1. Trang Chủ
  2. Khoa học tự nhiên
  3. Đề tài: Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật và ứng dụng

Đề tài: Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật và ứng dụng

Thế kỷ 21 là thế kỷ của CNSH, nó sẽ xâm nhập vào mọi lĩnh vực của đời sống. Với sự tiến bộ vượt bật của khoa học ngày nay, ngày càng có nhiều sản phẩm cải tiến phục vụ cho cuộc sống được ứng dụng từ công nghệ sinh học. Điều này có thể thấy qua những kết quả nghiên cứu đã được công bố của các nước trên thề giới. Trong vòng 30 năm qua, chúng ta chứng kiến những thành tựu đáng kinh ngạc của sinh học và công nghệ sinh học cả trong nghiên cứu cơ bản lẫn nghiên cứu ứng dụng... Phạm văn thương –k20 .độ

Thể loại Tài liệu miễn phí Khoa học tự nhiên

Số trang 25

Ngày tạo 8/30/2018 1:56:52 AM +00:00

Loại tệp DOC

Kích thước 0.30 M

Tên tệp

Tải Đề tài: Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật và ứng d... (.docx) Tải Đề tài: Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật và ứng d... (.pdf)

Xem mẫu

  1. Phạm văn thương –k20 .động vật học PHẦN I: MỞ ĐẦU I. Đặt vấn đề: Thế kỷ 21 là thế kỷ của CNSH, nó sẽ xâm nhập vào mọi lĩnh vực của đời sống. Với sự tiến bộ vượt bật của khoa học ngày nay, ngày càng có nhiều sản phẩm cải tiến phục vụ cho cuộc sống được ứng dụng từ công ngh ệ sinh học. Điều này có thể thấy qua những kết quả nghiên cứu đã được công bố của các nước trên thề giới. Trong vòng 30 năm qua, chúng ta chứng kiến những thành tựu đáng kinh ngạc của sinh học và công nghệ sinh học cả trong nghiên c ứu c ơ b ản l ẫn nghiên cứu ứng dụng. Nó không chỉ thành công trong việc khám phá nh ững bí ẩn của sự sống giúp con người nhìn nhận bản ch ất th ế giới quan sinh h ọc rõ ràng minh bạch, mà sự thành công của sinh học và công ngh ệ sinh h ọc còn nằm ở chỗ nó tạo ra những sản phẩm chuyên về sinh – y – nông nghi ệp – công nghệ sinh học với đủ mọi cấp độ quy mô. Từ sự phát tri ển này, con người đã thừa hưởng nhiều thành quả không thể chối cãi: những công cụ chẩn đoán bệnh tật hiệu quả, các khuynh hướng giải quyết các vấn đề môi trường, nông nghiệp. Đi sâu hơn vào bản chất của sự thành công này, chúng ta không thể “quên ơn” những nghiên cứu từ trong phòng thí nghiệm. [2] Và nếu đặt câu hỏi “Công cụ nào trong phòng thí nghiệm đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu ?” Có thể dễ dàng tìm thấy câu tr ả l ời t ừ những nhà nghiên cứu sinh y công nghệ sinh học: tế bào và nuôi c ấy t ế bào là công cụ quan trọng hầu như không thể thiếu trong các nghiên cứu. Quả thật không thể nói hết công lao của tế bào và kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong nghiên cứu y sinh công nghệ sinh học ngày nay. Chỉ dám nói rằng: Không có chúng, sẽ không có ngành sinh học hiện đại và công nghệ sinh học. Tế bào độ ng vật tác h từ mô có t hể được nuô i cấ y trê n các lo ạ i mô i trường d inh dưỡ ng tổ ng hợp bê n ngoà i c ơ t hể, c húng s inh t rưởng bằ ng các h tă ng số lượng và k íc h t hước tế b ào. Kỹ t huậ t nuô i cấ y tế b ào độ ng vật đ ã tạ o cơ hộ i để nghiê n cứu các tế bào ung t hư, p hâ n loạ i các k hố i u ác t ính, mô hình t hực nghiệ m để k hảo sát tá c động c ủa hóa c hất, xác đ ịnh sự tươ ng hợp c ủa mô tro ng cấ y ghép và nghiê n cứ u các tế b ào đặc b iệ t c ùng sự tươ ng tác c ủa c húng. Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 1
  2. Phạm văn thương –k20 .động vật học Vấn đề nuôi cấy tế bào nói chung và nuôi cấy tế bào đ ộng v ật nói riêng đang ngày càng được dư luận thế giới quan tâm hết mức trên nhiều phương diện khác nhau, cả về lợi ích lẫn những tác hại có thể vô cùng to lớn mà hiện nay người ta chưa lường hết được. Nhằm bổ sung cho mình những kiến thức mới về kỹ thuật nuôi cấy tế bào cũng như xem xét những thành tựu mà kỹ thuật này đã đem lại, được sự hướng dẫn và cho phép của thầy giáo Ngô Đắc Chứng, tôi đã quy ết đ ịnh tìm hiểu về đề tài: “Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật và ứng dụng ”. Do thời gian hạn chế, chắc chắn đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót, mong quý thầy cô và bạn đọc thông cảm và góp ý để đề tài này được hoàn thiện hơn. II. Phương pháp tiếp cận và phạm vi của đề tài - Mặc dù hiện nay kỹ thuật nuôi cấy tế bào đã được thực hiện trên rất nhiều đối tượng khác nhau như vi sinh vật, thực vật, động vật th ậm chí c ả con người. Mỗi đối tượng khác nhau thì kỹ thuật nuôi cấy tế bào có s ự khác biệt lẫn nhau. Nhưng trong phạm vi của đề tài này chúng tôi ch ỉ xin trình bày về kỹ thuật nuôi cấy tế bào trên đối tượng động vật (bao gồm cả trên con người) và những ứng dụng của nó. - Để thực hiện đề tài này tôi đã sưu tầm thông tin, hình ảnh từ các nguồn khác nhau như giáo trình, bài giảng, tạp chí, các ph ương ti ện thông tin đ ại chúng, internet,… các tài liệu và hình ảnh sưu tầm được qua vi ệc phân tích so sánh từ nhiều nguồn để đảm bảo tính chính xác và tổng hợp thành bài vi ết này. Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 2
  3. Phạm văn thương –k20 .động vật học PHẦN II: NỘI DUNG I. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Kỹ thuật nuôi cấy tế bào là tổ hợp các thao tác kỹ thuật nhằm t ạo ra nh ững cơ quan, bộ phận hoặc cơ thể hoàn chỉnh từ một hay một s ố t ế bào ban đ ầu. Kỹ thuật này có sự khác nhau đối với các đối tượng khác nhau: Vi sinh vật, thực vật và động vật do đặc điểm riêng biệt của từng loại tế bào. 1. Tế bào động vật và cơ sở của việc nuôi cấy tế bào động vật Tế bào động vật trong cơ thể trưởng thành hầu như ít biểu hiện tính toàn năng, có quá trình chết theo chu trình, rất nhạy cảm với môi tr ường, t ốc độ sinh sản chậm,… vì thế rất khó để nuôi cấy một cơ th ể hoàn chỉnh t ừ một tế bào của cơ thể trưởng thành. Các tế bào động vật là t ế bào eukaryote, chúng được liên kết với nhau bởi các nguyên liệu gian bào để tạo thành mô. Mô động vật thường được phân chia theo 4 nhóm: biểu m ô (epitheli um), m ô liên kết (connective tissue), m ô cơ (muscle) và mô thần kinh (nerve). Biểu m ô tạo thành lớp phủ và lớp lót trên các bề mặt tự do của cơ th ể, c ả bên trong và bên ngoài. Ở mô liên kết, các tế bào thường được bao bọc trong th ể gian bào rộng (kéo dài), đó có thể là chất lỏng, hơi rắn hoặc rắn. Các tế bào mô cơ thường thon dài và được gắn với nhau thành m ột phiến ho ặc m ột bó bởi mô liên kết. Mô cơ chịu trách nhiệm cho hầu h ết chuyển động ở đ ộng vật bậc cao. Các tế bào mô t hần kinh gồm có thân t ế bào chứa nhân và m ột hoặc nhiề u phầ n m ở rộng dài và m ảnh được gọi là sợi. Các tế bào th ần ki nh được kích thich dễ dàng và tru yền xung động rất nha nh.[3] ́ 1.1. Các tế bào dịch huyền phù Tế bào hồng cầu và bạch huyết là các m ô liên kết không điển h ìn h dạng thể lỏng. Các tế bào máu hoặc dịch bạch huyết là các tế bào dịch huyền phù (suspension cells), hoặc không dính bám khi chung sinh trưởng trong nuôi ́ cây in vitro. Các tế bao không dinh bám không đòi hỏi bề mặt để sinh trưởng. ́ ̀ ́ Chẳng hạn, các tế bao bạch huyêt (lymphocytes) (Hình 1a) băt nguồn từ mô ̀ ́ ́ bạch huyêt là các tế bao không dinh bám và có hình cầu đường kinh từ 10-20 µm. ́ ̀ ́ ́ Chung có thể được nuôi cây trong môi trường dich lỏng theo phương thức tương ́ ́ ̣ tự vi khuẩn. 1.2. Cac tế bào dính bam ́ ́ Hầu hêt các tế bao đông vât bình thường là các tế bao dinh bám, vì thế chung ́ ̀ ̣ ̣ ̀́ ́ cần có bề mặt để găn vao và sinh trưởng. Trong các ứng dung, người ta sử dung ́ ̀ ̣ ̣ Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 3
  4. Phạm văn thương –k20 .động vật học rông rãi các loại tế bao dinh bám là tế bao biêu mô và nguyên bao sợi (fibroblast) ̣ ̀ ́ ̀ ̉ ̀ (Hình 1b và c). Các tế bao dinh bám cần có môt bề mặt ẩm để sinh trưởng như là ̀́ ̣ thuy tinh hoặc plastic. Đĩa petri hoặc các chai truc lăn là các loại được sử dung ̉ ̣ ̣ rông rãi nhât. Các chai được đặt nằm trên môt truc lăn quay tròn châm trong tủ ̣ ́ ̣ ̣ ̣ âm. Chai có dung tich 1 l chứa khoảng 100 ml môi trường là thich hợp cho các tế ́ ́ ́ bao vừa sinh trưởng trên thanh chai vừa tiêp xuc với môi trường và không khi. ̀ ̀ ́ ́ ́ Tuy nhiên, chai truc lăn chỉ dung cho quy mô phòng thí nghiệm vì diện tich bề ̣ ̀ ́ mặt trên môt đơn vị thể tich cua chai nuôi cây khá nhỏ (500 cm /l). ̣ ́ ̉ ́ 2 Hình 1: Các tế bào động v ật thường được sử dụng trong nuôi cấy. (a) tế bao bạch huyêt, (b) tế bao biêu mô, (c) nguyên bao sợi ̀ ́ ̀ ̉ ̀ Tỷ lệ diện tich/thể tich có thể được tăng lên khi các tế bao sinh trưởng trên ́ ́ ̀ các giá thể là polymer bot biên (spongy), thể gốm (ceramic), các sợi rỗng, bao vi ̣ ̉ thể (microcapsule), hoặc trên các hạt nhỏ có kich thước hiên vi goi là ́ ̉ ̣ microcarrier.[3] 2. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Năm 1907, Harrison là người đầu tiên đã nuôi cấy thành công một m ảnh mô phôi ếch trong dịch bạch huyết với kỹ thuật “giọt treo” (Hanging drop). Năm 1923, Carel đã hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong các bình th ủy tinh (in vitro), dễ tiệt trùng và tạo điều kiện cho t ế bào phát tri ển t ốt. Nh ưng phải chờ đến những năm 1960, khi hoàn thiện được môi trường nuôi cấy nhân tạo thì kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật m ới đ ược phát tri ển m ạnh và được ứng dụng vào nhiều ngành công nghệ sinh học.[5] 2.1. Môi trường nuôi cấy Vấn đề quan trọng bậc nhất trong nuôi cấy tế bào động vật là môi trường nuôi cấy phải đủ chất dinh dưỡng, nhân tố sinh trưởng, độ pH và nồng độ muối ổn định, đồng thời phải có hệ thống thải bỏ các sản phẩm trao đổi độc hại để tế bào có thể sống và phát triển được. Nhu cầu dinh dưỡng cua các tế bao đông vât lớn hơn vi sinh vât do, không giống các vi sinh vât, ̉ ̀ ̣ ̣ ̣ ̣ đông vât không trao đôi chât nitrogen vô cơ. Vì thê, nhiều amino acid va ̀ ̣ ̣ ̉ ́ ́ Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 4
  5. Phạm văn thương –k20 .động vật học vitamin cần phải được bổ sung vao môi trường. Môi trường đặc trưng dung ̀ ̀ trong nuôi cây tế bao đông vât bao gồm các amino acid, các vitamin, các ́ ̀ ̣ ̣ hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối khoáng và glucose. Ngoai ra, môi ̀ trường cần được cung câp từ 2-20% (theo thể tich) huyêt tương cua đông vât ́ ́ ́ ̉ ̣ ̣ có vu. Mặc dù huyêt thanh có thanh phần chưa được xác đinh đầy đu, nhưng ́ ́ ̀ ̣ ̉ nhiều nghiên cứu đã cho thây nó rât cần thiêt cho sự phát triên và tồn tại cua tế ́ ́ ́ ̉ ̉ ̀ ́ bao trong nuôi cây. 2.1.1. Môi trường hóa chất Huyêt thanh dung trong môi trường nuôi cây không chỉ đăt tiền mà còn la ̀ ́ ̀ ́ ́ nguồn nhiễm bẩn virus và mycoplasma. Do bản chât hóa hoc cua huyêt thanh ́ ̣ ̉ ́ chưa được xác đinh đầy đủ nên trong môt số trường hợp có thể ảnh hưởng ̣ ̣ xâu đên kêt quả nuôi cây. Sự hiện diện cua nhiều protein khác nhau trong ́ ́ ́ ́ ̉ huyêt thanh cung có thể lam phức tạp các quá trình phân tách va ̀ tinh s ạch đ ầu ́ ̃ ̀ ra. Vì lý do đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xây dựng công th ức môi trường không có huyêt thanh. Những công thức nay chứa các hormone và ́ ̀ các nhân tố sinh trưởng được tinh sạch để thay thế cho huyêt thanh. ́ Môi trường hóa chất được sáng chế từ những năm 1950 đã thay thế hoàn toàn cho các dịch sinh học như dịch chiết từ phôi gà, huyết tương,… Môi trường hóa chất được điều chế hàng loạt, cất giữ được lâu, dễ thay thế, thêm, bớt các chất cần thiết, ít bị lây nhiễm… Môi trường nuôi cấy có chứa đủ các chất dinh dưỡng (Cacbonhydrat, acid amin, vitamin, nguyên tố vi lượng, hormon, nhân tố sinh trưởng). Hiện nay, người ta dùng m ột s ố môi trường nuôi cấy như môi trường Eagle, môi trường Dulbecco,… Môi trường nuôi cấy phải đẳng trương để duy trì cân bằng áp suất th ẩm thấu. Người ta thường dùng bicacbonat để tạo hệ đệm kết hợp với h ệ làm giàu CO2 môi trường (5-10% CO2/95% không khí) trong đó tế bào được nuôi. Độ pH thích hợp là 7,4. Người ta thường sử dụng đỏ phenol để kiểm tra độ pH của môi trường, nếu môi trường chuyển dần từ đỏ sang vàng cam thì tế bào phát triển tốt, nếu chuyển sang vàng nhạt là môi trường bị nhiễm khuẩn. 2.1.2. Nhân tố sinh trưởng Nếu không có nhân tố sinh trưởng thì tế bào động vật sẽ không phát triển. Người ta thường phải bổ sung huyết thanh bê vào môi trường nuôi c ấy (10-15%) vì trong huyết thanh có chứa nhân tố sinh trưởng. Nh ưng dùng Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 5
  6. Phạm văn thương –k20 .động vật học huyết thanh vừa đắt tiền lại vừa dễ bị nhiễm khuẩn cho nên ngày nay ng ười ta thường dùng các chất bổ trợ để thay thế cho huyết thanh như: insulin, transferin, ethanolamin,… hoặc sử dụng lớp tế bào nuôi. 2.1.3. Các chất kháng sinh Các chất kháng sinh như penecillin, streptomicin hoặc amphotericin B thường được dùng để chống nhiễm khuẩn cho mẻ cấy. Tuy nhiên, các chất kháng sinh thường độc vì vậy phải dùng với liều lượng thích hợp và ph ải k ết hợp với quy trình tiệt trùng chu đáo.[2] Bảng 1. Thanh phần môi trường Eagle (1959).[3] ̀ Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 6
  7. Phạm văn thương –k20 .động vật học Hình 1: Môi trường nuôi cấy (*Nguồn: Website của ĐH Nông nghiệp 1 Hà Nội) 2.2. K ỹ thuật nuôi cấ y tế bào động v ật Phương pháp chinh trong nuôi cây tế bao đông vât có vú để sản xuât các ́ ́ ̀ ̣ ̣ ́ sản phẩm sinh - dược là dựa trên cơ sở nuôi cây dich huyền phu ̀ trong h ệ lên ́ ̣ men. Từ lâu, hệ lên men đã được sử dung trong nuôi cây vi khuẩn va ̀ nâm ̣ ́ ́ men. Đầu tiên, sự lên men là thuât ngữ dung cho sản xuât cồn. Sau đó, các nha ̀ ̣ ̀ ́ vi sinh vât hoc ứng dung các nguyên tăc trên để tách chiêt các vitamin, các acid ̣ ̣ ̣ ́ ́ hữu cơ và các kháng sinh… Kêt quả dân đên sự phát triên nhanh chóng các ́ ̃ ́ ̉ phương pháp và các hệ thống lên men khác nhau. Các nguyên lý tương tự sau đó được ứng dung cho nuôi cây sinh khối tế ̣ ́ bao đông vât và thực vât. Tuy nhiên, nuôi cây các tế bao đông vât và thực vât ̀ ̣ ̣ ̣ ́ ̀ ̣ ̣ ̣ khó khăn hơn nhiều so với vi sinh vât, cái chinh là do quá trình trao đôi chât ̣ ́ ̉ ́ trong các loại tế bao nay diễn ra châm, điều nay cung phản ánh tốc độ sinh ̀ ̀ ̣ ̀ ̃ trưởng châm cua tế bao. Các tế bao đông vât có nhu cầu dinh d ưỡng ph ức t ạp ̣ ̉ ̀ ̀ ̣ ̣ hơn so với vi khuẩn và nâm men, chung không có thanh tế bao như vi khuẩn vì ́ ́ ̀ ̀ thế rât dễ biên dạng và vỡ. Do đó, các hệ thống khuây và suc khí được thiêt kế ́ ́ ́ ̣ ́ khác với nuôi cây vi khuẩn. Mặc dù có môt số điêm không thuân lợi, nhưng ́ ̣ ̉ ̣ hệ thống lên men đã được sử dung để nuôi cây tế bao đông vât it nhât cung vai ̣ ́ ̀ ̣ ̣́ ́̃ ̀ chuc năm trước đây. Các dòng tế bao khác nhau như BHK-21, LS, các tế bao ̣ ̀ ̀ Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 7
  8. Phạm văn thương –k20 .động vật học Namalwa… đã được sinh trưởng trong hệ lên men theo phương th ức nuôi cây ́ chìm ngâp trong môi trường để sản xuât các viral vaccine và các sản ph ẩm ̣ ́ khác. Đặc điêm dễ biên dạng và dễ vỡ cua tế bao đông vât đã được khăc phuc ̉ ́ ̉ ̀ ̣ ̣ ́ ̣ bằng cách đưa vao các cánh khuây có dạng hình mái chèo. Việc cung câp khí ̀ ́ ́ trực tiêp có thể tạo ra bot khí dễ lam vỡ tế bao, vì thế cần cung câp khí bằng ́ ̣ ̀ ̀ ́ cách khuêch tán thông qua ống silicone. Môi trường chứa nhiều protein huyêt ́ ́ thanh có khả năng gây ra hiện tượng tạo bot nên cần khuây châm và nh ẹ. Đ ối ̣ ́ ̣ với nuôi cây mât độ cao, cần cung câp thêm oxygen. Phương pháp dung ống ́ ̣ ́ ̀ silicone để suc khí có nhiều ưu điêm do không tạo ra bot khi ́ va ̀ t ốc đô ̣ truy ền ̣ ̉ ̣ oxygen là thỏa đáng. Như vây, các hệ lên men vi sinh vât được cải tiên thich hợp có thể dung ̣ ̣ ́ ́ ̀ để nuôi cây sinh khối các tế bao đông vât sinh trưởng trong dich huyền phu. ́ ̀ ̣ ̣ ̣ ̀ Nêu muốn nuôi cây môt dòng tế bao dinh bám thì nên dung môt h ệ th ống chât ́ ́ ̣ ̀ ́ ̀ ̣ ́ mang như là microcarrier. Các dòng tế bao đông vât có vú thường được sử dung trong nuôi cây là ̀ ̣ ̣ ̣ ́ CHO4, NS05, BHK6, HEK-2937 và tế bao võng mạc cua người. ̀ ̉ Người ta có thể sử dụng tế bào tự do (bạch cầu, limpho,…) hoặc t ế bào của mô để nuôi cấy. Mô được phẩu thuật trong môi trường vô trùng, cắt thành mảnh nhỏ và được xử lý bằng enzyme kết h ợp với kỹ thuật nghi ền mô để tách thành tế bào riêng biệt ở dạng huyền phù. Trong môi trường nuôi cấy, các tế bào tự do thường ở dạng huyền phù, còn tế bào mô th ường bám vào đáy bình thành lớp. Người ta sử dụng buồng đếm hoặc máy đ ếm t ự động đ ể tính toán số lượng tế bào theo từng giai đoạn phát triển. Người ta có thể thực hiện các mẻ cấy liên tục bằng cách trích m ột ph ần mẻ cấy trước để cấy chuyền vào môi trường mới, nếu là mẻ bám thì ph ải sử dụng enzyme để tách riêng tế bào và phải làm rất nhanh trong vòng 15 phút vì enzyme có thể gây hại cho tế bào.[2] 2.2.1. Nuôi cấy sơ cấp Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi cấy tế bào trực tiếp từ mô trước l ần cấy chuyền đầu tiên (subculture). Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đầu thường là một hỗn h ợp các dòng tế bào khác nhau, hoặc chứa một kiểu tế bào trội nhất, trong đó có những tế bào quan tâm và những tế bào khác (được gọi là t ế bào nhi ễm). Có thể loại bỏ các tế bào nhiễm bằng cơ học hay enzyme khi tách mô hay b ằng Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 8
