- Trang Chủ
- Ngư nghiệp
- Đặc tính phân tử và phân bố mô bệnh học của gene FABP (fatty acid binding protein) ở sán máng Schistosoma Mekong
Xem mẫu
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
ĐẶC TÍNH PHÂN TỬ VÀ PHÂN BỐ MÔ BỆNH HỌC CỦA GENE FABP
(FATTY ACID BINDING PROTEIN) Ở SÁN MÁNG SCHISTOSOMA
MEKONG
Đỗ Thị Cẩm Hồng1*, Wanwisa Peonsamut2, Manaw Sangfuang2, Yanin Limpanont3,
Charoonroj Chotwiwattanakun4, Prasert Sobhon5, Narin Preyavichyapugdee2
TÓM TẮT
Fatty Acid-Binding Protein (FABP) là một protein liên kết lipid nội bào, có trọng lượng phân tử
khoảng 14-15 kDa và đóng vai trò quan trọng cho sự tổng hợp màng ngoài và tái tạo da. FABP là
một trong sáu loại protein đã được WHO lựa chọn làm ứng cử viên cho phát triển vắc-xin để phòng
ngừa bệnh sán máng (Bilharziasis) do giống Schistosoma sống trong máu của người và động vật
gây ra ở trong vùng nhiệt đới, nơi mà cộng đồng người nghèo không có nguồn nước sạch và điều
kiện vệ sinh đầy đủ. Trong nghiên cứu này, trình tự ADN bổ sung (cADN) mã hoá protein FABP
của Schistosoma mekongi trưởng thành (SmekFABP) được tạo dòng và phân tích trình tự. Kết quả
thu được đoạn trình tự nucleotide của gen SmekFABP với chiều dài 582 bp có chứa khung đọc mở
mã hoá gen SmekFABP với chiều dài 132 axít amin. Trình tự axít amin của protein SmekFABP
có sự tương đồng với FABP của S. japonicum (GenBank: AA64426) đến 95,4%, và với các loài
Schistosoma khác bao gồm S. mannsoni và S. haematobium lần lượt là 91,7% và 90,2%. Trọng
lượng phân tử của protein SmekFABP là 14.84 kDa và protein FABP tái tổ hợp (rSmekFABP) có
gắn đuôi histidine là 15,5 kDa. Kết quả điện di trong gel SDS-PAGE, chúng tôi ghi nhận 2 vạch,
một vạch chính có trọng lượng 26 kDa; đây có thể là protein rSmekFABP ở dạng liên kết hai đơn
vị (dimer) và một vạch mờ có trọng lượng 15,5 kDa là protein rSmekFABP ở dạng đơn (monomer).
Độ tương đồng và đồng dạng của protein SmekFABP khi so sánh với S. japonicum rất cao, và sự
phân bố ở các vị trí mô bệnh học cũng giống nhau, điều này cho thấy gen FABP của hai loài ký sinh
trùng này có chung nguồn gốc. Trong khi, độ tương đồng và đồng dạng của protein FABP giữa S.
mekongi và ký chủ động vật hữu nhũ rất thấp. Do đó, protein này có thể được dùng để phát triển
vắc-xin chống lại bệnh nhiễm trùng S. mekongi mà không bị tương tác với protein FABP của ký chủ
trong quá đáp ứng sinh miễn dịch bằng vắc-xin. Thêm vào đó, nghiên cứu này sử dụng 5 chương
trình tin sinh học khác nhau bao gồm Hoop & Woods; Welling, Parker, B-EpiPred và ABCpred để
phân tích protein FABP thu được, kết quả là, một epitope kháng nguyên ở dạng peptid có trình tự từ
vị trí 87-DSESKITQTQKDAKN-101 được ghi nhận. Theo các nghiên cứu trước đây, đoạn peptide
này là loại epitope kháng nguyên tiềm năng đối các protein kháng thể CTL và MHC-I trong hệ
thống miễn dịch của ký chủ động vật hữu nhũ.
Từ khóa: FABP, Schistosoma mekongi, kháng nguyên, vắc xin, CTL (Cytotoxic T lymphocyte),
MHC-I (Major Histocompatility Conplex –I).
1
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II
2
Trường Đại học Silpakorn, Thái Lan
3
Applied Malacology Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, Bangkok, Thailand
4
Mahidol University, Nakhonsawan Campus, Nakhonsawan, Thailand
5
Department of Anatomy, Faculty of Science, Mahidol University, Bangkok, Thailand
* Email: camhong573@gmail.com
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 45
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
I. GIỚI THIỆU mà được hấp thụ từ ký chủ động vật (Bennett
Bệnh sán máng (được gọi là Bilharziasis) & Caulfield, 1991). FABP là một trong 6 ứng
do giống Schistosoma sống trong máu của người cử viên phát triển vắc-xin đã được WHO lựa
và động vật gây ra trong vùng nhiệt đới nơi cộng chọn để chống lại bệnh sán máng (Bergquist N,
đồng người nghèo không có nguồn nước sạch 1995). Thêm vào đó, nghiên cứu của Rahmani
và điều kiện vệ sinh đầy đủ (Santos, 2011). Ước và cộng sự (2019) cho thấy FABP có chứa
tính có khoảng 4.400 đến 200.000 người chết epitope kháng nguyên để phát triển vắc-xin đa
hàng năm do bệnh sán máng gây ra trên toàn thế chủng chống lại S. mansoni. Kết quả phân tích
giới (Thétiot ‐ Laurent & ctv., 2013); và sự lây tin sinh học, nhiều epiotpe kháng nguyên có
truyền đã tồn tại ở 75 đến 76 quốc gia (Mohamed thể kích thích phản ứng sinh miễn dịch trong
& ctv., 2018). Ít nhất, 6 loài sán lá nhiễm ở người hệ thống miễn dịch của ký chủ động vật hữu
như Schistosomam haematobium, Schistosoma nhũ để sản xuất các protein kháng thể bao gồm
intercalatum, Schistosoma guineesis, CTL (Cytotoxic T lymphocyte), MHC-I (Major
Schistsosoma japonicum, Schistosoma mansoni Histocompatility Conplex –I) (Rahmani & ctv.,
và Schitosoma mekongi (Gordon & ctv., 2019). 2019).
Năm 1978, S. mekongi được xác định lần đầu Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo dòng
tiên (Voge & ctv., 1978); loài này đặc hữu ở lưu gen, phân tích đặc tính, sự phân bố ở các mô
vực sông Mekong, và một vài nơi ở Thái Lan và dự đoán tế bào B sinh miễn dịch của gen
(Sornmani & ctv., 1971). Bệnh sán máng gây FABP ở S. mekongi. Điều này làm cơ sở cho
ra bởi các phản ứng miễn dịch đối với trứng việc nghiên cứu phát triển vắc-xin chống lại
Schistosoma bị nhiễm trong các mô. Trứng giải S. mekongi cũng như là giải pháp bền vững để
phóng các kháng nguyên dẫn đến kích thích phòng bệnh sán máng trong tương lai.
phản ứng tạo u hạt liên quan đến tế bào T, đại II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
thực bào và bạch cầu dẫn đến các dấu hiệu NGHIÊN CỨU
lâm sàng của bệnh (Othman & Soliman, 2015; 2.1. Tạo dòng và giải trình tự gen FABP
Webster & ctv., 2013). của Schistosoma mekongi (SmekFABP)
Hiện nay, Praziquantel (PZQ) là lựa chọn Sán máng S. mekongi trưởng thành (nguồn
để điều trị bệnh sán máng nhờ vào phổ rộng, sán máng Schistosoma mekongi thuộc chủng
an toàn và hiệu quả cao (Vale & ctv., 2017). Lào được cảm nhiễm vào ốc Neotricula aperta
Mặc dù PZQ có hiệu quả, tuy nhiên nó không và chuột chủng ICR, được thực hiện bởi the
ngăn ngừa sự tái nhiễm (Wu & ctv., 1994), và Applied Malacology Unit, Department of Social
việc sử dụng lặp lại PZQ trong điều trị có thể Medicine and Environment, Faculty of Tropical
dẫn tới các thể schistosomes kháng PZQ (Cupit Medicine, Mahidol University, Bangkok). RNA
& Cunningham, 2015). Do đó, việc phát triển tổng số được tách chiết bằng thuốc thử TRIzol
vắc-xin được xem như là một trong những chiến (Molecular Centre, Inc.), được thực hiện theo
lược bền vững để kiểm soát sự lây truyền bệnh hướng dẫn của nhà sản xuất. Trình tự cADN
một cách lâu dài (Fonseca & ctv., 2012). một phần của SmekFABP được khuếch đại bằng
FABP là một protein liên kết lipid nội bào, PCR với bộ mồi bao gồm mồi xuôi (5’-ACT
có trọng lượng phân tử thấp (14-15 kDa) và TTA GGC GTT CAG TCA ATC GGA A-3’)
đóng vai trò quan trọng cho sự tổng hợp màng và mồi ngược (5’-GCA ATG TTT ATT GAA
ngoài và tái tạo da. Tuy nhiên, FABP không CAA AAG TGA AGC TG-3’). Các mồi này
thể được tổng hợp trong cơ thể bởi giun sán, được thiết kế dựa vào GenBank (FN315763.1)
46 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
của S. japonicum. PCR được thực hiện 35 chu máy tán siêu âm và protein được tinh sạch bằng
kỳ ở 940C trong 30 giây, 500C trong 30 giây và phương pháp ly tâm qua cột Ni-NTA 15ml
720C trong 90 giây. Sản phẩm PCR được gắn (Qiagen, Đức). Protein rSmekFABP tinh khiết
vào vector pGEM-T (Promega, Hoa Kỳ) trước được thẩm tách trong PBS lạnh trong 3 giờ.
khi giải trình tự. 2.4. Dự đoán các vị trí epitope kháng
2.2. Xác định đặc tính protein SmekFABP nguyên
Đặc tính protein SmekFABP được xác định Các epitope kháng nguyên được xác định
bằng công cụ BLAST (http://ww.ncbi.nih.gov/ bằng cách sử dụng một số chương trình dự
BLAST) và chương trình máy tính Prot của Thụy đoán như sau: Hopp & Woods (1981); Welling
sĩ (https://swissmodel.expasy.org). So sánh độ & cộng sự (1985); HPLC / Parker & cộng
tương đồng từ các loài Schistosoma được thực sự (1986); Kolaskar & Tongaonkar (1990);
hiện bởi chương trình Clustal Omega (https:// B-EpiPred (Larsen & ctv., 2006) và ABCpred
www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo). Phương (Saha & Raghava, 2006).
pháp phân tích Neighbourhood (Saitou & Nei, 2.5. Xác định sự phân bố của SmekFABP
1987) được thực hiện bằng phần mềm Mega X trong mô ký sinh bằng phương pháp lai In Situ
(Kumar & ctv., 2018) với bootstrap 1.000 lần Sán máng Schistosoma mekongi trưởng
lặp lại (Felsenstein, 1985). Mô hình 3-D của thành được cố định trong môi trường
protein FABP được dự đoán bằng chương trình paraformaldehyde 2% ở 40C trong 18 giờ. Sau
I-TASSER (Yang & Zhang, 2015). đó, mô được xử lý thông qua quá trình xử lý
2.3. Biểu hiện gen SmekFABP tái tổ hợp mô thông thường trước khi được đúc thành khối
(rSmekFABP) parafin. Phần mô được cắt lát có độ dày 5 mm
Phương pháp thực hiện được dựa theo và đính trên các lame có tráng silan. Các đoạn
phương pháp được mô tả bởi Sripa và cộng mồi xuôi và ngược của gen SmekFABP được
sự (2017). Trình tự ADN của gen FABP được sử dụng để sản xuất mẫu dò có đánh dấu DIG-
khuếch đại từ cADN của sán máng trưởng thành oligonucleotide (Roche, Đức) từ cADN của S.
S. mekongi bằng cách sử dụng mồi xuôi có gắn mekongi. Các mẫu dò này được dùng để lai với
vị trí nhận dạng của enzyme cắt giới hạn NdeI các mô trên lame. Phản ứng lai được ủ ở 500C
ở đầu 5’ của mồi (5’-CATATGGCGACTTT trong 12 giờ. Màu được hình thành bằng cách
GGGTACTGGGATGA-3’) và mồi ngược có sử dụng chất nền NBT/BCIP. Sau đó các lát cắt
gắn vị trí nhận dạng của enzyme cắt giới hạn được nhuộm tương phản với màu nâu Bismarck
XhoI cùng với đoạn 6-histidine ở đầu 5’ của brown Y (Sigma, Mỹ). Các lát cắt này được
mồi (5’- CTCGAGTTAATGATGATGATGAT làm sạch bằng Xylene và được che phủ bằng
GATGAACATTCTCATATTCTTTTATTTGT miếng lamen trước khi quan sát dưới kính hiển
CG-3’), với sản phẩm khuếch đại 420 bp. Sản vi (Salachan & ctv., 2017).
phẩm PCR được gắn vào vector pET-17b trước III. KẾT QUẢ
khi biến nạp vào chủng E. coli BL21 để biểu 3.1. Phân tích gen SmekFABP
hiện protein rSmekFABP. Vi khuẩn này được Kết quả khuếch đại bằng phương pháp PCR
nuôi cấy trong môi trường LB có chứa 1 μg/ml cho thấy trình tự đoạn ADN chứa gen SmekFABP
ampicillin và ủ ở 370C cho đến khi OD600 đạt có chiều dài 582 bp (Hình 1). Đoạn trình tự này
đến 0,6–0,8. Sau đó cảm ứng bằng IPTG 1mM có chứa khung đọc mở mã hóa cho protein FABP
và ủ ở 300C trong 6 giờ. Protein rSmekFABP có chiều dài 132 axít amin với khối lượng phân
thu được bằng cách ly giải tế bào vi khuẩn bằng tử được dự đoán là 14,82 kDa (Hình 2).
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 47
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Hình 1. Sản phẩm khuếch đại bằng PCR đối với đoạn cADN của gen SmekFABP. Giếng M:
thang chỉ thị 100 bp; giếng 1-4: đoạn gen SmekFABP có kích thước 582 bp.
Hình 2. Đoạn trình tự đoạn ADN và trình tự axít amin của gen SmekFABP. Khung đọc mở bao
gồm bộ ba mở đầu ATG mã hoá Methionin (M) và bộ ba kết thúc TAA không mã hoá.
3.2. So sánh trình tự nucleotide và axít protein SmekFABP với các proetin FABP của S.
amin của SmekFABP japonicum (SjFABP_AAA64426), S. mansoni
Tỷ lệ tương đồng giữa trình tự nucleotide (Sm14FABP_2POA_A), S. haematobium
và axít amin của SmekFABP khi so sánh với các (ShFABP_BAF62288) và S. bovis (SbFABP_
loài sán máng khác và các ký chủ động vật hữu AAT39384) lần lượt giảm dần từ 95,4 - 89,4%
nhũ được trình bày trong Bảng 1 và 2. (Bảng 2). Kết quả này cho thấy độ tương
Trong đó, tỷ lệ tương đồng đối với trình đồng gen và protein FABP trong cùng loài
tự nucleotide của SmekFABP với các FABP Schistosoma rất cao, trong đó, độ tương đồng
từ các loài sán máng cùng loài Schistosoma giữa S. mekongi và S. japonicum là cao nhất.
bao gồm S. japonicum (SjFABP_L23322.1), Kết quả so sánh SmekFABP với FABP
S. mansoni (SmFABP_M60895.1), S. của các loài sán Fasciola khác bao gồm F.
haematobium (ShFABP_AB114679.1) và S. hepatica (Fh_AJ250098.1) và F. gigantica
bovis (SbFABP_AY615730.1) lần lượt là 88,7, (Fg_U52908.1) có tỷ lệ tương đồng mức độ
63,0, 62,6 và 57,2% (Bảng 1). Trong khi, tỷ nucleotide là 36,2 - 47,2% ở (Bảng 1); Trong
lệ tương đồng trình tự axít amin khi so sánh khi đó ở mức độ axít amin có tỷ lệ tương
48 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
đồng từ 39,3 - 48,4% đối với F. hepatica (Fh_ đồng ở mức độ nucleotide là 26,6 - 27,1%
CAB65015) và F. gigantica (Fg_AAB06722) (Bảng 1); Trong khi đó, ở mức độ axít amin
(Bảng 2). Điều này cho thấy tỷ lệ tương đồng có tỷ lệ tương đồng từ 25,7 - 27,2% đối
gen và protein FABP giữa S. mekongi và với các với chuột (RatFABP_2JU3_A) và người
loài sán khác tương đối thấp. (HumanFABP_3STN_A) (Bảng 2). Điều này
Kết quả so sánh SmekFABP với FABP cho thấy tỷ lệ tương đồng gen và protein FABP
của các ký chủ động vật hữu nhũ bao gồm giữa S. mekongi và với các ký chủ động vật hữu
chuột (RatFABP_BC086947.1) và người nhũ là rất thấp.
(HumanFABP_BC032801.1) có tỷ lệ tương
Bảng 1. Tỷ lệ tương đồng của các trình tự nucleotide của gen SmekFABP và các loài khác.
Bảng 2. Tỷ lệ tương đồng của các trình tự axít amin của protein SmekFABP và các loài khác.
Cây phát sinh loài được xây dựng bằng S. haematobium (ShFABP_BAF62288) và S.
chương trình Bio Edit (Neighborhood 1.000 lần bovis (SbFABP_AAT39384) nằm trong nhóm
lặp lại) cho thấy SmekFABP nằm trong nhóm với khác và ở nhánh kế cận trên cây phát sinh loài.
FABP của S. japonicum (SjFABP_AAA64426) Trong khi, FABP của động vật và người nằm
và S. japonicum (SjFABP_AAG50052). Còn trong nhóm khác và ở nhánh xa trên cây phân
các loài là S. mansoni (Sm14FABP_2POA_A), phát sinh loài (Hình 3).
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 49
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Hình 3. Cây phát sinh loài được xây dựng từ gen FABP (kích thước 396 bp) của S. mekongi và
các loài khác. SmekFABP nằm trong nhóm với FABP của S. Japonicum.
3.3. Phân tích cấu trúc thứ cấp của trúc bậc ba phổ biến như các protein FABP khác,
protein SmekFABP bao gồm 10 đoạn đối song song ở dạng phiến β
Cấu trúc thứ cấp của protein SmekFABP và 2 đoạn ở dạng xoắn α, và các vòng cuộn kết
được phân tích bằng chương trình I-TESSER nối các đoạn tạo thành sợi peptide (TM-score =
(Zhang, 2008). Kết quả cho thấy protein có cấu 0,91 ± 0,06, RMSD = 1,9 ± 1,6Å) (Hình 4).
Hình 4. Mô hình cấu trúc bậc 3 của protein SmekFABP. Màu vàng: mười đoạn đối song song ở
dạng phiến β; màu hồng: 2 đoạn ở dạng xoắn α; màu xanh: các vòng cuộn kết nối các đoạn tạo
thành sợi peptide (TM-score = 0,91 ± 0,06, RMSD = 1,9 ± 1,6Å).
50 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
3.4. Biểu hiện protein SmekFABP tái tổ rSmekFABP ở vị trí khoảng 26 kDa và vạch
hợp (rSmekFABP) mờ khoảng 23 kDa (Hình 5). Trong khi đó,
Protein rSmekFABP được biểu hiện trong rSmekFABP sau khi được thẩm tách, kết quả
tế bào vi khuẩn E. coli BL21 và được tinh cho thấy có vạch mờ ở vị trí khoảng 15,5 kDa
sạch bằng cột Ni2+ trong điều kiện biến tính. (Hình 6).
Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy một vạch
26 kDa 26 kDa
23 kDa
15,5 kDa
Hình 5. Bảng gel điện di SDS-PAGE Hình 6. Bảng gel điện di SDS-PAGE
của rSmekFABP. của rSmekFABP sau khi thẩm tách.
(M): thang chỉ thị; (M): thang chỉ thị;
(1): protein trước biểu hiện trong E. coli; (1): protein trước biểu hiện trong E. coli;
(2): protein sau khi biểu hiện trong E. coli; (2): protein sau khi biểu hiện trong E. coli.
(3): rSmekFABP tinh sạch.
3.5. Xác định epitope kháng nguyên trên các vùng ưa nước trong protein SmekFABP
SmekFABP có khả năng sinh miễn dịch bề mặt. Một đoạn
Dự đoán vùng epitope kháng nguyên trên 87-DSESKITQTQKDAKN-101 nằm trong vùng
bề mặt của protein là bước cần thiết để thiết kế phiến 𝛽 của protein đều được tìm thấy bởi 5
vắc-xin dựa vào các đoạn peptide có khả năng chương trình phân tích (Hopp & Woods; Welling,
sinh miễn dịch. Kết quả phân tích cho thấy Parker, B-EpiPred và ABCpred) (Bảng 3).
Bảng 3. Các vùng ưa nước tiềm năng và vị trí dự đoán epitope sinh miễn dịch từ các chương trình
phân tích khác nhau.
Hopp & Woods Welling & al Parker & al Kolaskar & Tangaokar B-Epipred ABCpred
9-11,13-16,18 6-7,9-15,18 9-22 13
30-39,41-
26 16-28 23-38
45
25-59
47,49-51,55,57-
47
58 58-65
61-62,77 69-79 61-76
65,67-104 80,82- 65-105
85,87,90,94- 80-87 87-101 88-103
101
108-112,114-119 119 115-120
109-128 102-109,117-126
121, 126-128
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 51
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
3.6. Sự phân bố FABP trong các mô của manh tràng. Trong khi đó, các tế bào biểu mô ở
Schistosoma mekongi bằng kỹ thuật lai In Situ lame đối chứng không lai với mẫu dò đã không
Các mặt cắt dọc parafin của S. mekongi bắt màu nâu của thuốc nhuộm (Hình 7). Kết quả
trưởng thành được lai với mẫu dò ARN này cho thấy mARN của gen SmekFABP hiện
SmekFABP. Các tín hiệu lai dương tính (tế bào diện ở biểu mô và nhu mô của manh tràng của
bắt màu nâu của thuốc nhuộm) đã được phát sán máng.
hiện trong các tế bào biểu mô và nhu mô của
Hình 7. Các mặt cắt dọc của S. mekongi ở giai đoạn trưởng thành được lai với mẫu dò ARN
SmekFABP. (A): lame đối chứng không dùng mẫu dò, các tế bào không bắt màu nâu của
thuốc nhuộm. (B, C và D): Các lame được lai với mẫu dò cho thấy các tế bào nhu mô (Pc) và
tế bào biểu mô (Teg) của manh tràng (Cae) bắt màu nâu của thuốc nhuộm Bismarck brown Y.
Thanh tỷ lệ 50 μm.
IV. THẢO LUẬN Điều này cho thấy FABP của S. mekongi và S.
Kết quả so sánh trình tự nucleotide và axít japonicum có chung nguồn gốc. Đặc tính sinh
amin bằng chương trình Omega Clastal và miễn dịch của phân tử FABP từ S. japonicum
BioEdit cho thấy trình tự axít amin của FABP đã được báo cáo là có khả năng bảo vệ chống
Schistosoma mekongi (SmekFABP) có tỷ lại sự lây nhiễm S. japonicum thông qua thí
lệ tương đồng ở mức độ cao với các loài sán nghiệm gây nhiễm (Tu & ctv., 2014; Wei & ctv.,
máng trong cùng giống Stristosoma. Trình tự 2009). Vì vậy, phân tử SmekFABP cũng có thể
axít amin SmekFABP có tỷ lệ tương đồng cao được dùng phát triển vắc-xin chống lại nhiễm
nhất khi so sánh với S. japonicum (GenBank: trùng S. mekongi. Ngược lại, độ tương đồng về
AAA64426) là 95,4% và với các loài S. mansoni trình tự axít amin của SmekFABP đối với ký
và S. haematobium lần lượt là 91,7 và 90,2%. chủ động vật hữu nhũ cho tỷ lệ rất thấp, dao
52 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
động từ 25-27,2%. Ngoài ra, kết quả phân tích -SESKITQ-94 tương tự có trong peptide của
cây phát sinh loài cho thấy SmekFABP có mối FABP S. mansoni (EKNSESKLTQ) đã được
quan hệ tiến hóa xa với các loài ký chủ động vật chứng minh rằng trình tự này có khả năng bảo
hữu nhũ. Điều này làm cơ sở tốt để có thể sử vệ kép chống lại sự lây nhiễm của cả S. mansoni
dụng SmekFABP phát triển vắc-xin chống lại (sm14) và Fasciola hepatica (Fh15) (Vilar &
nhiễm trùng S. mekongi mà không bị ảnh hưởng ctv., 2003). Đoạn peptide của nghiên cứu này
đến protein FABP của ký chủ động vật hữu nhũ cũng có một phần (93-TQTQKDAKN-100)
trong quá trình sinh miễn dịch bằng tiêm chủng. tương đồng với đoạn peptide “TQTQVDPKNI”
Sự dung hợp protein SmekFABP tái tổ hợp của FABP S. mansoni đã phát triển thành
(rSmekFABP) với đoạn 6 axít amin histidine vắc-xin kết hợp đa peptide (polypeptide)
(6-histidine) được tạo ra trong tế bào vi khuẩn và trở thành vị trí sinh miễn dịch của CTL
sau khi cảm ứng với IPTG 1mM. Kết quả phân (Cytotoxic T lymphocyte), MHC-I (Major
tích trên gel SDS-PAGE và nhuộm màu xanh Histocompatility Conplex –I) trong hệ thống
Coomassie đối với protein rSmekFABP được miễn dịch của ký chủ động vật hữu nhũ. Vì vậy,
tinh sạch xuất hiện một băng (vạch) chính ở vị đoạn peptide “87-DSESKITQTQKDAKN-101”
trí có trọng lượng phân tử khoảng 26 kDa và 2 của SmekFABP có thể được sử dụng để phát triển
vạch mờ ở vị trí có trọng lượng phân tử khoảng vắc-xin chống lại sự nhiễm trùng S. mekongi
23 kDa và 15,5 kDa, trong khi trọng lượng phân hoặc Fasciola spp. trên mô hình động vật trong
tử dự đoán của protein rSmekFABP với đoạn 6- tương lai.
histidine là 15,64 kDa. Theo báo cáo trước đây, Nghiên cứu này đã chứng minh rằng
protein FABP có trọng lượng phân tử từ 13-15 SmekFABP có hiện diện trong tế bào biểu mô
kDa (Sripa & ctv., 2017). Trong nghiên cứu này, và nhu mô của giun đực trưởng thành. Phát
vạch chính có trọng lượng phân tử 26 kDa, điều hiện này tương tự như kết quả của Gobert và
này có thể được tiên đoán rằng rSmekFABP tạo cộng sự (1997), nghiên cứu về protein FABP ở
thành protein phức hợp ở dạng 2 đơn vị (dimer). S. japonicum (Sj-FABP). Họ phát hiện ra rằng
Trong khi vạch mờ có trọng lượng phân tử 15,5 Sj-FABP khu trú trong tế bào nhu mô và các
kDa là rSmekFABP ở dạng đơn (monomer). giọt lipid bên dưới vùng biểu bì của ký sinh
Việc tiêm vắc-xin phòng bệnh sán máng là trùng đực. Brito và cộng sự. (2002) đã chứng
một trong những chiến lược để loại trừ và tiêu minh rằng protein FABP 14 kDa của S. mansoni
diệt tận gốc bệnh sán máng. Nó có thể được sử (Sm14) khu trú trong các mô gần các bề mặt
dụng đơn hoặc kết hợp với thuốc tẩy giun sán tiếp xúc của ký sinh trùng và vật chủ. Điều này
để giảm sự tái nhiễm ở một khu vực đang diễn cho thấy FABP có thể đóng vai trò quan trọng
ra bệnh. Protein FABP là một trong sáu ứng cử trong việc vận chuyển các axit béo, nhưng vẫn
viên được chọn để phát triển vắc-xin bởi WHO chưa rõ liệu sự hấp thu xảy ra thông qua mô
chống lại bệnh sán máng (Bergquist, 1995). hay ruột vì cả hai mô đều liên quan đến sự hấp
Nghiên cứu này, chúng tôi đã dự đoán epitope thu axít béo (Brito & ctv., 2002). Hockley và
kháng nguyên trên phân tử protein SmekFABP McLaren (1973) đã chứng minh rằng các axít
bằng cách sử dụng công cụ tin sinh học. Kết quả béo hấp thụ ở S. mansoni được thực hiện ở tế
cho thấy vùng 87-DSESKITQTQKDAKN-101 bào biểu mô và được lưu trữ trong ruột hoặc
được tìm ra bởi các chương trình tin sinh học trong tuyến thực quản. Trong nghiên cứu của
(Hopp & Woods; Welling, Parker, B-EpiPred Sirisriro và cộng sự (2002) đã sử dụng kỹ thuật
và ABCpred), trong đó đoạn peptide 88 immunoperoxidase để nghiên cứu sự phân bố
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 53
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
của FABP ở F. gigantica, kết quả cho thấy nồng Bergquist, N., (1995). Schistosomiasis vaccine
độ protein này hiện diện cao nhất trong mô nhu development: approaches and prospects. Mem.
Inst. Oswaldo Cruz, 221-227.
mô, và các tế bào nhu mô dường như có số
Brito, Oliveira, G., Oliveira, S., Street, M.,
lượng FABP khác nhau. Riengrojpitak, S., Wilson, R., Simpson, A.,
V. KẾT LUẬN & Correa-Oliveira, R., (2002). Sm14 gene
5.1. Kết luận expression in different stages of the Schistosoma
mansoni life cycle and immunolocalization of the
Từ những kết quả trên, nghiên cứu này ghi
Sm14 protein within the adult worm. Brazilian
nhận một số kết luận như sau: Trình tự ADN journal of medical and biological research,
của SmekFABP đã được tạo dòng có kích thước 35(3), 377-381.
582 bp và chứa khung đọc mở mã hóa protein Cupit, P. M., & Cunningham, C., (2015). What is
FABP là 132 axít amin và trình tự này có sự the mechanism of action of praziquantel and
how might resistance strike? Future medicinal
tương đồng cao với FABP từ Schistosome spp. chemistry, 7(6), 701-705.
(57,2 - 88,7% đối với nucleotide và 89,4% - Felsenstein, J., (1985). Confidence limits on
95,4% đối với trình tự axít amin) và Fasciola phylogenies: an approach using the bootstrap.
spp. (36,2 - 47,5% đối với trình tự nucleotide và evolution, 39(4), 783-791.
Fonseca, C. T., Braz Figueiredo Carvalho, G.,
39,3-48,4% đối với trình tự axít amin). Ngoài
Carvalho Alves, C., & de Melo, T. T., (2012).
ra, một epitope kháng nguyên có khả năng Schistosoma tegument proteins in vaccine and
sinh miễn dịch được dự đoán bằng các chương diagnosis development: an update. Journal of
trình tin sinh học là đoạn peptide nằm ở vị trí parasitology research, 2012.
Gobert, G., Stenzel, D., Jones, M., & McManus,
87-DSESKITQTQKDAKN-101. Một phát hiện
D., (1997). Immunolocalization of the fatty
nữa cũng được ghi nhận trong nghiên cứu này là acid-binding protein Sj-FABPc within adult
ARN thông tin (mARN) của SmekFABP có sự Schistosoma japonicum. Parasitology, 115(1),
hiện diện trong các tế bào biểu mô và nhu mô 33-39.
của giun sán trưởng thành. Gordon, C. A., Kurscheid, J., Williams, G. M.,
Clements, A. C., Li, Y., Zhou, X.-N., Utzinger,
5.2. Đề xuất J., McManus, D. P., & Gray, D. J., (2019). Asian
- Sử dụng protein SmekFABP để phát triển schistosomiasis: current status and prospects for
vắc-xin phòng bệnh nhiễm S. mekongi. control leading to elimination. Tropical medicine
- Phát triển phương pháp chuẩn đoán bằng and infectious disease, 4(1), 40.
Hockley, D. J., & McLaren, D. J., (1973).
kỹ thuật ELISA để phát hiện kháng nguyên
Schistosoma mansoni: changes in the outer
nhiễm ở giai đoạn sớm để giúp việc phòng bệnh membrane of the tegument during development
nhiễm giun sán tốt hơn. from cercaria to adult worm. International
LỜI CẢM ƠN journal for parasitology, 3(1), 13-20.
Hopp, T. P., & Woods, K. R. (1981). Prediction of
Đề tài này được sự hỗ trợ bởi Chương trình
protein antigenic determinants from amino acid
học bổng sau đại học quốc tế Thái Lan “Thạc sequences. Proceedings of the National Academy
sĩ Khoa học Sinh học cho Nông Nghiệp Bền of Sciences, 78(6), 3824-3828.
Vững” thuộc Cơ quan Hợp tác Quốc tế Thái Knopp, S., Person, B., Ame, S. M., Mohammed,
Lan (TICA) - Chính phủ Thái Lan. K. A., Ali, S. M., Khamis, I. S., Rabone, M.,
Allan, F., Gouvras, A., & Blair, L., (2013).
TÀI LIỆU THAM KHẢO Elimination of schistosomiasis transmission in
Bennett, M., & Caulfield, J., (1991). Specific binding Zanzibar: baseline findings before the onset of
of human low-density lipoprotein to the surface a randomized intervention trial. PLoS Negl Trop
of schistosomula of Schistosoma mansoni and Dis, 7(10), e2474.
ingestion by the parasite. The American journal Kolaskar, A., & Tongaonkar, P. C., (1990). A semi‐
of pathology, 138(5), 1173.
54 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
empirical method for prediction of antigenic Saitou, N., & Nei, M., (1987). The neighbor-joining
determinants on protein antigens. FEBS letters, method: a new method for reconstructing
276(1-2), 172-174. phylogenetic trees. Molecular biology and
Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., & Tamura, evolution, 4(4), 406- 425.
K., (2018). MEGA X: molecular evolutionary Santos, F. K. d., (2011). Desenvolvimento e
genetics analysis across computing platforms. caracterização de carreadores lipídicos
Molecular biology and evolution, 35(6), 1547- nanoestruturados contendo praziquantel.
1549. Sirisriro, A., Grams, R., Vichasri-Grams, S.,
Larsen, J. E. P., Lund, O., & Nielsen, M., (2006). Ardseungneon, P., Pankao, V., Meepool, A.,
Improved method for predicting linear B-cell Chaithirayanon, K., Viyanant, V., Tan-Ariya,
epitopes. Immunome research, 2(1), 1-7. P., & Upatham, E., (2002). Production and
Mohamed, I., Kinung’hi, S., Mwinzi, P. N., characterization of a monoclonal antibody
Onkanga, I. O., Andiego, K., Muchiri, G., Odiere, against recombinant fatty acid binding protein
M. R., Vennervald, B. J., & Olsen, A., (2018). of Fasciola gigantica. Veterinary parasitology,
Diet and hygiene practices influence morbidity 105(2), 119-129.
in schoolchildren living in Schistosomiasis Sornmani, S., Kitikoon, V., Harinasuta, C., &
endemic areas along Lake Victoria in Kenya Pathammavong, O., (1971). Epidemiological
and Tanzania—A cross-sectional study. PLoS study of Schistosomiasis japonica on Khong
neglected tropical diseases, 12(3), e0006373. Island, southern Laos. South East Asian Journal
Othman, A. A., & Soliman, R. H., (2015). of Tropical Medicine and Public Health, 2(3),
Schistosomiasis in Egypt: A never-ending story? 365-374.
Acta tropica, 148, 179-190. Sripa, J., Laha, T., & Sripa, B., (2017).
Parker, J., Guo, D., & Hodges, R., (1986). New Characterization and functional analysis of
hydrophilicity scale derived from high- fatty acid binding protein from the carcinogenic
performance liquid chromatography peptide liver fluke, Opisthorchis viverrini. Parasitology
retention data: correlation of predicted surface international, 66(4), 419-425.
residues with antigenicity and X-ray-derived Thétiot‐Laurent, S. A. L., Boissier, J., Robert,
accessible sites. Biochemistry, 25(19), 5425- A., & Meunier, B., (2013). Schistosomiasis
5432. chemotherapy. Angewandte Chemie International
Rahmani, A., Baee, M., Rostamtabar, M., Karkhah, Edition, 52(31), 7936-7956.
A., Alizadeh, S., Tourani, M., & Nouri, H. R., Vale, N., Gouveia, M. J., Rinaldi, G., Brindley, P.
(2019). Development of a conserved chimeric J., Gärtner, F., & da Costa, J. M. C., (2017).
vaccine based on helper T-cell and CTL epitopes Praziquantel for schistosomiasis: single-
for induction of strong immune response against drug metabolism revisited, mode of action,
Schistosoma mansoni using immunoinformatics and resistance. Antimicrobial agents and
approaches. International journal of biological chemotherapy, 61(5)
macromolecules, 141, 125-136. Voge, M., Bruckner, D., & Bruce, J. I., (1978).
Roy, A., Kucukural, A., & Zhang, Y., (2010). Schistosoma mekongi sp. n. from man and
I-TASSER: a unified platform for automated animals, compared with four geographic strains
protein structure and function prediction. Nature of Schistosoma japonicum. The Journal of
protocols, 5(4), 725-738. parasitology, 577-584.
Saha, S., & Raghava, G. P. S., (2006). Prediction of Waghmare, S., & Chavan, R., (2012). Prediction
continuous B‐cell epitopes in an antigen using of Major Histocompatibility Complex Binding
recurrent neural network. Proteins: Structure, Peptides and Epitopes from Fatty-Acid-Binding
Function, and Bioinformatics, 65(1), 40-48. Protein of the Human Blood Fluke Schistosoma
Salachan, P,V., Jaroenlak, P., Thitamadee, S., Japonicum. Metabolomics, 2(113), 2153-
Itsathitphaisarn, O., Sritunyalucksana, K., 0769.1000113.
(2017). Laboratory cohabitation challenge model Webster, B. L., Diaw, O. T., Seye, M. M., Faye, D.
for shrimp hepatopancreatic microsporidiosis S., Stothard, J. R., Sousa- Figueiredo, J. C., &
(HPM) caused by Enterocytozoon hepatopenaei Rollinson, D., (2013). Praziquantel treatment of
(EHP). BMC Vet Res; 13(1):9. school children from single and mixed infection
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 55
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
foci of intestinal and urogenital schistosomiasis Schistosoma japonicum after treatment with
along the Senegal River Basin: monitoring praziquantel in Poyang lake region, China. The
treatment success and re-infection patterns. Acta Southeast Asian journal of tropical medicine and
tropica, 128(2), 292-302. public health, 25(1), 163-169.
Welling, G. W., Weijer, W. J., van der Zee, R., Yang, J., & Zhang, Y., (2015). I-TASSER server: new
& Welling-Wester, S., (1985). Prediction of development for protein structure and function
sequential antigenic regions in proteins. FEBS predictions. Nucleic acids research, 43(W1),
letters, 188(2), 215-218. W174-W181. Zhang, Y. (2008). I-TASSER
Wu, Z., Shaoji, Z., Pan, B., Hu, L., Wei, R., Gao, server for protein 3D structure prediction. BMC
Z., Li, J., & Uwe, B., (1994). Reinfection with bioinformatics, 9(1), 40.
56 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
MOLECULAR CHARACTERIZATION AND TISSUE DISTRIBUTION
OF FABP (FATTY ACID BINDING PROTEIN) IN SCHISTOSOMA
MEKONGI
Hong Thi Cam Do1*, Wanwisa Peonsamut2, Manaw Sangfuang2, Yanin Limpanont3,
Charoonroj Chotwiwattanakun4, Prasert Sobhon5, Narin Preyavichyapugdee2
ABSTRACT
Fatty acid-binding protein (FABP) belongs to a large family of intracellular lipid-binding proteins. It has a
low molecular weight (14-15 kDa) and plays a functional role in the synthesis of the outer cell membrane
that is continually shedding off. It is one of the six candidate vaccine antigens that was selected by the
WHO to study against schistosomiasis, with various degrees of therapeutic effects. The cDNA encoding
SmekFABP of adult Schistosoma mekongi was cloned and sequenced. The nucleotide sequence of
SmekFABP was 582 bp in length. The nucleotide sequence of SmekFABP showed an open reading frame
encoding FABP containing 132 amino acids. The SmekFABP amino acid sequences showed the highest
degree of identity with the S. japonicum (GenBank: AAA64426) at 95.4%. The identity of SmekFABP
amino acid sequences with other schistosomes (S. mansoni, and S. haematobium showed at 91.7 and
90.2 respectively. The expected molecular weight of rSmekFABP determined from its constituent amino
acids is 14.82 kDa and the predicted molecular weight of rSmekFABP protein with histidine tag is 15.5
kDa. In this study, we got one major band at 26 kDa, that could be rSmekFABP that form a complex
protein and the faint band that was 15.5 kDa, which is possible to be the rSmekFABP. A high degree
of similarity and identity of S. mekongi with S. japonicum FABP in both nucleic and amino acid, and
similarity in localization of worm tissue, indicates that they share a common ancestor. The low degree
of conservation observed from amino acid sequences of mammalian hosts could reveal its applicable for
using as the vaccine candidate against the schistosome infection which may not interfere with the host’s
FABP molecule during the vaccination. Based on bioinformatic approach, one immunogenic epitope
was predicted by five programs (Hopp & Woods; Welling, Parker, B-EpiRred and ABCpred), it was
87-DSESKITQTQKDAKN-101, According to previous researches, this peptide fragment has a potential
immunogenic to CTL (Cytotoxic T lymphocyte) and Major Histocompatibility Complex – I (MHC-I) in
immune system of mammalian’s host.
Keywords: FABP, Schistosoma mekongi, immunogenic, vaccination, CTL, MHC-I (Major
Histocompatibility Complex –I).
Người phản biện: TS. Ngô Huỳnh Phương Thảo Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước
Ngày nhận bài: 28/5/2021 Ngày nhận bài: 28/5/2021
Ngày thông qua phản biện: 15/6/2021 Ngày thông qua phản biện: 10/6/2021
Ngày duyệt đăng: 25/6/2021 Ngày duyệt đăng: 25/6/2021
1
Research Institute for Aquaculture No. 2.
2
Silpakorn University, Phetchaburi - Thailand
3
Applied Malacology Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, Bangkok, Thailand
4
Mahidol University, Nakhonsawan Campus, Nakhonsawan, Thailand
5
Department of Anatomy, Faculty of Science, Mahidol University, Bangkok, Thailand
* Email: camhong573@gmail.com
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 57
nguon tai.lieu . vn