- Trang Chủ
- Nông - Lâm - Ngư
- ĐỀ TÀI: “Khảo sát, đánh giá và phát hiện nguồn gen kháng bệnh bạc lá ở tập đoàn giống lúa mới thu thập tại Lào”
Xem mẫu
- TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÁO CÁO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“Khảo sát, đánh giá và phát hiện nguồn gen
kháng bệnh bạc lá ở tập đoàn giống lúa mới
thu thập tại Lào”
Giảng viên hướng : PGS.TS. PHAN HỮU TÔN
dẫn
Sinh viên thực hiện : Trần Văn Đức
Lớp : CNSHB-K54
- I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Lúa là một cây trồng
quan trọng trong nền kinh tế quốc
dân của nước ta. Nhưng hằng năm,
diện tích lúa bị bệnh bạc lá khoảng
300.00ha và thiệt hại từ 25% -65%
năng suất lúa
“Khảo sát, đánh
giá và phát hiện
nguồn gen kháng
bệnh bạc lá ở tập
đoàn giống lúa mới
thu thập tại Lào”
- II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1 2 3
Theo dõi các đặc Tiến hành khảo sát khả Sử dụng chỉ thị
điểm nông sinh học năng chống chịu của các PCR để tìm gen
của 116 giống được giống với bệnh bạc lá lúa kháng bạc lá Xa4,
chọn: Gồm chỉ tiêu bằng cách lây nhiễm trực xa5, Xa7 của các
hình thái và chỉ tiêu tiếp các chủng vi khuẩn giống lúa khảo sát
năng suất bạc lá trên các giống
Chỉ tiêu tình thái: chiều cao cây tối đa, chiều dài
bông lúa, có hay không có râu và chiều dài lá đòng
Chỉ tiêu năng suất: số hạt chắc/bông chính, số
bông hữu hiệu/khóm và khối lương 1000 hạt
- III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
VẬT LIỆU
116 giống lúa trong tổng số 270 giống lúa dự
kiến ban đầu.
Các dòng đẳng gen khác nhau : dòng IR24 là
dòng không chứa gen kháng bạc làm giống đối chứng
âm; dòng IRBB4 chứa gen Xa4, dòng IRBB5 chứ gen
xa5; IRBB7 chứa gen Xa7.
10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá được phân
lập và bảo quản tại bộ môn Sinh học phân tử và CNSH
ứng dụng, được dùng cho lây nhiễm xác định mức độ
kháng nhiễm của các giống khác nhau.
- III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
PHƯƠNG PHÁP
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo từng ô,
mỗi ô một giống không nhắc lại
+ Mỗi giống cấy 5m2
+ Hàng hàng 20cm
+ Cây cây 10 cm, cấy một dảnh
+ Mật độ 45 khóm/m2
- PHƯƠNG PHÁP
Kỹ thuật trồng và chăm sóc
- Cày bừa, làm giầm đất, nhặt cỏ sách sẽ, san phẳng ruộng.
- Gieo mạ, gieo theo đúng luống, ô.
- Bón phân:
Lượng bón: 120 N+90 P2O5 + 60 K2O
Cách bón:
+ Bón lót: 100% P2O5 + 20% N sau lần bừa cuối cùng.
+ Bón thúc lần 1: 50% N + 40% K2O thúc đẻ nhánh kết hợp
làm cỏ.
+ Bón thúc lần 2: Bón lượng phân còn lại bón nuôi đòng kết
hợp làm cỏ.
- Làm cỏ: Trộn thuốc trừ cỏ với đạm qua các lần bón phân.
- Phun thuốc: Phun 2 giai đoạn, phòng trừ sâu đục thân, cuốn
lá và bệnh khô vằn. Phòng trừ kip thời khi thấy xuất hiện dấu
hiệu bệnh.
- PHƯƠNG PHÁP
Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Wakimoto.
Sau 48h, vi khuẩn nuôi cấy mọc. Sau đó lấy ba vòng vi khuẩn hoà tan với
10ml nước cất. Đem dung dịch đó đi lây nhiễm. Trước khi lây nhiễm, tiến hành lây
thử trên dòng nhiễm chuẩn IRBB24 để thử độc tính của vi khuẩn sau bảo quản.
Lây nhiễm nhân tạo khi lúa bắt đầu có đòng: nhúng đầu kéo vào dung
dịch chủng vi khuẩn cần lây nhiễm, cắt đầu lá dài khoảng 3 đến 5 cm. Cắt toàn bộ lá
xanh trên một cây, mỗi cây một chủng kết hợp đeo thẻ lây nhiễm để quan sát.
Đánh giá khả năng kháng nhiễm của các mẫu giống nghiên cứu bằng cách
đo chiều dài vết bệnh sau 18 ngày lây nhiễm theo phương pháp của Gs. Satoru
Taura.
+ Chiều dài vết bệnh < 8cm: Kháng (R) Succeptible
+ Chiều dài vết bệnh 8- 12cm: Nhiễm vừa (M) Moderate
+ Chiều dài vết bệnh > 12cm: Nhiễm nặng (S) Resistance
- PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp tách chiết DNA
- Quy trình chiết tách DNA theo Zheng và cộng sự
(2000) đã được cải tiến như sau:
+ 2 cm mẫu lá non thu vào buổi sáng được cắt nhỏ vào
cối nghiền với 400µl dung dịch chiết cho tới khi thành dịch màu
xanh lá cây. Bổ sung 400µl dung dịch chiết vào cối rồi chuyển
sang ống eppendorf.
+ Thêm 400µl dung dịch Chloroform : Phenol :
Isoamyalcohol (25:24:1), ly tâm 5 phút, 13000 vòng/phút, 40C, hút
dịch đồng nhất phía trên.
+ Cho thêm vào đó 400µl Phenol : Isoamyalcohol
(24:1), ly tâm 5 phút, 13000 vòng/phút, 40C.
+ Thu dịch trên và tủa DNA bằng 800µl ethanol 99,9%,
ly tâm 5 phút, 13000 vòng/phút, 40C.
+ Phần DNA kết tủa dưới đáy ống được giữ lại, rửa tủa
bằng ethanol 70% và để khô tự nhiên bằng cách úp ngược ống
nghiệm trên giấy thấm. Hòa tủa trong 50µl đệm TE.
+ Bảo quản ở 40C và sử dụng 1,5µl cho phân tích PCR.
- PHƯƠNG PHÁP
Kiểm tra khả năng mang gen kháng Xa 4, Xa 7 bằng PCR
- Mồi cho phản ứng PCR
Gen Xa4 được phát hiện bằng sử dụng chỉ thị Npb181
theo Yoshida và cs. (1992).
R 5’GTG CTA TAA AAG GCA TTC GGG 3’
F 5’ ATC GAT CGA TCT TCA CGA GG 3’
Gen xa5 được phát hiện bằng sử dụng chỉ thị RG556
theo Mc Couch và cs. (1991).
R 5’ TAG CTG CTG CCG TGC TGT GC 3’
F 5’ AAT ATT TCA GTG TGC ATC TC 3’
Gen Xa7 được phát hiện bằng sử dụng chỉ thị P3 theo
Taura và cs. (2004).
F 5’ CAG CAA TTC ACT GGA GTA GTG
GTT 3’
R 5’ CAT CAC GGT CAC CGC CAT ATC
GGA 3’
- PHƯƠNG PHÁP
Chu trình PCR
Thành phần dung dịch phản ứng
PCR với thể tích 25 µl gồm: 12,5 µl PCR
master mix 2X, 1 µl mỗi mồi, 1 µl DNA
và 9,5 µl nước.
Chu kì nhiệt của phản ứng: 940C- 4 phút,
tiếp theo là 35 chu kì, với mỗi chu kì có
các bước:
+ 940C- 1 phút
+ 560C- 1 phút
+ 720C- 2 phút
+ Giữ ở 720C trong 8 phút.
- PHƯƠNG PHÁP
Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
Chạy điện di gen trên gel agarose 1,5% đệm TAE.
Tra mẫu: Trộn mẫu theo tỷ lệ (8μl DNA + 2μl
loading dye) và tra vào giếng.
Điện di: Điện di với hiệu điện thế 60-80V khoảng 45
phút.
Nhuộm DNA: Sau khi điện di xong, gel agarose
được lấy vào ngâm vào dung dịch có chứa ethidium bromide
nồng độ 10mg/ml trong 15 phút.
Chụp ảnh DNA: Soi kiểm tra kết quả trên tia UV và
chụp ảnh.
- VI. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
THẢO LUẬN
Chỉ tiêu nông sinh học của các giống
Xếp loại chiều cao
Thấp
Trung
Trong 216 giống được chọn có 22 giống có bình
0%
chiều cao trung bình, 94 giống thuộc nhóm cao cây 19%
và không có giống nào thuộc hình thái thấp cây.
Giống 11126 có thiều cao thấp nhất :99,98
±2,15 cm. Cao cây
Giống 11172 có chiều cao lớn nhất : 168,4 81%
± 3,77 cm.
Theo tiểu chuẩn IRRI thì chiều cao của các giống chia
thành 3 nhóm:
+ Nhóm thấp cây có chiều cao 125 cm
- Chỉ tiêu nông sinh học của các giống
Giống Chiều cao cây Giống Chiều cao cây
11172 168.4±3.77 11126 99.88±2.15
11165 163.9±3.44 11095 103.5±4.11
11167 163.5±3.55 11303 109.6±3.16
11308 163.3±4.89 11274 111.9±5.90
11292 163.1±2.93 11089 112.0±5.47
11268 161.1±4.45 11056 112.1±6.24
11168 160.2±3.22 11305 113.9±4.38
11304 159.6±4.34 11283 115.1±2.93
11169 158.9±4.11 11284 115.8±4.34
11269 158.9±4.11 11093 116.2±3.19
Bảng 2. Giống 10 cây nhất (từ cao đến thấp) và 10 giống thấp cây nhất (từ
thấp đến cao)
- Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất
Năng suất tiềm năng của các giống lúa dao động trong khoảng từ 41.60
tạ/ha đến 243.39 tạ/ha. Có 108 giống có năng suất lý thuyết lớn hơn 56 tạ/ha (năng
suất bình quân năm 2012 của nước ta) và 8 giống có năng suất thấp hơn 56 tạ/ha.
Số bông
Tổng số hạt Số hạt chắc NS tiềm
hữu Tỷ lệ hạt Khối lượng năng
/bông chính /Bông
Giống hiệu/khóm chính chắc (%) 1000 hạt (tạ/ha)
11124 11.6 213.6 205.4 96.16 22.7 243.39
11273 6.4 223.6 211.6 94.63 39.5 240.72
11170 8.4 210.2 200.6 95.43 29.9 226.97
11122 10.4 198.0 177.0 89.39 27.4 226.97
11082 12.4 165.0 149.4 90.55 27.1 225.92
11057 12.2 143.4 133.2 92.89 30.8 225.23
11169 7.0 284.0 243.8 85.85 29.3 225.02
11098 11.8 146.6 138.0 94.13 30.5 223.50
11159 7.0 302.2 275.0 91.00 25.5 220.61
Bảng 3. Năng suất 10 giống lúa tiềm năng nhất
- Phản ứng của các dòng, giống khi lây nhiễm 10 chủng vi khuẩn
gây bệnh bạc lá
Dòng Kết quả R/M/S Dòng Kết quả R/M/S Dòng Kết quả R/M/S Dòng Kết quả R/M/S
11046 2/0/8 11103 3/1/6 11139 11139 11278 2/2/6
11047 2/1/7 11105 2/1/7 11145 11145 11279 7/0/3
11048 5/1/4 11106 2/3/5 11150 11150 11281 7/1/2
11049 3/2/5 11107 3/2/5 11155 11155 11282 2/4/4
11053 5/2/3 11108 8/0/2 11156 11156 11283 9/0/1
11055 3/0/7 11109 9/0/1 11158 11158 11284 7/2/1
11056 2/3/5 11110 3/0/7 11159 11159 11287 2/2/6
11057 5/2/3 11111 1/1/8 11160 11160 11288 8/0/2
11058 6/0/4 11112 3/4/3 11161 11161 11289 6/1/3
11059 6/2/2 11113 5/2/3 11165 11165 11290 3/1/6
11067 5/2/3 11116 8/1/1 11166 11166 11291 7/1/2
11068 7/0/3 11118 6/0/4 11167 11167 11292 7/0/3
11070 8/0/2 11120 6/2/2 11168 11168 11293 4/3/3
11071 6/2/2 11121 3/1/6 11169 11169 11294 2/1/7
11073 6/2/2 11122 5/1/4 11170 11170 11295 3/2/5
11078 3/2/5 11124 8/2/0 11172 11172 11296 3/0/7
11081 2/1/7 11125 6/1/3 11175 11175 11298 3/2/5
11082 5/2/3 11126 1/1/8 11176 11176 11299 3/0/7
11083 8/0/2 11127 6/2/2 11234 11234 11300 3/3/4
11086 5/1/4 11128 8/0/2 11265 11265 11301 4/0/6
11087 5/0/5 11129 7/1/2 11266 11266 11302 3/1/6
11089 3/1/6 11130 8/0/2 11267 11267 11303 5/2/3
11093 6/0/4 11131 7/1/2 11268 11268 11304 3/3/4
11094 5/1/4 11132 6/0/4 11269 11269 11305 1/1/8
11095 3/2/5 11133 4/3/3 11273 11273 11306 4/1/5
11097 3/0/7 11134 9/0/1 11274 11274 11307 6/1/3
11098 6/2/2 11135 5/1/4 11275 11275 11308 3/1/6
11101 8/0/2 11136 5/3/2 11276 11276 11309 3/0/7
11102 8/2/0 11137 7/0/3 11277 11277 11311 2/3/5
- Phản ứng của các dòng, giống khi lây nhiễm 10 chủng vi khuẩn
gây bệnh bạc lá
Qua bảng lây nhiễm các giống lúa với 10
chủng vi khuẩn ta thấy: Các giống 11046, 11111,
11126, 11158, 11305 bị nhiễm nặng 8/10 chủng vi
khuẩn.
Các giống nhiễm nhẹ với các chủng vi
khuẩn lây nhiễm là 11070, 11083, 11101,11116,
11124, 11128, 11145, 11167, 11168, 11266, 11288.
Đặc biệt các giống 11109, 11134 và 11283 kháng
được 9/10 chủng vi khuẩn.
- Kết quả kiểm tra PCR
Kết quả chạy điện di phát hiện các gen
100%
90%
80%
70% 69
60% 93
Không
50% 114
Có
40%
30%
20% 47
10% 23
0% 2
Xa4 xa5 Xa7
- Kết quả kiểm tra PCR
Có 23 giống lúa phát hiện gen Xa4: 11048,
11057, 11158, 11059, 11073, 11082, 11086, 11087,
11093, 11094, 11095, 11098, 11113, 11118, 11120,
11122, 11124, 11125, 11133,11288, 11293, 11303,
11307.
Có 47 giống chứa gen Xa7: 11053, 11055,
11056, 11067, 11068, 11070, 11071, 11083, 11101,
11108, 11116, 11124, 11127, 11128, 11130, 11131,
11132, 11134, 11135, 11136, 11137, 11137, 11145,
11150, 11155, 11156, 11166, 11175, 11176, 11234,
11265, 11266, 11269, 11279, 11281, 11283, 11284,
11287, 11288, 11291, 11292, 11293, 11300, 11302,
11307.
Có 2 giống chứa gen xa5: 11102 và 11109.
- V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
NS tiềm năng Tỷ lệ
Giống (tạ/ha) Chứa gen Chiều cao cây R/M/S
11124 243.3867 Xa 4 146.6±4.09 8/2/0
11122 226.9706 Xa 4 142.3±3.75 5/1/4
11082 225.9197 Xa 4 127.7±6.36 5/2/3
11057 225.2305 Xa 4 152.1±9.00 5/2/3
11098 223.4979 Xa 4 125.9±3.46 6/2/2
11073 215.3307 Xa 4 119.3±5.93 6/2/2
11125 212.4817 Xa 4 130.1±8.04 6/1/3
11287 202.2224 Xa 7 154.8±1.65 8/0/2
11279 198.6728 Xa 7 154.9±6.96 7/0/3
Bảng 4: Một số giống triển vọng
nguon tai.lieu . vn
