Xem mẫu
- TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
--------
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN 2011
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ
TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
CƠ QUAN QUẢN LÝ: TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
Đà Lạt, tháng 05 năm 2011
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
--------
- BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN 2011
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ
TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
Cơ quan chủ trì : Trường Đại học Đà Lạt
Chủ nhiệm đề tài : Đỗ Bá Dương
Lớp CSK32 – MSSV: 0810951
Thành viên tham gia – Lớp CSK32:
Mã Phước Huyền Thanh An 0810928
Đặng Ngọc Nam 0811022
Lê Thị Thanh Nhi 0811037
Bùi Khắc Hoàng Vũ 0811122
Cán bộ hướng dẫn: ThS. Nguyễn Khoa Trưởng
Đà Lạt, tháng 05 năm 2011
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của nhóm chúng tôi. Những kết quả và số
liệu nghiên cứu trong báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu khoa học chưa được ai công
bố dưới bất cứ hình thức nào. Nhóm chúng tôi sẽ hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà
trường về lời cam đoan này.
Đà Lạt, ngày 20 tháng 05 năm 2011
Người cam đoan
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, nhóm chúng tôi xin tỏ lòng biết ơn
sâu sắc đến:
Ban Giám hiệu Trường Đại học Đà Lạt, Khoa Sinh học tạo mọi điều kiện cho
nhóm chúng tôi có cơ hội học tập và thực hiện đề tài này.
Tất cả thầy cô đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng tôi trong suốt
những năm học vừa qua.
ThS. Nguyễn Khoa Trưởng, giảng viên Khoa Sinh Học, Trường Đại Học Đà Lạt
đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ chúng tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cảm ơn gia đình, anh chị khóa trước, bạn bè đã giúp đỡ, động viên chúng tôi.
Xin chân thành cảm ơn
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng nấm men phân
lập từ quả táo mèo
.........................................................................................................................................
19
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của khuẩn lạc và tế bào của các chủng nấm men
lập từ
phân bánh men lá
..... 20
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh trưởngvà phát triển của nấm
cấy
men sau 24h nuôi
..... 21
Bảng 3.4. Khả năng đồng hóa lên men đường saccharose và đường glucose của
chủng giống lập
các đã phân
..... 22
Bảng 3.5. Số lượng tế bào nấm men sau khi nuôi cấy trong khoảng thời gian
từ 0h – 48h
..... 23
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 3.1. Biểu đồ sự ảnh hưởng của pH tới số lượng tế bào nấm men sau 24h
nuôi cấy ........................................................................................................................... 21
Hình 3.2. Biểu đồ đường cong sinh trưởng của các chủng nấm men tuyển chọn . . 24
Hình 3.3. Quy trình sản xuất rượu cần ........................................................................ 25
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
MỤC LỤC
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
MỞ ĐẦU
Việt Nam đang trong bước chuyển mình hội nhập, bên cạnh tiếp thu các thành t ựu
khoa học tiên tiến, việc bảo tồn, phát huy các truyền thống văn hóa dân tộc càng phải
được chú trọng. Việt Nam có nền văn minh lúa nước lâu đời, các sản phẩm t ừ nông
nghiệp đã xuất hiện lâu đời và trở thành các giá trị văn hóa ẩm thực cần l ưu gi ữ trong
đó có rượu. Trải dài trên đất nước Việt Nam mỗi mảnh đất là một hương vị riêng c ủa
rượu hòa quyện trong nét văn hóa bản địa như Rượu Mẫu Sơn – Lạng Sơn, r ượu bản
Phố - Bắc Hà, rượu Đao – Yên Bái, rượu cần Tây Bắc, Tây Nguyên… Như chúng ta đã
biết, rượu cần là một đặc sản văn hóa của các dân tộc thiểu số Việt Nam nói chung và
các dân tộc Tây Nguyên nói riêng, trong có các dân tộc ở tỉnh Lâm Đồng.
Rượu cần là thứ đồ uống quý có trong tất cả các gia đình người Tây Nguyên, dùng
trong các dịp lễ tế thần linh, những ngày hội làng và dành đãi khách. Người dân Tây
Nguyên cho rằng, rượu của họ là do Giàng (trời) bày cho cách làm, mỗi khi cúng Giàng
hoặc tế lễ thần linh phải có rượu cần thì lời cầu nguyện mới linh nghiệm. Hơn nữa,
rượu cần được làm khá công phu bằng chất liệu là lương thực - thứ sản phẩm nuôi
sống con người.
Tuy nhiên, các giá trị này đang ngày càng mai một, sản phẩm rượu cần đang b ị
thương mại hóa vì vậy chất lượng rượu đang dần mất đi giá tr ị truy ền thống. Đ ể ti ếp
tục góp phần lưu giữ và bảo tồn truyền thống sản xuất rượu cần thì việc nghiên cứu
các loài cây và các chủng vi sinh vật thuần khiết để sản xuất rượu cần đang được quan
tâm. Xuất phát từ những lý do đó nhóm chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ PHÂN
LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU
CẦN”.
Nội dung đề tài:
1. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men.
2. Đánh giá hoạt tính của các chủng nấm men phân lập được.
Bước đầu xây dựng quy trình sản xuất rượu cần quy mô phòng thí nghiệm.
Page 8
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về rượu cần
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều sản phẩm rượu khác nhau. Mỗi quốc gia đ ều
có những sản phẩm rượu đặc trưng, Nhật Bản có rượu sake, Hàn Quốc có Soju…
Rượu phương đông với nôi văn hóa lớn như Trung Quốc, Ấn độ, Đông Nam Á hầu hết
được sản xuất từ nguồn lương thực như các loại ngũ cốc.
Rượu vang là sản phẩm nổi tiếng gắn liền với nét văn hóa phương tây thường lên
men không qua chưng cất từ các loại trái cây mà đặc trưng là nho, Đây là sản phẩm nổi
tiếng của Pháp, Ý. Ngoài ra ở phương tây còn có một số sản phẩm truy ền thống n ổi
tiếng như: Mezcal (Tequila) của Mexico được làm từ cây Maguey (từ một loài xương
rồng) đặc trưng cho Mexico, rượu Whisky là nước uống của nhà tu Ireland.
Trên thế giới hiện không ngừng gia tăng về chủng loại rượu, số l ương, chất
lượng rượu. Vì vậy việc giữ gìn và phát triển sản phẩm rượu cần truy ền thống c ủa
Việt Nam đóng vai trò quan trọng trong việc đa dạng hóa sản phẩm rượu trên thế giới.
Bên cạnh cây lúa nước là đặc trưng của Việt Nam thì sản phẩm r ượu c ần cũng
được nhiều người, nhiều quốc gia biết đến như là sản phẩm truyền thống thứ hai của
dân tộc Việt Nam.
Rượu cần là cách gọi của người Việt đối với loại rượu đặc sản được một số dân
tộc thiểu số Việt Nam ủ men trong hũ/bình/ché/chóe/ghè, không qua chưng cất, khi đem
ra uống phải dùng các cần làm bằng tre/trúc đục thông lỗ để hút rượu. Rượu cần là đồ
uống quý thường chỉ dùng trong các dịp lễ tế thần linh, những ngày hội làng và dành đãi
khách.
Từ thời xa xưa, các đồng bào dân tộc thiểu số ở nước ta đã biết l ợi dụng các chủng vi
sinh vật trong tự nhiên để thực hiện quá trình lên men rượu tự nhiên không qua chưng
cất tạo thành sản phẩm rượu có tên gọi chung là rượu cần. Hầu hết các đồng bào dân
tộc thiểu số của nước ta đều có nghề làm rượu cần. Các đồng bào dân tộc Thái ở Tây
Page 9
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
Bắc, đồng bào các dân tộc Xê - đăng, Cơ tu, H’Rê… ở miền trung. Đặc biệt đặc sắc là
rượu cần của đồng bào các dân tộc thiểu số vùng Tây Nguyên như: Bana, Giarai, Mạ,
Stiêng, K’ho,…
Nguyên liệu làm rượu của đồng bào rất đa dạng từ hạt bo bo, ngô, gạo t ẻ, gạo
nếp cho đến củ khoai mì, củ dong. Các loài thực vật mà đồng bào sử dụng làm rượu
cần cũng rất đa dạng thay đổi tùy theo đồng bào dân tộc. Bên cạnh đó, nguồn nguyên
liệu thực vật để làm men phải vào rừng sâu và quá trình làm rượu mất rất nhiều thời
gian, công sức. Vì vậy, hiểu biết về làm rượu cần truyền thống ngày càng giảm làm
cho tri thức dân gian không được kế thừa mà dần mất đi bản sắc độc đáo riêng. Chính
vì thế, việc bảo tồn văn hóa dân tộc, đang rất cần được chú trọng trước khi bị mất hoàn
toàn.
Mặc dù sản phẩm rượu cần đã được sản xuất từ lâu đời nhưng hiện nay vẫn chưa
có nhiều nghiên cứu về rượu cần chỉ có một số nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Huệ
(1996), từ bánh men của người dân tộc K’Ho, Nguyên liệu để làm bánh men là gạo và
một số loại cây lá đặc trưng ở mỗi dân tộc như cây đòng và cây me kà zút (tên gọi c ủa
người dân tộc K’Ho), đã phân lập được:
- Hai chủng nấm mốc thuộc chi Mucor và Rhizopus. Hai chủng này có khả năng
đường hóa
- Hai chủng nấm men (chưa định danh), một trong hai chủng này vừa có khả năng
đường hóa, vừa có khả năng rượu hóa.
Một số chủng vi sinh vật tạp nhiễm khác (chưa định danh) và chưa rõ chức năng.
Với cách làm bánh men của người K’Ho nói trên ta thấy thành phần vi sinh vật trong
bánh men là không ổn định. Do vậy ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng rượu đ ược tạo
thành. Trong quá trình sản xuất rượu cần, việc dùng bánh men là còn phụ thuộc vào
mùa. Trong năm có mùa thích hợp cho sự thu hái của cây để làm men lá, có mùa không
thu hái được vì chúng không mọc. Vì vậy, không chủ động được nguồn men lá nên dần
thay thế bằng men nhân tạo (Nguyễn Thị Kim Huệ, 1996, Trần Thị Thanh, 2003).
Hiện nay, rượu cần đã được thương phẩm hóa từ lâu với một số hãng sản xuất
rượu cần nổi tiếng như: Rượu cần Y Miên, Rượu cần Y Pao, Rượu cần Hòa Bình.
Page 10
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
Nhưng thực tế, trước thời buổi kinh tế thị trường, rượu cần dã bị thay đổi bản chất
thực của men lá. Hiện nay các nơi sản xuất rượu cần không sử dụng cây tự nhiên mà sử
dụng men công nghiệp hoặc men thuốc bắc để thay thế làm mất đi hương vị và làm
giảm chất lượng sản phẩm. Quá trình làm rượu diễn ra nhanh nhưng rượu không ngon,
không đậm đà và có vị chua nhiều. Trong khi đó, rượu cần truyền thống có vị ngọt, độ
cồn nhẹ, giàu dinh dưỡng, không gây phản ứng phụ.
Như vậy, với nguồn tài nguyên thực vật làm rượu cần phong phú, kinh nghiệm sản
xuất rượu lâu đời của đồng bào dân tộc Tây nguyên và nhu cầu sử dụng rượu ngày càng
cao chúng ta cần phải tiếp tục có những nghiên cứu để phát triển bền vững nghề sản
xuất rượu cần ở địa phương.
1.2. Cơ sở lý thuyết quá trình lên men rượu
Phương trình tổng quát của quá trình lên men rượu có thể viết như sau:
C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 113,4kJ
Các phản ứng của quá trình lên men rượu rất phức tạp, nó phải trải qua 10 phương
trình phản ứng khác nhau với sự tham gia của nhiều hệ enzyme xúc tác, kết quả cho ra
rượu etylic, CO2 và một số sản phẩm khác.
Nấm men là cơ thể hiếu khí, chúng hô hấp như cơ thể bậc cao, khi trong môi trường
hết oxy phân tử (oxy không khí hòa tan trong môi trường lên men), chúng mới tiến hành
lên men, tức là chuyển sang hô hấp kỵ khí.
Trong điều kiện lên men rượu, các đường đơn như glucose, fructose sẽ được phân
giải theo con đường EMP và chu trình axit tricacboxylic (ATC) lúc đầu được thực hiện,
tiếp theo là chuỗi hô hấp hoạt động, nấm men thu nhiều năng lượng, sinh khối dịch lên
men tang. Môi trường sẽ dần chuyển sang lên men, sau đó sản phẩm sẽ hình thành
Etanol, CO2, sinh khối, các axit hữu cơ và sản phẩm phụ như Glyserin.
Quá trình lên men rượu có 5 quá trình chủ yếu:
− Biến đồi glucose thành fructose-1,6-phosphate.
− Biến đổi fructose-1,6-phosphate thành 3-phospho glyceraldehyde và
phosphodioxy-acetone.
Page 11
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
− Biến đổi phosphodioxy-acetone thành 2- phospho glycerate rồi thành axit pyruvic.
− Axit pyruvic bị loại 1 phân tử CO2 để thành acetaldehyde.
− Hình thành etanol do acetaldehyde lấy hydro từ NADH.
Hệ vi sinh vật trong quá trình lên men rượu cần tự nhiên
1.3.
Hệ vi sinh vật trong quá trình lên men rượu cần tự nhiên là nấm men, nấm mốc có
sẵn từ các bánh men. Vì vậy bánh men có tính địa phương và không thuần khiết, nhưng
nói chung hệ vi sinh vật ở đây thường là:
− Nấm mốc gồm có Aspergillus oryzae, A. flavus, A. awamorii, A. usami, A. niger
(giống Aspergillus chiếm phần lớn), Mucor (M. Circinilloides), Rhizopus, Penicillium và
Amylomyces rouxii... Nấm mốc sinh enzyme amylaza đường hóa tinh bột.
− Nấm men chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae. Ngoài ra còn thấy có
Hyphopichia burtonii, Pichia anomada, Candida...những men này coi như là men dại,
men tạp có lẫn trong bánh men và chúng ta không mong muốn. Nấm men rượu chuy ển
hóa đường thành rượu.
Trong bánh men ta còn thấy có loài men giả là Endomycopsis fibuliger. Giống
Endomycopsis tương tự như nấm men nhưng có thể mọc sợi, có khả năng sinh
glucoamylaza và thủy phân tinh bột thành đường glucoza. Vì vậy trong nghề làm rượu
người ta rất muốn giống này để cùng Aspergillus, Mucor và Rhizopus đường hóa tinh
bột.
Vi khuẩn: thường thấy có mặt vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic... Nói chung, vi
−
khuẩn có mặt ở đây đều là vi khuẩn tạp nhiễm, ta không mong muốn.
Các giống nấm mốc Aspergillus, Mucor và Rhizopus đóng vai trò sinh enzyme
amylaza đường hóa tinh bột. Khi đường hóa hệ enzyme trong nấm mốc thường ít α-
amylaza và nhiều β-amylaza, vì vậy đường tạo thành chủ yếu là maltoza và các dextrin
cuối (cũng có thể lên men được).
Một số chủng nấm mốc thuộc loài Aspergillus awamorii, A. usami sinh ra nhiều
glucoamylaza, khi đường hóa cho sản phẩm là glucoza. Hai loài này sinh bào t ử có màu
Page 12
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
đen nhìn thấy bằng mắt thường như các đầu kim nhỏ. Về hình thức A. awamorii và A.
usami khá giống nhau, chúng thường có mặt trong bánh men.
Aspergillus oryzae và A. flavus cũng rất giống nhau, sinh bào tử khi già có màu vàng
hoa cau, vì vậy chúng được gọi là mốc vàng hoa cau. Chúng có khả năng sinh enzyme
amylaza và proteaza. Trong nghề làm tương, làm xì dầu và làm rượu rất hay gặp các
mốc vàng.
Aspergillus niger, bào tử thương đối lớn và rất đen, được gọi là mốc đen, có khả
năng sinh ra nhiều enzyme amylaza, nhưng đồng thời có thể tạo ra acid citric từ dịch
đường. Vì vậy người ta cũng không mong muốn sự có mặt của mốc này trong bánh
men, nhưng đây là một điều khó khăn vì mốc này rất phổ biến trong tự nhiên.
Việc sử dụng mốc vàng hoa cau trong nghề làm tương, nước chấm xì dầu và trong
nghề làm rượu cũng cần lưu ý: A. flavus có khả năng sinh enzyme amylaza và proteaza
dùng để thủy phân tinh bột thành đường, thủy phân protein thành peptide và acid amin,
nó còn sinh ra độc tố aflatoxin khi môi trường nuôi cấy có chất béo. Độc tố này ảnh
hưởng nhiều tới gan.
Mucor và Rhizopus có hình dạng rất giống nhau, chỉ khác nhau phần hệ sợi cơ chất.
Trong nghề làm rượu rất gặp hai giống này, đặc biệt là Mucor rouxii, M. mucedo, M.
japanicus. ở nước ta hay gặp M. rouxii (phát triển tốt trên môi trường czapek và trên
gạo).
Một số chủng Mucor có khả năng sinh tổng hợp hai hệ enzyme diastaza (amylaza)
đường hóa tinh bột và zymaza lên men rượu từ đường. Vì vậy chúng có thể lên men trực
tiếp từ tinh bột thành rượu. Mucor rouxii sinh ra nhiều rượu hơn một số loài khác và
được dùng nhiều trong men rượu.
Hơn nữa khi có mặt Rhizopus và Mucor lên men rượu có mùi thơm rất dễ chịu. Cơ
chế của mùi thơm ở đây của hai mốc này như thế nào đến nay hoàn toàn chưa rõ.
Penicilium là mốc sinh bào tử có màu xanh thường gọi là mốc xanh. Tuy nó có khả
năng sinh ra hệ enzyme đường hóa mạnh, nhưng nó thường cho mùi vị mốc rất khó chịu
như nhiều mốc khác. Nhưng mốc sinh “mùi đặc trưng” của mốc thường không đ ược
hoan nghênh trong nghề chế biến thực phẩm.
Page 13
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
Giống Endomycopsis được gọi là giả nấm men. Khi trưởng thành có hệ sợi giả
cùng với bào tử đính nhiều chồi, bào tử phấn hoặc bào tử phân đôi bằng vách ngăn hoặc
nảy chồi ở nhiều phía. Endomycopsis có khả năng sinh nhiều glucoamylaza và đặc biệt
trong hệ enzyme do giống này sinh ra ưu việt hơn nấm mốc là có ít enzyme
transglucosidaza. Có mặt enzyme này một phần glucoza chuyển thành acid glconic. Hơn
nữa, enzyme lấy từ chế phẩm nuôi Endomycopsis không có mùi mốc làm cho hương vị
của rượu thành phẩm thơm ngon.
Nấm men có trong bánh men chủ yếu là men rượu Saccharomyces cerevisiae. Ngoài
men rượu ra thì các giống men khác có trong bánh men đều coi là men dại. Phần dưới
bánh men thường lót trấu, tạo điều kiện thoáng khí.
1.4. Tổng quan nấm men
Hình thái và kích thước
1.4.1.
Nấm men thường có hình trứng hay hình bầu dục. Kích thước thay đổi t ừ 2,5μm-
21µm, do đó có thể nhìn thấy dưới kính hiển vi quang học. Để quan sát hình thái nấm
men và đo được kích thước người ta thường sử dụng môi trường thạch, mạch nha dịch
thể với nồng độ đường là 10-15 baling, hoặc môi trường thạch, mạch nha, thời gian
nuôi cấy 3 ngày, nhiệt độ là 25-300C.
Cấu tạo của tế bào nấm men
1.4.2.
Vách tế bào: Khi còn non vách tế bào nấm men tương đối mỏng, tùy theo thời
•
gian nuôi cấy mà vách tế bào nấm men dày lên, vách tế bào nấm men dày khoảng 25nm
(chiếm 25% trọng lượng khô của tế bào). Đa số nấm men có vách tế bào cấu tạo bởi
glucan và mannan. Một số loại nấm men có vách tế bào cấu tạo bởi mannan và kitin,
phần còn lại chứa 10% protein (tính theo trọng lượng cơ thể). Một ít lipid, đôi khi có cà
poliphosphat, enzyme, sắc tố và một số ion vô cơ.
Màng nguyên sinh chất: màng nguyện sinh chất có chiều dày khoảng 7-8Mm,
•
cấu tạo chủ yếu là protein chứa 50% trọng lượng khô. Chức năng màng giống như
Page 14
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
màng nguyên sinh chất của vi khuẩn. Thông qua màng nguyên sinh chất mà thực bào
cũng như thải bỏ các sản phẩm trao đổi chất.
Tế bào chất: tế bào chất nấm men là hệ keo bán lỏng chứa các loại protein, axit
•
amin, ARN, glucid, lipid và các loại hạt nucleotid chứa 42% ARN và 50% protit, và các
loại hợp chất phân tử nhỏ, chứa các cơ quan con, các vật thể và các chất dự trữ khác.
Ribosome: số lượng ribosome thay đổi tùy từng loại, tùy từng giai đoạn phát
•
triển và điều kiện nuôi cấy. Có 2 loại ribosome là loại 70S và 80S.
Ty thể: là những ty thể hình cầu, hình que, hình sợi kích thước khoảng 0,2-1Mm.
•
Ty thể gồm 2 lớp là màng trong và màng ngoài. Màng trong có hình l ượn sóng hay hình
răng lược. Để tăng thêm diện tích tiếp xúc, giữa hai màng có các hạt nhỏ gọi là h ạt c ơ
bản, bên trong ty thể là chất dịch hữu cơ. Màng ngoài của tế bào nấm men khác với
màng ty thể là màng ty thể có rất nhiều đơn vị, hình thái dạng nấm và mũ nấm có
đường kính khoảng 80-100A. Màng ngoài của ty thể có chứa các loại enzyme của chuỗi
hô hấp, enzyme phosphorin hóa, và trên đó cư trú một số men không có trong màng trong
như mono aminoxydaza, NAD-xytocrom, C-seductase.
Trong ty thể người ta tìm thấy tất cả các yếu tố của hệ thống tổng hợp protein.
Người ta tách ra từ cơ quan này các loại ribosome “VK”. Tức là những hạt ribosome 70s
của ribosome này cũng giống như ARN, thông tin của ty thể được tổng hợp dưới sự
kiểm soát của ADN ty thể. ADN của ty thể nấm men là ADN dạng vòng, có khối lượng
phân tử là 50x60 Ra, gấp 5 lần so với động vật bậc cao. ADN ty thể nấm men chiếm
15-23% tổng lượng ADN của toàn tế bào nấm men. Có một loại plasmid được phát
hiện năm 1967 ở nấm men Saccharomyces cerevisiae được gọi là YAC (nhiễm sắc thể
nhân tạo). Ty thể được coi là trạm năng lượng của tế bào nấm men.
Nó tham gia thực hiện các phản ứng oxy hóa giải phóng năng lượng ra khỏi cơ chất
làm cho năng lượng được tích lũy dưới dạng ATP, giải phóng năng lượng ATP và
chuyển hóa năng lượng đó thành năng lượng có ích cho hoạt động sống của tế bào.
Page 15
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
Ngoài ra ty thể còn chứa nhiều loại enzyme khác như: oxidase, xitocromoxidase,
peoxydase…
Các thể ăn nhập khác:
•
Không bào có chứa enzyme thủy phân, polyphosphate, lipid, ion kim loại, các phẩm
trao đổi chất, điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men.
Ngoài ra còn chứa các hạt dự trữ tinh bột khác như: hạt lipid dưới dạng các hạt nhỏ, các
hạt glucogen, một ít hạt tinh bột.
Nhân: nhân tế bào nấm men là nhân thật, có sự phân hóa, có kết cấu hoàn chỉnh
•
và ổn định, có khả năng biểu hiện của tế bào tiến hóa, đó là sự phân chia tế bào theo
hình thức giảm phân.
Màng nhân của tế bào nấm men có cấu trúc hai lớp và có lỗ thủng. Nhân của tế bào
nấm men Saccharomyces cerevisiae có chứa 14 cặp nhiễm sắc thể. ADN trong nhân tế
bào nấm men đơn bội có trọng lượng phân tử 4x10 Da (Dalton).
Sinh sản của nấm men
1.4.3.
Sinh sản vô tính
1.4.3.1.
Sinh sản bằng phương pháp nảy chồi
•
Phương pháp nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến của nấm men. Khi nấm men
trưởng thành sẽ nảy ra một chồi nhỏ, chồi sẽ lớn dần lên, một phần nhân của tế bào
mẹ được chuyển sang chồi sau đó tách ra một nhân mới rồi hình thành vách ngăn đ ể
ngăn cách với tế bào mẹ hoặc đính trên tế bào mẹ và tiếp tục nảy sinh tế bào mới. Hình
thành sinh sản này xảy ra đối với tất cả nấm men.
Sinh sản bằng phân cắt: một số ít nấm men như Sporobolomyces sinh sản bằng
phương pháp cắt ngang như vi khuẩn, tế bào dài ra rồi sau đó sinh ra những vách ngăn
đặc biệt và phân cắt thành nhiều tế bào.
Sinh sản bằng bào tử
•
Bào tử đốt: ở chi Geotrichum.
Page 16
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
Bào tử bắn: ở chi Sporobolomyces.
Bào tử áo: ở nấm Candida albicans.
1.4.3.2. Sinh sản hữu tính
Tế bào nấm men có thể sinh sản bằng nang hay túi bào tử, trong mỗi túi có 2-4 hoặc
8 bào tử. Túi bào tử được sinh ra do sự tiếp hợp của hai tế bào nấm men.
Khi tê bào khác giới đứng gần nhau, ở mỗi đầu của hai tế bào sẽ hình thành mấu lồi và
tiến sát nhau, hai tế bào sẽ tiếp hợp với nhau và hình thành một hợp tử, sau đó sẽ có quá
trinh phân phối nguyên sinh chất và nhân. Nhân của hợp tử phân chia thành 2,4,8 nhân
mới, mỗi nhân con cùng với một phần nguyên sinh chất tạo thành một túi bào t ử. Túi
bào tử gặp điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một tế bào nấm men mới.
Các enzyme của nấm men
1.4.3.3.
Để sinh trưởng và phát triển, nấm men phải sử dụng enzyme phân giải các nguồn
dinh dưỡng phức tạp như tinh bột, rỉ đường, dầu mỏ… thành đường và chuyển hóa vào
trong cơ thể dưới dạng cacbon và năng lượng duy trì sự sống, đồng thời tạo ra sản
phẩm sinh học trong sản xuất.
Enzyme Protease
•
Protease là một nhóm enzyme gồm hai loại peptidase và proteinase, chúng phân hủy
các liên kết phân tử protein thành polypeptide, pepton. Sau đó peptide phân tử nhỏ này
thủy phân thành các acid amin tự do có dưới tác dụng của peptidase. Các peptidase có
đặc hiệu hơn proteinase, chúng chỉ tác dụng lên peptide ở những vị trí nhất định.
Enzyme Amylase
•
Là hệ enzyme được chiết ra sớm nhất và được nghiên cứu nhiều từ trước đến nay.
Amylase được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, nông nghiệp và trong y học đ ể tạo
ra đường glucose, dextrin thực phẩm, thành phần bổ sung vào khẩu phần thức ăn trong
chăn nuôi, các thuốc hỗ trợ tiêu hóa, thủy phân đường để lên men sản xuất mì chính và
các sản phẩm khác.
Page 17
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
Amylase thuộc nhóm enzyme hydrolase xúc tác thủy phân lên kết glucoside trong tinh
bột và các sản phẩm tạo thành mà người ta chia nhóm thủy phân tinh bột ra làm nhi ều
loại, trong đó có ba loại enzyme phổ biến:
α-amylase (α-1,4glucan, 4-glucanhydrogenase)
−
β-amylase (α-1,4glucan maltohydrolase)
−
Gluco-amylase (γ-amylase)
−
Các enzyme khác nhau về tính đặc hiệu tác dụng đối với liên kết glucoside và một
số tính chất khác. Tùy thuộc vào mục đích thành phần mà người ta có thể s ử d ụng các
loại enzyme khác nhau.
Những ứng dụng của nấm men
1.4.4.
Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có khả năng sinh trưởng và phát triển
nhanh, các đặc điểm sinh lý phù hợp với sản xuất công nghiệp. Trong tế bào nấm men
chứa hầu hết các sản phẩm cần cho sự sống (protein, glucide, lipid, enzyme và các
vitamine, các acid nucleid, các chất khoáng). Từ những đặc điểm trên nấm men có rất
nhiều vai trò và được ứng dụng rộng rãi trong tất cả các lĩnh vực của đời sống.
Nhiều loại nấm men được sử dụng rộng rãi để nấu rượu, bia, sản xuất cồn,
glicerine và điều chế một số hóa chất khác.
Nấm men sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng chứa nhiều protein và vitamine.
Vì vậy nó được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp sản xuất thức ăn cho người
và gia súc. Nấm men được sử dụng làm nở bột mì, gây hương vị nước chấm, sản xuất
một số dược phẩm.
Tuy nhiên bên cạnh những nấm men có ích còn có những nấm men có hại cho người
và gia súc, hoặc có thể làm hư hỏng lương thực, thực phẩm.
Page 18
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng
Các chủng nấm men phân lập được từ quả táo mèo ( Docynia indica) và bánh men lá
của người dân tộc Churu.
Thời gian và địa điểm
2.1.2.
Đề tài được thực hiện từ 11/2011 – 05/2011 tại phòng thí nghiệm vi sinh – Khoa
Sinh học, trường Đại học Đà Lạt.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dụng cụ và thiết bị
2.2.1.
Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri.
•
Tủ cấy, que cấy, đèn cồn, dao cắt (loại nhỏ), kéo.
•
Tủ ấm.
•
Tủ sấy.
•
Page 19
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
- Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học SV 2011 – CSK32 GVHD:ThS. Nguyễn Khoa
Trưởng
Máy lắc ổn nhiệt.
•
Nồi hấp autoclave.
•
Nhiệt kế.
•
Cân kỹ thuật.
•
Máy đo pH, giấy quỳ tím.
•
Bông thấm nước, bông không thấm nước, giấy báo,vòng thun.
•
Túi dựng mẫu.
•
Hóa chất
2.2.2.
• Đường glucose
• Pepton
• KH2PO4
• MgSO4
• NaCl
• H2SO4
• Agar
• Thuốc nhuộm Xanh methylene
• Thuốc nhuộm Fuchsin
• Cồn 900, cồn 700, cồn 330.
Phương pháp phân lập nấm men
2.2.3.
2.2.3.1. Môi trường phân lập nấm men
Page 20
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN
nguon tai.lieu . vn