  9. Phạm văn thương –k20 .động vật học cách duy trì các điều kiện chọn lọc dương tính cho sự sống sót c ủa m ột ki ểu tế bào quan tâm cần thu nhận. Thu nhận mẫu mô Cắt nhỏ (Chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết) Cắt nhỏ Tách TB bằng cơ Tách TB bằng enzyme (Mảnh nhỏ để học (ủ,…) (nghiền, ép) nuôi) Trypsin lạnh Trypsin ấm Collagenase Nuôi mẫu mô sơ cấp Li tâm Tái huyền phù Nuôi sơ cấp Thu nhận tế bào mới Cấy chuyền Nuôi mảnh mô thứ cấp Dòng tế bào Hình 2: Sơ đồ nuôi cấy sơ cấp (*Nguồn:CNSH trên người và động vật ) Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 9
  10. Phạm văn thương –k20 .động vật học Qui trình nuôi cấy sơ cấp gồm: - Bước 1: Thu nhận mô (tươi hoặc đông lạnh) có chứa tế bào sống. - Bước 2: Phẫu tích và (hoặc) tách rời tế bào, xác định nồng độ. - Bước 3: Nuôi cấy tế bào. 2.2.1.1. Thu nhận mẫu và xử lý sơ bộ Các mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kỳ mô nào của cơ thể, trước khi lấy phải làm sạch mô tại vị trí lấy, đưa mô vào b ảo quan trong dung d ịch DPBS, nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm. Xử lí mẫu sơ bộ bao gồm rửa nhiều lần bằng dung dịch PBS có bổ sung kháng sinh, kháng nấm, sau đó cắt bỏ các phần mô ch ết, phần th ừa,… m ẫu mô cần được cắt nhỏ thành từng mảnh 2-3 mm2 2.2.1.2. Tách rời các tế bào Có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như: - Tách tế bào bằng cơ học: nghiền, ép - Tách tế bào bằng cách ủ với enzyme trypsin hay collagenase - Tách tế bào bằng phương pháp li tâm theo gradient tỷ trọng - Tách tế bào bằng phương pháp dựa vào marker bề mặt. Kết quả của giai đoạn này thu được dịch tách tế bào. 2.2.1.3. Nuôi cấy - Dùng pipetman hút vào bốn eppendorf, mỗi cái 1 ml dịch tách tế bào. - Li tâm 1000 vòng/ph trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi. - Cho vào mỗi eppendorf 1 ml môi trường nuôi, huyền phù tế bào bằng vortex. - Hút dịch huyền phù tế bào ở bốn eppendorf cho vào m ột bình nuôi c ấy (bình Roux) và bỏ sung 1ml môi trường. - Ủ ở 37,50C trong tủ nuôi, sau 24h thay môi trường mới và tiếp tục ủ. Sau lần nuôi cấy sơ cấp sẽ thu được các tế bào sơ cấp. Đối với trường hợp lượng mẫu mô quá ít, người ta nuôi cấy nguyên mảnh mô để thu nh ận t ế bào sơ cấp.[4] 2.2.2. Đời sống tế bào động vật trong nuôi cấy Tế bào mô động vật, đặc biệt là động vật có vú có đ ặc đi ểm là khi nuôi cấy, dù là cấy chuyền chỉ qua được 50 thế hệ, sau đó chúng thoái hóa và ch ết. Số thế hệ tế bào tùy thuộc vào độ biệt hóa của mô mà ta l ấy t ế bào. Đ ối v ới Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 10
  11. Phạm văn thương –k20 .động vật học tế bào gốc thì khả năng sinh trưởng sẽ dài hơn so với t ế bào bi ệt hóa, t ế bào gốc phôi có khả năng sinh trưởng dài hơn tế bào gốc cơ thể trưởng thành. Tuy vậy, người ta đã tạo ra được các dòng tế bào “bất tử” tức là t ế bào có khả năng sinh trưởng liên tục trong môi trường cấy chuyền. Đó chính là các tế bào ung thư của cơ thể hoặc là dạng tế bào được làm chuyển dạng “ung thư hóa” với những biến đổi di truyền. Sự chuyển dạng thường được th ực hiện nhờ tác nhân gây đột biến, nhờ virut, nhờ gen ung thư,… Ngày nay, người ta đã nuôi cấy và cất giữ nhiều dòng tế bào “b ất tử” nhân t ạo nh ư các dòng tế bào chuột, chuột Hamster TQ, khỉ,… hoặc lấy từ cơ thể từ các mô ung thư tế bào Hela (tế bào ung thư cổ tử cung) hay tế bào Namalwa (t ế bào ung thư limphoma của một phụ nữ có tên là Namalwa). 2.2.3. Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy. Sự sinh trưởng của tế bào động vật in vitro thường trải qua 3 pha: - Pha chậm (Lag phase) là giai đoạn khi tế bào được đ ưa vào môi tr ường nuôi cấy cho đến khi tế bào bắt đầu phát triển. Thời gian này dài hay ng ắn tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô được trích tế bào. - Pha tiến triển (exponential phase) là giai đoạn tế bào phân chia liên t ục, tăng nhanh số lượng tế bào trong khoảng thời gian từ 15 – 25 giờ với số lượng tế bào đạt 1-2 x 106/cm3, là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ. - Pha dừng (Stationary phase) là giai đoạn sau pha ti ến tri ển, trong đó s ố lượng tế bào không thay đổi, tức là khi môi trường dinh d ưỡng nghèo d ần và bắt đầu tích lũy các sản phẩm trao đổi chất độc h ại. Bắt đ ầu xu ất hi ện t ự hoại tế bào thể hiện ở chổ nhân bị đứt chẻ và trên bề mặt tế bào tạo thành các mảnh khối có thể quan sát được dưới kính hiển vi. Muốn cho t ế bào ti ếp tục sinh trưởng cần thực hiện các mẻ cấy chuyền với môi trường mới. 2.2.4. Các phương thức nuôi cấy Phương thức nuôi cấy đơn giản nhất là nuôi cấy theo mẻ (batch culture), trong đó tế bào được nuôi vài ngày cho tới khi sinh trưởng dừng lại. Đây là hệ thống nuôi cấy kín vì không cho thêm gì vào và cũng không l ấy t ừ môi tr ường ra một chất gì. Điều kiện chuẩn: mật độ tế bào trong môi trường là 10 5/cm3 và nuôi trong 3 ngày cho tới khi mật độ tế bào đạt 10 6/cm3. Trong khi nuôi cấy phải khuấy lắc để huyền phù tế bào và chất dinh dưỡng phân bố đều trong môi trường. Tuy nhiên, môi trường sẽ nghèo dần ch ất dinh dưỡng và tích lũy Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 11
  12. Phạm văn thương –k20 .động vật học nhiều chất độc (sản phẩm chuyển hóa của tế bào) do đó t ế bào s ẽ đi vào thoái hóa. Người ta có thể kéo dài thời gian nuôi cấy b ằng cách b ổ sung thêm chất dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy theo thời gian để tế bào tiếp tục tăng sinh, nhưng đến một thời gian nh ất định, sinh tr ưởng s ẽ d ừng l ại vì môi trường đã tích lũy quá nhiều chất độc như amoniac hay lactat,… Để giải quyết vấn đề trên người ta tiến hành phương thức nuôi cấy liên tục (continuous culture), trong đó môi trường luôn được đổi mới và các ch ất độc luôn được loại bỏ tương tự như trong cơ thể. Có hai cách nuôi cấy liên tục: Cách thứ nhất là dùng hệ thống tiếp liệu chất dinh d ưỡng nh ưng v ẫn duy trì tế bào trong mẻ cấy cho đến khi số lượng tế bào đạt 10 7/cm3. Cách thứ hai là đồng thời có thêm hệ thống rút bớt môi trường cùng với t ế bào ra khỏi mẻ cấy, như vậy hệ số tăng trưởng tế bào sẽ tỷ lệ với hệ số đổi mới dòng chảy vào và ra. Một hệ cân bằng như vậy được gọi là h ệ ổn hóa (chemostat), là một dạng nồi lên men dùng để nuôi cấy liên tục.[2,5] II. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 1. Nuôi cấy và tạo tế bào lai soma động vật 1.1. Tế bào lai soma Như đã biết in vivo, sự tạo thành tế bào lai soma là vô cùng hiếm. Tuy nhiên in vitro người ta có thể nuôi cấy các loại tế bào của cùng một mô, c ủa các mô khác nhau trong cùng một cơ thể, của các cơ thể khác nhau trong cùng một loài, thậm chí người ta có thể nuôi cấy các tế bào giữa các loài khác xa nhau để tạo nên tế bào lai soma (hybridoma) Năm 1960, lần đầu tiên, các tác giả Barski, Sorieul, Cornefert thông báo là đã tạo được tế bào lai soma in vitro khi nuôi c ấy trộn l ẫn các t ế bào sarcoma của chuột thuộc hai dòng khác nhau. Các dòng tế bào nuôi c ấy khác bi ệt nhau ở nhiều đặc điểm: Khả năng tạo thành u khi tiêm chúng vào chuột mang tính tương hợp mô và số lượng, hình thái nhiễm sắc thể của chúng cũng khác nhau. Khi tế bào lai được hình thành từ các tế bào cùng một khởi ngu ồn, thì t ế bào lai được gọi là tế bào đồng nhân (Homocaryon – lai giả), còn khi các t ế bào lai được nuôi cấy thuộc các cơ thể khác nhau về bậc phân loại khác nhau ta thu được tế bào lai dị nhân (Heterocaryon – lai thật). Nh ư vậy, theo nghĩa đúng đắn thì heterocaryon mới thực sự là tế bào lai (hybridoma). Khi nuôi c ấy Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 12
  13. Phạm văn thương –k20 .động vật học trộn lẫn các tế bào thuộc hai loài khác nhau người ta vẫn có thể thu được t ế bào lai một cách ngẫu nhiên nhưng xảy ra với tần s ố rất th ấp. Vì v ậy, đ ể thu được tế bào lai dễ dàng với tần số cao hơn người ta thường phải sử dụng các nhân tố kích thích, thông thường người ta dùng hóa chất hoặc virut làm nhân tố kích thích. Một số virut được sử dụng làm nhân tố kích thích đã trở nên phổ biến là các virut chứa ADN (nhóm virut Herpes, virut đậu mùa,…), các virut chứa ARN (virut lợn, virut Niucatson, virut Sendai,…) hoặc các virut gây ung thư (virut Sarcoma Rous),… 1.2. Đặc tính của tế bào lai soma - Sự hoạt hóa của nhân: + Khi lai các tế bào mang nhân hoạt hóa nh ư limpho bào c ủa chuột, t ế bào ung thư Hela của người với tế bào mang nhân bất hoạt ví dụ t ế bào h ồng cầu của gà, người ta thu được tế bào lai có chứa nhân lai ở trạng thái hoạt hóa, trong đó các gen của hồng cầu gà trước đây bất hoạt nay đã tr ở nên ho ạt hóa, tổng hợp ARN và protein đặc trưng cho gà. + Khi sử dụng tế bào nhân bất hoạt nhưng ở mức độ vừa ph ải so v ới nhân hồng cầu gà, ví dụ đại thực bào chẳng hạn (bình thường các đại thực bào không tổng hợp ADN và tế bào ở giai đoạn biệt hóa G1, chúng chứa hạch nhân nhỏ và tổng hợp ít ARN). Khi nuôi cấy các đại thực bào (của chuột hoặc thỏ) với các tế bào hoạt hóa như tế bào Hela hoặc tế bào melanom của người, sẽ tạo nên các tế bào lai heterocaryon, trong đó nhân đại thực bào tăng cao th ể tích và chúng tổng hợp ARN tăng 4-10 lần so với bình thường ch ỉ 1 giờ sau dung hợp và 3 giờ sau xảy ra tổng hợp ADN. Điều này chứng tỏ so với nhân hồng cầu gà, nhân đại thực bào bất hoạt ở mức thấp hơn. + Khi nghiên cứu tiến trình tổng hợp các ARN và ADN trong tế bào lai giữa đại thực bào và tế bào melanom, người ta đã chứng minh sự tổng hợp ADN trong nhân đại thực bào không phụ thuộc vào sự tổng hợp ARN và protein trong nhân đại thực bào mà phụ thuộc vào các nhân tố đến từ tế bào chất của tế bào melanom. + Khi lai tế bào soma với tinh trùng thì nhân của tinh trùng tồn t ại trong tế bào lai rất lâu (vài tháng) và vẫn ở trạng thái bất hoạt, nhưng khi đem lai tinh tử với tế bào soma (ví dụ đem tinh tử của chuột cống lai với t ế bào soma của chuột nhắt) thì tạo nên các tế bào lai có khả năng phân chia. Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 13
  14. Phạm văn thương –k20 .động vật học + Khi đem trứng chưa thụ tinh của chuột nhắt lai với các t ế bào soma khác nhau như tế bào chuột cống, khỉ hoặc người thì sẽ tạo nên t ế bào lai và tế bào này có thể phát triển tới giai đoạn phôi dâu. - Sự thụ tinh là sự dung hợp giữa tinh trùng và trứng để tạo nên hợp t ử chứa cả hai nhân – có thể được xem như một tế bào lai giữa hai tế bào đơn bội cùng nguồn hoặc đôi khi khác loài xảy ra in vivo, trong ống d ẫn r ứng c ủa con cái hoặc ở phần nào đó trong xoang bụng ngoài ống dẫn trứng là đã được chương trình hóa trong bộ gen của sinh vật. Trong nuôi cấy in vitro, để thực hiện được sự thụ tinh giữa tinh trùng và trứng thì tinh trùng phải được xử lý để làm thay đổi tính chất sinh lý, được gọi là kh ả năng hóa (capacitation), nhưng khi sử dụng virut Sendai để kích thích thì không cần kh ả năng hóa v ẫn thực hiện được sự thụ tinh. - Sự điều hòa tổng hợp ADN và ARN trong tế bào lai: Khi sử dụng các dạng tế bào soma có đặc tính hoạt hóa hay bất hoạt khác nhau về tổng h ợp ADN và ARN trong nhân để tạo tế bào lai, thấy rằng: + Tế bào có hoạt tính càng cao tham gia vào tế bào lai sẽ kích thích nhân tế bào không có hoạt tính, hoặc có hoạt tính th ấp tổng h ợp ADN và ARN càng tích cực hơn (trừ trường hợp tế bào ít hoạt tính có kích thước lớn h ơn nhiều so với tế bào hoạt tính cao, hoặc khi tế bào heterocaryon được tạo thành từ các tế bào quá già). + Nhân không có hoạt tính hoặc hoạt tính th ấp s ẽ đạt mức tổng h ợp ADN và ARN như ở nhân có hoạt tính. Tín hiệu phát động sự tổng hợp ADN và ARN đến t ừ t ế bào ch ất c ủa t ế bào có hoạt tính cao và không mang tính đặc trưng mô hoặc loài. + Cơ chế và nguyên tắc điều hòa sự tổng hợp ADN và ARN di ễn ra trong tế bào lai tương tự như ở tế bào bình thường. Nhiều gen là bất hoạt trong các tế bào không có hoạt tính vẫn giữ trạng thái bất hoạt trong tế bào lai chứng tỏ chúng không mang tính ngược chiều, nhưng nhiều gen bất hoạt đã trở lại hoạt động trong tế bào lai ch ứng tỏ chúng có tính ng ược chi ều. Những công trình cấy ghép nhân hoặc nhân bản vô tính t ừ t ế bào soma ch ứng tỏ tùy loại tế bào, tùy mức độ và giai đoạn biệt hóa mà tính ng ược chi ều c ủa hoạt động gen thể hiện khác nhau từ các gen riêng lẻ, các h ọ gen hay toàn b ộ genom. Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 14
  15. Phạm văn thương –k20 .động vật học - Biến đổi của bộ nhiễm sắc thể trong tế bào lai: Phân tích b ộ nhi ễm sắc thể của tế bào lai có tầm quan trọng trong việc xác định các t ế bào dung hợp có thực sự là tế bào lai hay không và cho phép ta nghiên cứu nhi ều v ấn đề về cấu trúc, tập tính của nhiễm sắc thể như là cấu trúc hiển vi chứa thông tin di truyền của tế bào. Bằng phương pháp đánh dấu nhiễm sắc thể và phương pháp tế bào học khác như xây dựng kiểu nhân, nhuộm c ắt băng cũng như phương pháp lai ADN… người ta đã làm sáng tỏ nhi ều v ấn đ ề di truy ền và biến dị của tế bào lai soma. + Trong tế bào lai khác loài, khi 2 bộ nhiễm sắc th ể của 2 t ế bào bố m ẹ kết hợp lại với nhau sẽ xảy ra sự biến mất một số nhiễm sắc th ể của một trong hai bộ hoặc của cả hai bộ nhiễm sắc thể. Ví dụ: Khi lai giữa t ế bào người và chuột nhắt thì bộ nhiễm sắc thể của người sẽ bị mất, lai giữa chuột nhắt và chuột cống thì cả hai bộ nhiễm sắc thể cùng đều bị mất một số nhiễm sắc thể. Sự giữ lại hoặc loại thải nhiễm sắc thể nào trong bộ nhiễm sắc thể bố mẹ trong tế bào lai xảy ra không phải ngẫu nhiên mà ch ắc chắn tuân theo các cơ chế tương tác giữa hai bộ gen trong trạng thái tế bào ch ất chung của tế bào lai và với môi trường nuôi cấy in vitro. + Trong tế bào lai xảy ra sự biến đổi cấu trúc nhiễm s ắc th ể. Các t ế bào bố mẹ được sử dụng để tạo tế bào lai có thể ở các giai đoạn khác nhau c ủa chu kỳ tế bào, khi các tế bào bố mẹ dung hợp tạo thành tế bào lai chứa một nhân dung hợp thống nhất với hai hoặc vài bộ nhiễm sắc th ể, th ường quan sát thấy sự biến đổi cấu trúc trong các nhiễm sắc thể như sự đông đặc hóa, đứt đoạn,… Các nhiễm sắc thể bị đông đặc hoặc đứt mảnh sẽ bị loại thải qua các kỳ phân bào của tế bào lai. - Sự biểu hiện của gen thành các tính trạng kiểu hình ở tế bào lai: + Khi ta cho lai hai loại tế bào soma khác loài in vitro ta thu đ ược t ế bào lai heterocaryon chứa hai nhân hoặc vài nhân riêng bi ệt, v ề sau các nhân trong heterocaryon dung hợp tạo nên một nhân độc nhất ch ứa tổ h ợp các b ộ nhi ễm sắc thể trong một tế bào lai được gọi là syncaryon. Các heterocaryon có thể tồn tại rất lâu hoặc chết đi hoặc biến thành syncaryon. Người ta theo dõi số phận và đời sống của các tế bào lai qua các đặc tính như biểu hiện của h ệ gen thành các tính trạng kiểu hình để đánh dấu, chủ yếu là tổng hợp protein, các enzyme, sự tạo thành các siêu cấu trúc, s ự bi ệt hóa t ế bào v ề hình thái và Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 15
  16. Phạm văn thương –k20 .động vật học một số đặc tính sinh lý, sinh hóa khác như phản ứng với các tác nhân kích thích, sự sinh sản và phát triển,… + Sử dụng các kiểu đánh dấu ta có thể theo dõi sự biểu hi ện c ủa các gen trong nhiễm sắc thể thường, hoặc các gen trên nhiễm sắc thể giới tính, đặc biệt là nhiễm sắc thể X. + Để nghiên cứu quá trình biệt hóa tế bào lai, người ta thường sử dụng tế bào bố mẹ, đặc biệt là các tế bào ung thư hoặc các tế bà của các ch ủng quần biệt hóa cao, ổn định như limpho, tế bào sợi, tế bào gốc hồng cầu,… Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật không chỉ được phục vụ cho nghiên cứu về di truyền học, tế bào học, sinh lý học, phân loại học,… mà còn ph ục vụ cho công nghệ tế bào.[2] 2. Công nghệ nhân bản vô tính động vật Nhân bản vô tính là thuật ngữ được dùng để chỉ quá trình hình thành cơ thể đa bào không bằng con đường sinh sản hữu tính tự nhiên mà thông qua s ự phát triển của tế bào soma bằng cách phân bào nguyên nhiễm và biệt hóa tế bào thành cơ thể trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Đối với đa s ố đ ộng v ật sinh sản hữu tính thì kỹ thuạt nhân bản có nhiều thủ thuật đặc biệt. 2.1. Kỹ thuật chuyển nhân: Trong nhân của tế bào soma có chứa 2n NST, chứa hệ gen quy định nên tất cả các tính trạng của cơ thể giống như bộ NST của hợp t ử. Qua quá trình phát triển, từ hợp tử sẽ phân bào và biệt hóa để cho ra các t ế bào và mô khác nhau. Quá trình biệt hóa là thể hiện sự hoạt động biệt hóa trong hệ gen theo thời gian và không gian của phôi đang phát triển dưới sự kiểm soát của các yếu tố nội bào và ngoại bào. Nhân còn ít biệt hóa thì càng có nhi ều ti ềm năng biệt hóa, vì vậy sử dụng tế bào gốc để nhân bản vô tính là d ễ th ực hi ện h ơn so với tế bào đã biệt hóa. Bình thường người ta tách nhân từ tế bào cho (tế bào soma) và đem cấy chuyển vào tế bào trứng chưa thụ tinh đã bị lấy hoặc hủy nhân để tạo nên một tế bào 2n giống như hợp tử chứa nhân của tế bào soma và tế bào chất của tế bào trứng. Vì nhân 2n của tế bào cho đã bi ệt hóa đến một mức độ nhất định nào đó do tế bào chất của nó quy định phù hợp với thời gian và không gian phát triển của phôi. Khi nhân này đ ược c ấy chuy ển vào tế bào chất của trứng là môi trường giống với h ợp t ử thì nhân s ẽ tái bi ệt Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 16
  17. Phạm văn thương –k20 .động vật học hóa trở lại trạng thái như nhân của hợp tử và h ệ gen c ủa nó s ẽ ho ạt hóa theo đúng chương trình phát triển do các nhân tố của trứng điều khiển. Những thành công của nhân bản vô tính bằng cấy nhân được thực hiện ở ếch, bằng cách sử dụng nhân của các tế bào soma lấy ở giai đo ạn phôi. Năm 1952, lần đầu tiên, hai nhà khoa học tai Philadelphia là R. Briggs và T. King đã nhân bản vô tính con nòng nọc bằng kỹ thuạt chuyển c ấy nhân t ừ t ế bào phôi nang ếch. Từ những năm 1960, J. Gordon đã nhân bản vô tính thành công con ếch trưởng thành từ nhân tế bào ruột nòng nọc và về sau là từ nhân của t ế bào ruột ếch. Đến nay người ta đã thành công trong việc nhân b ản vô tính nhiều động vật như cá và cả động vật có vú.[2] 2.2. Nhân bản vô tính động vật có vú Đối với động vật có vú là động vật thụ tinh trong và phôi phát triển trong dạ con của mẹ dưới sự nuôi dưỡng qua nhau thai. Vì vậy, kỹ thu ật nhân b ản vô tính khó khăn và phức tạp hơn các loài động vật khác rất nhi ều. T ừ nh ững năm 1960-1980, các nhà khoa học đã thành công trong kỹ thuật th ụ tinh trong ống nghiệm để tạo nên phôi người và cấy chuyển phôi vào dạ con người mẹ và sinh ra em bé được gọi là em bé sinh ra từ ống nghiệm (Em bé đ ầu tiên là Brown, 1978, tại Anh).[2] Kết hợp kỹ thuật chuyển nhân với kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm từ 1983, người ta đã nhân bản thành công đối với chuột từ nhân l ấy ở giai đoạn phôi nang, và từ 1984 – 1986 đã thực hiện thành công ở bò, cừu,… từ nhân lấy ở giai đoạn phôi. Trước năm 1992, các nhà khoa học cho rằng, đối với động vật có vú chỉ có thể nhân bản vô tính thành công với nhân lấy từ giai đoạn phôi, còn đối với nhân của tế bào soma trưởng thành thì không th ể th ực hiện được vì tính biệt hóa của chúng là không thể đảo ngược. Tuy nhiên, sự kiện tháng 2/1997, khi báo chí công bố con cừu Dolly ra đời (ngày 5 tháng 7 năm 1996) bằng kỹ thuật nhân bản vô tính với nhân lấy từ tế bào tuyến vú của cừu mẹ trưởng thành 6 năm tuổi do I. Wilmut, Campbel và c ộng s ự ở Viện Roselin (Scottland) thực hiện. Tế bào được thu nh ận từ sinh thi ết tuy ến vú của một cừu cái giống Finn Dorset ở giai đoạn 3 tháng cuối của thai kỳ, lúc tế bào đang tăng sinh và biệt hóa. Các tế bào này được nuôi c ấy, sau đó đ ược đưa vào môi trường rất nghèo huyết thanh nhằm làm ngừng hoàn toàn chu kỳ tế bào. Đồng thời, một trứng của cừu cái giống Scottish Blackface (Đ ầu đen) Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 17
  18. Phạm văn thương –k20 .động vật học có chu kỳ tế bào ngừng ở kỳ giữa giảm phân II, bị hút bỏ bộ nhiễm sắc thể đơn bội cùng với thể cực và một ít tế bào chất, phần còn l ại c ủa tr ứng đ ược chuyển vào môi trường nuôi cấy ở 37 0C, hoạt hóa bằng một xung điện rồi cho kết hợp với tế bào tuyến vú của Finn Dorset bằng một lo ạt xung đi ện khác. Kết quả tạo thành một phôi. Phôi này được đưa vào nuôi cấy tự nhiên trong ống dẫn trứng đã th ắt của một cừu cái khác. Khi phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu hay phôi nang, chúng được cấy vào tử cung của cừu cái mang, từ phôi này phát triển thành cừu Dolly. Điều đáng chú ý là trong số 277 phôi được tạo ra ban đầu, đến giai đoạn phôi nang chỉ còn 29 và chỉ có 1 trong số đó phát tri ển đ ược thành cừu con. Cừu Dolly đã sống được 6 năm tuổi nhưng những phân tích trên tế bào chứng minh rằng nó đã 12 năm tuổi.[1,2] 3. Ứng dụng trong lĩnh vực y tế. 3.1. Cấy ghép mô, cơ quan Với công nghệ nuôi cấy tế bào, người ta đã nuôi cấy thành công gần như tất cả mọi bộ phận trên cơ thể con người như mũi, tai, xương, gân, th ậm chí cả tim, phổi, não... trong phòng thí nghiệm theo đơn đặt hàng t ừ các b ệnh viện. Giống như việc sản xuất các phụ tùng thay thế của xe hơi hay máy vi tính, giới khoa học gọi đây là "thuật giả kim phân tử của thế kỷ 21". Một vòng dạo quanh các "xưởng chế tạo linh kiện thay thế" Tại một phòng thí nghiệm ở Aberdeen (Anh). Các bác sĩ sau g ần nửa tháng làm việc và chờ đợi đã vừa "chế tác" thành công một chiếc mũi dành cho cô gái xinh đẹp người Nigeria 20 tuổi. Cô bị mất chiếc mũi dọc d ừa c ủa mình trong ca phẫu thuật ung thư vòm miệng. Cách làm của các bác sĩ ở đây như sau: thoạt đầu, họ nuôi cấy miếng sụn mũi mới dưới da cánh tay cô gái. Khi nó phát triển đến kích thước thích hợp, h ọ tách nó ra và sau đó s ẽ ghép nó vào vị trí mũi cũ trong ca phẫu thuật ch ỉnh hình mặt cho cô gái s ắp đ ược ti ến hành. Tương tự, trong phòng thí nghiệm này, người ta cũng đang th ử nghi ệm tái tạo "hai trái đào tiên" cho nạn nhân của ung thư vú. Còn tại thành phố Worcester, các bác sĩ thuộc Đại học Massachusetts vừa tiến hành xong một cuộc làm mới một mẩu khuỷu tay cho một người đàn ông 37 tuổi sau khi ông bị mất nó vì tai nạn giao thông. Ng ười ta đã l ấy vài ba t ế bào xương đơn chiếc của nạn nhân cấy vào hỗn h ợp polimer rồi ghép nó vào Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 18
  19. Phạm văn thương –k20 .động vật học vị trí bị khuyết nơi khuỷu tay nạn nhân. Sau thời gian 3 tháng, t ế bào sinh sôi nảy nở và hình thành nên mẩu khuỷu tay y nh ư đã mất, nó hoàn thi ện t ới mức, bệnh nhân - một họa sĩ chuyên nghiệp - lại có thể v ẽ tranh nh ư bình thường. Các nhà công nghệ sinh học thuộc hãng Bio Tissue của Đ ức t ừ lâu đã n ổi tiếng với kỹ thuật sản xuất những khớp nối của ngón tay. Tại đây, nh ững khớp nối này được nuôi cấy hàng loạt trong các ống nghiệm. Người ta đã s ử dụng mẫu sụn và xương lấy từ xương sườn và khớp háng. Sau th ời gian 3 tuần, trên khuôn mẫu đã hình thành khớp nối mới, sau đó các bác sĩ ph ẫu thuật thuộc đại học ở Freiburg ghép thành công cho b ệnh nhân b ị tai n ạn hay bị bệnh phong. Các phòng thí nghiệm và trung tâm công nghệ sinh học tương tự như vậy xuất hiện như nấm sau mưa trên toàn thế giới. "Ngoài mô, sụn, xương, t ại những cơ sở đó, người ta còn tạo ra không ít cơ quan nội t ạng nh ư: gan, m ật, thận, tim, phổi..." - TS. Stanislaw Wronky - nhà thần kinh h ọc Ba Lan, ng ười đầu tiên trên thế giới nuôi cấy thành công đường tiết niệu nhân tạo ti ết l ộ. Cách đây 3 năm, các bác sĩ địa phương đã ghép s ản phẩm đ ầu tiên cho c ậu bé 15 tuổi. Sản phẩm thứ 2 được ghép cho một người đàn ông 24 tuổi - "c ả hai đến nay đều hoạt động không có gì phải chê trách" - TS. Wronky kh ẳng đ ịnh. Chính ông cũng đã tiến hành các công trình nghiên cứu nuôi cấy da cho các bệnh nhân bị bỏng. Ngay trong năm nay, ông đang triển khai chương trình nuôi cấy thành mạch và các động mạch nhân tạo. Rõ ràng, với những gì vừa được chứng kiến, người ta có thể thấy rằng khoa học và y học đã bắt đầu một kỷ nguyên mới với một gương m ặt mới trong đó nhân tố có thể làm thay đổi toàn bộ gương mặt ấy chính là nh ững nhà sinh học tế bào. Chỉ với vài ba tế bào gốc và những ống nghiệm, họ có thể tạo ra những "phiên bản" của sự sống giống y như nguyên bản. "Chúng tôi sẽ có đủ khả năng tái tạo dường như tất cả các mô và b ộ phận cơ thể bị thương tổn, thậm chí cả toàn bộ cánh tay" - Jay Vacanti ở Boston tuyên bố. Hiện tại trong khuôn khổ dự án quốc tế mang tên LIFE (Living Implants From Engineering), những thử nghiệm nuôi cấy cơ tim đầu tiên đã được tiến hành với cả hai tâm thất và van tim. Các chuyên gia kh ẳng định rằng, muộn nhất trong 10 năm tới, công trình sẽ hoàn thành. Những thí Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 19
  20. Phạm văn thương –k20 .động vật học nghiệm gây choáng váng cho nhiều người của GS. Makoto Asashima ở Đại học tổng hợp Tokyo là chứng cứ thuyết phục về điều đó: trong phòng làm việc của ông, không ít cơ quan nội tạng đang từng ngày l ớn lên trong ống nghiệm không khác gì hạt ngô hạt đỗ. Để nuôi cấy chúng, GS. Makoto s ử dụng tế bào gốc có khả năng phát triển thành hầu h ết các mô c ủa c ơ th ể: da, xương, não, gan, hoặc tim. Nhà bác học người Nhật Bản này đổ vào ống nghiệm những chất dinh dưỡng thích hợp như protein và các hormon tăng trưởng (thành phần của chúng được giữ bí mật tuyệt đối), tiếp theo ông đưa vào đó vài ba tế bào gốc. Những tế bào phôi gốc này sẽ tự hình thành ra mô bất kỳ, tùy thuộc vào "khuôn mẫu" mà chúng được nuôi cấy. Khi tế bào bắt đầu hình thành những dạng mô cụ thể, chúng sẽ được đặt vào giữa hai lớp phôi dinh dưỡng khác nhau. Sau một thời gian nh ất đ ịnh, từ nh ững ống nghiệm sẽ xuất hiện các bộ phận thay thế mà ông cần. Trước đó không ai nghĩ rằng lại có thể dễ dàng nuôi cấy những cơ quan phức tạp đến như thế ngay trong điều kiện phòng thí nghiệm. Điều ngạc nhiên lớn hơn là nh ững cơ quan đó lại có thể hoạt động bình thường, th ậm chí còn rất "trơn tru" khi được thay thế vào cơ thể sống. Sắp tới đây, các bệnh viện lớn có th ể s ẽ không còn phải đau đầu đi tìm kiếm những nguồn hi ến, tặng mô và n ội t ạng cơ thể nữa. Thay vì cấy ghép các mô nội tạng lấy từ thi thể người chết, các bác sĩ có thể đặt hàng với các phòng thí nghiệm và trung tâm sinh học, nơi sản xuất hàng loạt những gì họ cần! "Thuật giả kim" này cũng hứa hẹn sẽ tạo nên một cuộc cách mạng trong việc điều trị các bệnh thuộc hệ thần kinh trung ương. D ẫu th ực t ế v ẫn ch ưa có ai thử nuôi cấy não người trong ống nghiệm nhưng khoa học đã thành công trong nỗ lực ghép tế bào não nhân tạo. TS. Michele Levesque - nhà ph ẫu thu ật thần kinh học ở Los Angeles đã tiến hành ca cấy ghép đầu tiên như th ế cho người đàn ông 50 tuổi mắc bệnh liệt rung. Ông đã khoan x ương h ộp s ọ b ệnh nhân và lấy ra vài ba chục tế bào gốc. Chúng được nhân lên (t ới kho ảng 6 triệu) và được tiêm thêm một chất hóa học đặc biệt để biến chúng thành tế bào có khả năng sản xuất ra dopamin. Sau khi cấy lô t ế bào đã đ ược "tân trang" này vào não, nồng độ hormon dopamin trong não bệnh nhân tăng lên gần 60%. 6 tháng sau ca cấy ghép, sức khỏe bệnh nhân đã được cải thiện rõ Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 20
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược