptone 3g Bacto Lactose 10 g Bacto Bile salts 1,5 g Sodium Chloride 5g Bacto Agar 13,5 g Neutral Red 0,03 g Bacto Crystal Violet 0,001g Nước cất vừa đủ 1000 ml NA Peptone 5g
  5. 59 Sodium chloride 5g Beef Extract 1,5 g Yeast Extract 1,5 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 15 g pH = 7,4 ± 0,2 (250C) Nước peptone đệm Peptone 10 g Sodium chloride 5g Disodium hydrogen phosphate 9g Potassium dihydrogen phosphate 1,5 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH = 7 SIMMON CITRAE Sodium citrate 2g NaCl 5g K2HPO4 1g NH4H2PO4 1g MgSO4 0,2 g Bromothymol blue 0,08 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1000 ml MR – VP Peptone 7g Glucose 5g K2HPO4 5g Nước cất vừa đủ 800 m l pH = 6,9 ± 0,2
  6. 60 Thuốc thử VP (Voges Proskauer) Dung dịch A: Alpha naphthol 5g Ethanol tuyệt đ ối 100 ml Dung dịch B: Potassium hydroxyde 40 g Nước cất 100 m l MR (Methyl red) Methyl red 0,1 g Alcohol 300 m l Nước cất vừa đủ 500 m l HÓA CHẤT ĐIỆN DI TBE (0,5 X) Tris HCl 3,94 mg Acid Boric 1,39 g Na2EDTA 93,06 mg Nư ớc cất vừ a đ ủ 500ml pH = 8,3 Agarose (1,4%) Loading dye Bromo phenol blue 0,25% Sucrose 40% TE 1X vừa đủ 100% HÓA CHẤT NHUỘM GEL TBE 1X Ẹthidium bromide 10 mg/ml
  7. 61 PHỤ LỤC 2 CÁC VẤN ĐỀ THƯỜNG GẶP TRONG MULTIPLEX – PCR VÀ HƯỚNG GIẢI QUYẾT Vấn đềà Hướng giải quyết * Nếu dài - Tăng nồng độ KCl (buffer) đ ến 1,2 – 2 X nh ưng giữ nguyên nồng độ MgCl2 ở 1 ,5 – 2 mM. * Nếu ngắ n - Giảm nồng độ buffer còn 0,7 – 0,9 X nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2 mM. - Tăng d ần nhiệt độ ủ bắt cặp . - Giảm lượng DNA xét nghiệm . - Giảm lượng p rimer. Sản phẩm - Giảm lượng Taq – polymerase. không chuyên - Tăng nồng độ MgCl2 đến 3 – 4,5 mM nhưng giữ nguyên nồng b iệt độ dNTP. - Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 – 0,8 g/l: nồng độ cuố i cùng). Có thể dùng 5 % glycerol (v/v nồng độ cuối). * Nếu không có sản phẩm - Chạy PCR cho mỗi cặp primer đ ược sử dụng trong multiplex với nhiệt độ ủ bắt cặp thấp hơn b ình thư ờng. - So sánh các sản ph ẩm không chuyên biệt cho mỗi cặp p rimer kiểm tra với sản phẩm kh ông chuyên biệt nhìn th ấy khi ch ạy multiplex – PCR. Điều này có thể ch ỉ ra mỗi cặp p rimer mang lại những sản phẩm không chuyên biệt trong ph ản ứng multiplex. - Kết h ợp một vài ho ặc tất cả nh ững phương pháp trên. - Giảm thời gian ủ bắt cặp. - Giảm nhiệt độ kéo dài xuống 62 – 680C. - Tăng thời gian kéo d ài. - Tăng n ồng độ DNA xét n ghiệm. - Tăng tất cả lượng prim er sử dụng. Sản phẩm yếu - Điều chỉnh nồng độ Taq – polymerase. - Thay đổi nồng độ buffer nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2 (m ờ ) mM. - Tăng nồng độ MgCl2 đến 3 – 4,5 mM nhưng giữ nguyên nồng độ dNTP. - Thêm chất ph ụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 – 0,8 g/l: nồng độ cuối cùng). Có thể dùng 5 % glycerol (v/v nồng độ cuối).
  8. 62 - Giảm nồng độ buffer còn 0,7 – 0,8 X nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2 m M. - Tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,4 mM nhưng giữ nguyên nồng độ dNTPs. - Tăng thời gian biến tính. - Tăng thời gian ủ b ắt cặp. Sản ph ẩm dài - Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp . và yếu (mờ) - Tăng thời gian và nhiệt độ kéo dài. - Tăng lượng primer đối với sản phẩm PCR có băng mờ đồng thời giảm lượng prim er cho băng đậm. - Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 – 0,8 g/l). Nên thử 5% glycerol (v/v nồng độ cuối cùng). - Kết h ợp một vài ho ặc tất cả các phương pháp trên. - Tăng nồng độ buffer đến 1,2 – 2 X nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2 mM. - Giảm thời gian biến tính. - Giảm thời gian ủ bắt cặp . - Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp . Sản phẩm - Giảm thời gian và nhiệt độ kéo dài. ngắn và yếu - Tăng lượng primer đối với sản phẩm P CR có b ăng m ờ và giảm (m ờ ) lượng primer có băng đậm. - Thêm ch ất phụ gia BSA (0,1 – 0 ,8 g/l), có th ể thử 5% glycerol (v/v nồng độ cu ối cùng). - Keát hôïp moät vaøi hoaëc taát caû caùc phöông phaùp treân.
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược