Đề tài: Phát hiện và đếm Coliforms trong nước uống, các phương pháp hiện thời và phương pháp tiếp cận nổi bậc

BÔ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Môn: Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề Tài: Detection And Enumeration Of Coliforms In Drinking Water: Current Methods And Emerging Approaches (Phát Hiện Và Đếm Coliforms Trong Nước Uống: Các Phương Pháp Hiện Thời Và Phương Pháp Tiếp Cận Nổi Bậc) GVGD: Phan Thị Kim Liên TP.HCM,THÁNG 11­2014 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 2 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm MỤC LỤC MỤC LỤC.........................................................................................................3 TÓM TẮT .........................................................................................................4 1. Giới Thiệu.......................................................................................................................5 1.1. Coliforms là gì?...............................................................................................................7 2. Mục Tiêu.......................................................................................................................10 3. Phương Pháp Cổ Điển.................................................................................................10 3.1. Kỹ thuật lên men nhiều ống..........................................................................................10 3.2. Kỹ thuật màng lọc.........................................................................................................12 4. Phương Pháp Enzyme.................................................................................................15 4.1 Nguyên tắc chung..........................................................................................................15 4.2. Kỹ thuật có/ không có sự hiện diện của vi khuẩn và đếm bằng các kỹ thuật nhiều ống sử dụng phương pháp enzyme...........................................................................................17 4.3. MF kỹ thuật liên hợp với phát hiện enzyme của vi khuẩn............................................20 4.4. Xác định trực tiếp hoạt tính của enzyme bằng fluorimetry...........................................21 4.5. Phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp sử dụng enzyme đếm tế bào pha rắn...........22 4.6. Kết luận về phương pháp enzyme...............................................................................23 5. Phương Pháp Phân Tử ...............................................................................................24 5.1. Phương pháp miễn dịch ..............................................................................................24 5.2. Phương pháp dựa trên axit nucleic .............................................................................28 6. Kết Luận.......................................................................................................................41 LỜI CẢM ƠN................................................................................................44 GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 3 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm TÓM TẮT Nhóm coliform được sử dụng rộng rãi như một chỉ tiêu của chất lượng nước và về phương diện lịch sử đã dẫn đến khái niệm bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Mục đích của việc xem xét này là để kiểm tra phương pháp hiện đang được sử dụng hoặc có thể được đề xuất cho việc kiểm tra định lượng coliforms trong nước uống. Trên thực tế, nhu cầu về các thử nghiệm nhanh hơn, nhạy hơn và cụ thể hơn là điều cần thiết trong ngành công nghiệp nước. Các kỹ thuật thông thường và được thừa nhận rộng rãi, đã được thảo luận, như là các phương pháp nổi bậc từ sự phát triển của các nghiên cứu gần đây. Phương pháp truyền thống đã được chấp nhận để phát hiện coliform bao gồm kỹ thuật lên men nhiều ống (MTF) và kỹ thuật màng lọc (MF) sử dụng môi trường nuôi cấy cụ thể và điều kiện ủ khác nhau. Những phương pháp này vẫn còn những hạn chế, chẳng hạn như thời gian ủ bệnh, sự can thiệp sinh vật đối kháng, thiếu tính cụ thể và việc phát hiện kém đối với các vi sinh vật phát triển chậm hoặc có thể phát triển và tồn tại mà không nuôi cấy. Ngày nay, kỹ thuật màng lọc đơn giản và không tốn kém là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất cho việc định lượng thông thường coliforms trong nước uống. Việc phát hiện coliforms dựa trên hoạt tính enzyme đặc trưng đã cải thiện được độ nhạy của các phương pháp này. Các enzyme ­D galactosidase và ­D glucuronidase được sử dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng coliforms tổng và Escherichia coli, tương ứng. Nhiều chất chromogenic và fluorogenic được dùng để phát hiện cụ thể hoạt tính của các enzyme này và các thử nghiệm mang tính thương mại khác nhau được dựa trên các chất có sẵn này. Nhiều sự so sánh đã cho thấy những thử nghiệm này có thể là một thay thế thích hợp cho các kỹ thuật cổ điển. Tuy nhiên, phương pháp này thì đắt hơn, và thời gian ủ, mặc dù giảm, nhưng vẫn còn quá dài để cho kết quả cùng ngày. GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 4 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Các công cụ phân tích tinh vi hơn như kỹ thuật đếm tế bào pha rắn có thể được tận dụng để làm giảm thời gian cần thiết để phát hiện các hoạt động của enzyme ở vi khuẩn, với một ngưỡng phát hiện thấp. Phát hiện coliforms bằng phương pháp phân tử này cũng được đề cập, vì các phương pháp này cho những phát hiện rất cụ thể và nhanh chóng mà không cần nuôi cấy. Ba phương pháp phân tử được đánh giá ở đây: các kỹ thuật miễn dịch, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và lai tại chỗ (ISH). Trong cách phương pháp miễn dịch, các kháng thể khác nhau chống lại vi khuẩn coliform được tạo ra, nhưng việc áp dụng kỹ thuật này thường cho thấy kháng thể mang tính đặc hiệu thấp. PCR có thể được sử dụng để phát hiện vi khuẩn coliform bằng phương pháp khuếch đại tín hiệu: trình tự DNA mã hóa cho các gen lacZ (gen b­ galactosidase) và gen uidA (b – D gen glucuronidase) đã được sử dụng để phát hiện tổng coliforms và E. coli, tương ứng. Tuy nhiên, việc định lượng với PCR vẫn thiếu chính xác và đòi hỏi phải làm việc trong phòng thí nghiệm chuyên dụng. Kỹ thuật FISH liên quan đến việc sử dụng các đầu dò oligonucleotide để phát hiện các trình tự bổ sung bên trong tế bào cụ thể. Đầu dò oligonucleotide được thiết kế đặc biệt cho phạm vi của các phân tử RNA 16S của Enterobacteriaceae có thể được sử dụng để kiểm soát chất lượng vi sinh của các mẫu nước uống. FISH nên là một kỹ thuật cần quan tâm có thể thay thế cho các phương pháp nuôi cấy thông thường để xác định nhóm coliform trong nước uống, vì nó cung cấp các dữ liệu định lượng trong một khoảng thời gian khá ngắn (6 – 8 tiếng), nhưng vẫn đòi hỏi nỗ lực nghiên cứu. 1. Giới Thiệu Việc bảo vệ sức khỏe công đồng và môi trường đòi hỏi nước uống phải an toàn, điều đó có nghĩa là không chứa VSV gây bệnh. Giữa các VSV phân tán trong các nguồn nước, VSV gây bệnh ở ruột là những loại dễ bắt gặp nhất. Như một hệ quả, các nguồn ô nhiễm phân trong nước dành cho hoạt động con người phải được kiểm soát chặt chẽ. Tác nhân gây bệnh đường ruột, như Escherischia GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 5 ... - tailieumienphi.vn