Đề tài: Định tính Vibrio cholerae

Định tính Vibrio cholerae 1. Tổng quan về Vibrio cholerae: Vibrio cholerae được nhà giải phẩu người Ý Kilippo Pacini xác định gây ra bệnh tả vào năm 1854, tuy vậy khám phá của ông không được công nhận rộng rãi đến khi Robert Koch nghiên cứu độc lập sau đó ba mươi năm và công bố thông tin về bệnh cũng như phương pháp phong chống. Bệnh tả hầu hết có liên quan đến thực phẩm. Một nghiên cứu bệnh chứng của Viện Vệ sinh dịch tể Trung ương cho thấy các yếu tố gây nguy cơ cao là: ăn thịt chó,mắm tôm, rau sống, rau quả... đặc biệt là một số hải sản như cá, sò, ốc, hến được bắt từ nơi ô nhiễm hay dùng tay bẩn, dụng cụ ăn uống dơ bẩn, thức ăn tiếp xúc với ruồi, nhặng, chuột, dán,.. làm lây lan mầm bệnh. Hàng năm trên thời giới có khoảng 3­5 triệu c mắc tả, 100.000­120.000 tường hợp tử vong. Vì vậy, việc tìm hiểu quy trình, phương pháp phân tích vi khuẩn Vibrio cholerae là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe cho người tiêu dùng và cộng đồng, Vibrio cholerae có thể được phất hiện thông qua nhiều phương pháp truyền thống hoặc phương pháp miễn dịch và sinh học phân tử khác nhau. 1.1. Tình trạng ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Vibrio cholerae Tình hình dịch tả trên thế giới Bệnh tả được nói đến từ thời Hippocrates và Sanskrit, được mô tả lần đầu tiên bởi Garcia Huerto năm 1563 và được John Snow chứng minh được vai trò lây truyền của nước nước năm 1849. Trong vòng gần 200 năm qua loài người đã trải qua 7 vụ đại dịch tả: ­ Đại dich tả lần thứ nhất (1816­ 1826): Bắt đầu từ Bengal sau lan sang Ấn Độ, Trung Quốc và biển Caspian. ­ Đại dịch tả lần thứ hai(1829­ !826): Naawm1831 dịch lan sang Luân Đôn (6.536 người chết, Pái (20.000 người chết trong tổng số 650.000 dân), tổng số tử vong toàn nước Pháp là 100.000 nguwoif. Sau dịch lan sang Liên Xô, Quebec, Ontario và New York. ­ Đại dịch tả lần thưa ba (1852­ 1860): xay ra ở nhiều vùng của Liên Xô, làm hàng triệu người chết. Ở Luân Đôn làm 10.738 người tư vong. Dịch xảy ra ở Chicago làm chết 5,5% dân số. ­ Đại dịch lần thứ tư (1863­ 1875): Dịch xảy ra chủ yếu là ở Châu Au và Châu Phi. Dịch xảy ra ở Luân Đôn làm 5.596 người chết. ­ Đại dịch tả lần thứ năm (1881­ 1896): Năm 1892 dịhj xảy ra ở Hamburg làm 8.600 người chết. Đây là vụ dịch lớn cuối cùng ở Châu Âu. ­ Đaih dịch tả lần thứ sáu (1899­1923): Dịch ở Châu Âu giảm đi do các điều kiện về vệ sinh tốt hơn nhưng dịch vẫn xảy ra nặng nề ỏ các thành phố của Liên Xô. ­ Đại tả lần thứ bảy (1961­ngững năm bảy mươi): Dịch bắt đầu ở Indonẽia năm 1963, với chủng vi khuẩn El Tor, sau lan sang Bangladesh (1973), Ấn Độ (1964), Liên Xô (1966). Từ Bắc Phi dịch lan sang Italy năm 1973, Nhật Bản và Nam Thái Bình Dương. Từ 1/1991 – 9/1994, dịch xảy ra ở Nam Mỹ, bắt đầu ở Beru với 1trieeuj người mắc và 10.000 người chết, do chủng tả O1­ E1 Tor gây nên, có khác một chút so với chủng tả của đại dịch lần thứ bảy là sự tái tổ hợp giữa chủng tả coorddieent và tả El Tor. Từ đó đến nay dịch xảy ra thường xuyên ở một số nước Châu Phi, Châu Á và Mỹ La Tinh. Tả là một mối đe dọa toàn cầu về y tế công cộng và là một trong những chỉ số về phát triển xã hội. Năm 2006, só ca tả báo cáo trên thới giới tăng lên đáng kể, taawng 79% so với năm 2005 với tổng số là 236.896 được báo cáo từ 52 nước, 6.311 trường hợp tử vong. Theo tổ chức Y tế Thế giới con số này chỉ chiếm 10% tổng số ca bệnh xảy ra trên thực tế. ­ Năm 2014 dịch tả vẫn có chuyển biến phức tạp tai Trung Mỹ và các quốc gia ở Tây va Trung Phi. 1.2. Tình hình tả ở Việt Nam Bệnh tả lần đầu tiên xuất hiện ở Việt nam năm 1850 với 2 triệu trường hợp bệnh được thông báo. Từ năm 1910­ 1938, hàng năm số bệnh nhân mắc tả được thông báo dao động từ 5.000­ 30.000 người. Bệnh tả El Tor lần đầu tiên xuất hiện ở miền Nam , bệnh tả xảy ra dưới dạng dịch lưu hành . Hàng năm có hàng trăm bệnh nhân bị bệnh tả được thông báo. Năm 1994, bệnh tả xuất hiện đầu tiên ở Tây Nguyên với 1.459 bệnh nhân. Sau năm 1975, do việc thông thương giữa hai miền Nam, Bắc, bệnh tả đã lây lan ra miền Bắc và gây ra những vụ dịch tả rải rác Hải Phong. Từ năm 1993 ­2004, dịch xảy ra liên tiếp cả ba miền Bắc, trung , Nam với khoang vài nghìn ca bệnh được báo cáo hàng năm. Tuy nhiên, bệnh không bùng phát thành dịch lớn, có rất ít trường hợp tư vong. Các năm 2005 ­2006, cả nước không ngi nhận trường hợp nào. Từ cuối năm 2007,dịch lại bùng phát ở 19 tỉnh/ thành phố phía Bắc, hang ngàn trương hợp mắc nhưng không có trường hợp tử vong. Năm 2009 đã có 930.946 ca mắc tiêu chay, trong đó có người chết,. Năm 2008 có 453 ca bệnh tả , chết, năm 2009 có 853 người mắc tả,không có người chết, năm 2009 có 479 ca mắc tả, trong đó có một người chết, năm 2010 có 606 ca bệnh tả, không có người chết, năm 2011, có ba người mắc bệnh tả, không có người chết. Cuối tháng 7/2014, tại huyện Bình Chánh (TP.HCM) đã bung phát một ổ dịch tiêu chảy cấp khiến hơn 10 người mắc phải nhập viện điều trị, trong đó có một bệnh nhi tử vong. Kết quả xét nghiệm nuôi cấy và PCR phát hiên mẫ ốc bươu dương tính V. cholerae O1 tuýp huyết thanh Inaba. Theo điều tr người bán ốc lấy ốc ở chợ đầu mối Bình Điền giáp ranh với huyeenj Bình Chánh. Việc phát hiện vi khuẩn tả trong ốc bươu vàng có ngĩa nguồn nước đã bị nhiễm vi khuẩn này, có khả năng lây lan tromng cộng đồng. 1.3. Đặc điểm của Vibrio cholerae Virio cholera (còn gọi là Kommabaccillus) sih vật gram âm hình que hai đầu không đều nhau tạo hình dấu phẩy, di động, sống kị khí tùy ý có khả năng lên men glucose nhưng không sinnh hơi, không sinh H2S. V. cholerae có phản ứng oxidase (+), ADH(­), LDC(+), lên men được sucrose, có thể tăng trưởng được trong môi trường chứa 0­3% NaCl,không phát triển được trong môi trường chứa 6, 8, 10% muối. Vibrio choleaevaf các loài thuộc chi Vibrio Proteobacteria. Có hai chủng Vibrio cholerae chính, chủng cổ điển và chủng El Tor, và một sô nhóm huyết thanh (serogroup) khác. Vbrio cholerae thuộc họ Vibrionaceae, là vi khuẩn có hình cong như dấu phẩy, bắt màu gram âm, không có vỏ, không sinh nha bào , di dộng dược nhờ có lông, khuẩy khuẩn dễ nuôi cấy trong môi trường nghèo dinh dưỡng, pH kiềm (8,5 ­9) và mặn ở môi trường thích hợp như trong nước, thức ăn trong các đọng vật biển ( cá, cua, ốc,sò biển,..).. nhất là ở nhiệt độ thấp, khuẩy khuẩn tả có thể sống được vài ngày đến 2,3 tuần. dễ bị diệt ở nhiệt độ (85oC/ 5 phút), bởi hóa chất thông thường và môi trường axit. Vibrio cholerae có mặt trong nước, sữa, thực phẩm, thủy sản, côn trung,.. sinh độc tố ruột và nội độc tố trong dường tiêu hóa. Độc tố ruột gắn vào niêm mạc ruột non, hoạt hóa emzyme andenylcyclase dẫn đến tăng AMP vogf, làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết Cl­ và nước gây tiêu chảy cấp tính. Phẩy khuẩn tả có thể chuyển hóa trong thiên nhiên, thay đổi tính di truyền do đọt biến từ chủng không gây dịch có thể thành chủng gây dịch và kháng nhiều loại kháng sinh. Là vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên , gây dịch tả, dịch bệnh dễ phát sinh nơi nước bẩn và thực phẩm bị nhiễm trùng. V. cholerae có khòagr 140 nhóm huyết thanh và được chia thành V. cholerae­O1 và Vi. Cholerae no­O1(V. cholerae không ngưng kết với O1 còn được gọi là chủng NAG). V.cholerae O1 được phân thành 2 typ sinh học (biotyp) dựa theo đặc điểm kiểu hình là V. cholerae classica và V. cholerae Eltor. Dựa vào đặc điểm các quyết định kháng nguyên A,BC của kháng nguyên O, V. cholerae được phân thành 3 typ huyết thanh (sero typ) sau: ­ Serotyp Ogawa ( có quyết định kháng nguyên A,B). ­ Serotyp Inaba ( có quyết định kháng nguyên A, C0. ­ Serotyp Hikojima ( có ca ba quyết định kháng nguyên A, B,C). V. cholerae­non O1 nhóm huyết thanh O139 là thủ phạm gây dịch tả ở Án Độ và một số nước ở Châu Á từ năm 1992 đến nay. Phẩy khuẩn tả gây bệnh nhờ độc tố tả ( choleragen). Đây là nội đọc tố có cấu trúc gồm hai đơn nguyên: đơn nguyên A ( trọng lượng phân tử là 27.000 dalton, mang độc tính cao) và đơn nguyên B có tính kháng nguyên đặc hiệu và một cầu nối A2 có tác dụng kích thích tăng AMP vong ( Adenosin 3,5­Cyclic môn phosphat. 2. Các phương pháp phân tích vi khuẩn Vibrio cholerae 2.1. Phương pháp truyền thống 2.1.1. Môi trường nuôi cấy Các phương pháp truyền thống xác định các loài Vibrio trong thực phẩm theo tiêu chuaamr hiện nay (ISO) cũng đã được phổ biến, ISO/TS 21872­1:2007 dùng để xác định V. cholerae. Phương pháp thường dùng môi trương chứa muối với pH khoảng 8.6 như môi trường tăng sinh nước peptone kiềm ( alkaline saline peptone wate). Môi trường phân lặp thương dùng là TCBS, các khuẩn lạc của V. cholerae trên môi trường này thương có đặc điểm là tròn bóng và có màu vàng. Tuy nhiên các phát hiện gần đay cho thấy môi trường TCBS có hạn chế là không phát hiện được các chủng V. cholerae lên men saccharose chậm dẫn đến sai sót trong phát hiện . Một môi trường đặc hiệu hơn cần quan tâm là môi trường tạo màu ( chromogenic arga media) theo cơ chế enzyme như chromIDTTM Vibrio arga (bioMesrieus) hay CHROMargaTM Vibrio cóthể phát hiện cả chủng lên men saccharose chậm. Nguyên tắc Một lượng mẫu xác định ( 10g hoặc 25g) được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng. Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng. Cấy khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trương phân lập dược khẳng định băng các phản ứng sinh hóa và huyết thanh học . Môi trường tăng sinh chọn lcoj cho V. cholerae là TCBS ( Thiosalphate Citrate Bile Sucrose Argar). Các vi sinh vật lên men dược surose trong môi trường này sẽ cho khuẩn lạc màu vàng và làm axits hóa môi trương bên dưới khuẩn lạc. Nếu vi sinh vật không lên men được đường sucrose sẽ cho khuẩn lạc mù xanh. 2.2. Phương pháp phân tích hiện đại 2.2.1. Phương pháp miễn dịch học – ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assays) ELISA (Enzyme­Linked Immunosorben Asa) hay EIA ( Enzyme Immunosorbent) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫ xét nghiệm. kỹ thuật ELISA có thể được sử dụng để phát hiện bệnh phát sáng V. harveyi trên tôm, mẫu nuwowcsvaf có thể xác định tất cả các dòng Vibrio spp. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyentawcs bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể và gồm các bước cơ bản sau: ­ Kháng nguyên chưa biết được gắn trên một bề mặt. ... - tailieumienphi.vn