1. Trang Chủ
  2. Nông nghiệp
  3. Bước đầu xây dựng phương pháp luận hỗ trợ định danh các mẫu nấm Cordyceps và các chi lân cận bằng phát sinh chủng loài phân tử đa gen

Bước đầu xây dựng phương pháp luận hỗ trợ định danh các mẫu nấm Cordyceps và các chi lân cận bằng phát sinh chủng loài phân tử đa gen

Chi nấm ký sinh côn trùng Cordyceps (họ Clavicipitaceae), tiêu biểu có Cordyceps sinensis, chứa nhiều thành phần hoạt chất quan trọng và nhiều ứng dụng trong y học. Bài viết tiến hành xây dựng một phương pháp luận dựa trên sinh học phân tử kết hợp tin sinh học để định danh các mẫu nấm kí sinh côn trùng tại Langbian nói chung và Việt Nam nói riêng. Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 1 BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP LUẬN HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM CORDYCEPS VÀ CÁC CHI LÂN CẬN BẰNG PHÁT SINH CHỦNG

Thể loại Tài liệu miễn phí Nông nghiệp

Số trang 6

Ngày tạo 4/7/2023 1:15:31 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 0.65 M

Tên tệp

Tải Bước đầu xây dựng phương pháp luận hỗ trợ định dan... (.pdf)

Xem mẫu

  1. Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 1 BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP LUẬN HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM CORDYCEPS VÀ CÁC CHI LÂN CẬN BẰNG PHÁT SINH CHỦNG LOÀI PHÂN TỬ ĐA GEN (ON THE FIRST STEPS TOWARDS A METHODOLOGY TO ASSIST IN THE IDENTIFICATION OF CORDYCEPS AND RELATED FUNGI BY MULTIGENE PHYLOGENETICS) Trịnh Văn Hạnh, Ngô Thị Diệp, Nguyễn Thị Bích Thảo, Nguyễn Thị Thu Thảo, Lao Đức Thuận* Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại Học Mở TP. Hồ Chí Minh SUMMARY A methodology was created to assist in the identification process of entomopathogenic fungi (Cordyceps, Clavicipitaceae), a genus with a diverse species content and therapeutic applications. The method was formed from creating a reference dataset to assist in the identification process of several samples. (1) The dataset includes database of nrSSU, nrLSU, Tef1, Rpb1, Tub and Atp6 for related fungi; (2) Gene sequences obtained from fungal samples of Lang Bian, Lam Dong through DNA extraction by phenol/chloroform method with the assist of β-mercaptoethanol and CTAB; (3) Molecular phylogenies were analyzed on single gene and multigene trees by MEGA 6.0 software with different tree construction methods (Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) and Maximum Likelihood (ML). Boostrapping was included to support tree branches. The molecular method with the combination of molecular biology and bioinformatics was completely in agreement with morphological-based methods. As a result, DL0038A and DL0038B were reconfirmed as Cordyceps takaomontana (Anamorphic form: Isaria tenuipes), DL004 was reconfirmed asCordyceps neovolkiana.DL0067 was in a very close relationship or is Isaria. tenuipes, DL0075 was in a very close relationship or is Cordyceps. staphylinicola. DL0069 and DL0077 were in a very close relationship with Simplicillium lamellicola or Simplicillium lanosoniveum. Keywords: Molecular phylogenetics, Cordyceps, Clavicipitaceae, Entomopathogenic fungi. MỞ ĐẦU Chi nấm ký sinh côn trùng Cordyceps (họ với chi nấm này do (1) sự đa dạng về đặc Clavicipitaceae), tiêu biểu có Cordyceps điểm, cấu trúc của các loài nấm thuộc họ sinensis, chứa nhiều thành phần hoạt chất Clavicipitaceae, (2) hệ thống định danh nhóm quan trọng và nhiều ứng dụng trong y học[3]. nấm tồn tại thể lưỡng danh là hữu tính Hiện nay, nghiên cứu không chỉ tập trung vào (teleomorph) và vô tính (anamorph) gây phức loài Cordyceps sinensis mà còn mở rộng tạp hóa quá trình định danh[3]. Vì vậy, việc nghiên cứu đến nhiều loài thuộc họ xây dựng một phương pháp luận dựa trên việc Clavicipitaceae, các loài này được cho rằng có phân tích cây phát sinh loài phân tử nhằm hỗ các hoạt tính y dược quý như C. sinensis[4]. trợ cho công tác định danh nấm này đã được Tuy nhiên, việc định danh các loại nấm thuộc chúng tôi tiến hành. chi này đều dựa trên phân tích hình thái của Phương pháp luận được xây dựng dựa trên Kobayashi(1982)(được xem là tiêu chuẩn sinh học phân tử kết hợp với tin sinh học ứng vàng trong định danh) gặp nhiều khó khăn đối dụng trong việc xây dựng cây phát sinh sinh
  2. Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 2 loài đơn gen hay đa gen. Nền tảng của phương tin cậy của cây phát sinh loài và quá trình định pháp luận là (1) sinh học phân tử (gồm chủ danh nấm ký sinh côn trùng (Sung et al., yếu là PCR và điện di giải trình tự) và (2) tin 2007). sinh học (gồm xây dựng cơ sở dự liệu (CSDL), Trong nghiên cứu này, Chúng tôi tiến hành xây dựng cây phát sinh loài phân tử).Trên thế xây dựng một phương pháp luận dựa trên sinh giới, việc nghiên cứu phát sinh loài ứng dụng học phân tử kết hợp tin sinh học để định danh trong hỗ trợ định danh nấm ký sinh côn trùng các mẫu nấm kí sinh côn trùng tại Langbian đã được nghiên cứu trước đây, chẳng hạn nói chung và Việt Nam nói riêng. Đồng thời Sung et al. (2007) đã sử dụng dữ liệu 5 – 7 gen phương pháp luận được kiểm định bởi các bao gồm nrSSU, nrLSU, rpb1, rpb2, Atp6, tub mẫu nấm kí sinh côn trùng đã được định danh và tef1 để tiến hành phân tích, nghiên cứu sâu hình thái gồm: DL004: Cordyceps nevolkiana, về quan hệ giữa các chi thuộc họ DL0038A: Cordyceps takaomontana, Clavicipitaceae, kết quả của nghiên cứu này DL0038B: Cordyceps takaomontana, đã tái sắp xếp lại các chi liên quan. Bộ dữ liệu DL0067: Isaria sp., DL0069: Simplicillium công bố của Sung et al. (2007) là dẫn liệu đối sp., DL0075: Cordyceps sp., DL0077: chứng chính trong cây phát sinh loài mà chúng Simphicillium sp. (Đinh Minh Hiệp, Trương tôi xây dựng. Thông tin trên cho thấy sự kết Bình Nguyên, 2015). hợp đa gen góp phần hỗ trợ làm tăng mức độ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Kế thừa kết quả nghiên cứu trước của nhóm Phản ứng PCR được thực hiện trên máy TS. Trương Bình Nguyên và TS. Đinh Minh Mxpro-Mx3005P (Stratagene) với chương Hiệp (2005), trong công bố này chúng tôi sử trình nhiệt bao gồm 95 ºC trong 5 phút (1 chu dụng 7 mẫu nấm được phân thành 2 nhóm kỳ), 40 chu kỳ lặp lại với 95 ºC - 30 giây, X chính gồm (1) DL004, DL0038A, DL0038B ºC - 30 giây, 72 ºC - 2 phút và 72 ºC - 5 phút là nhóm được định danh hình thái đến mức (1 chu kỳ) (X là nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho loài, được xem là nhóm đối chứng để kiểm tra mỗi gen nrLSU: 55oC, nrSSU: 42,5oC, Tef1: phương pháp luận mà nhóm xây dựng; đặc 55oC, Rpb1: 46,3oC, Tub: 58,5oC, Atp6: biệt trong nhóm này: hai mẫu nấm DL0038A 43oC). Thể tích mỗi phản ứng là 25 µl bao và DL0038B là hai mẫu tuy được định danh gồm: 12,5 µl buffer PCR, 0,5 µl mồi xuôi và đến mức loài bằng hình thái, nhưng hỗ trợ từ ngược, 7 µl ddH2O và 5 µl DNA. Sản phẩm phân tích trình tự ITS chưa đạt kết quả mong PCR được tiến hành điện di trên gel agarose 2 muốn. (2) DL0067, DL0069, DL0075 và % và được tiến hành giải trình tự tại công ty DL0077 mới được định danh hình thái đến Nam Khoa. Mồi sử dụng cho phản ứng giải mức chi, nhóm này được sử dụng với mục trình tự cũng chính là các mồi được sử dụng đích từ kết quả định danh phân tử có thể hỗ trợ cho phản ứng PCR, được cung cấp bởi IDT thêm thông tin cho định danh hình thái. (Intergrated DNA Technologies, Mỹ). Tách chiết DNA, phản ứng PCR khuếch Hiệu chỉnh trình tự, xây dựng cây phát đại các gen mục tiêu sinh loài Quy trình tách chiết DNA từ hệ sợi nấm Sản phẩm PCR sau khi được giải trình được thực hiện bằng phương pháp tự 2 chiều sẽ được kiểm tra bằng phần mềm Phenol/Chloroform, phỏng theo Chomczynski Chromas Lite phiên bản 2.1.1 cả hai chiều và và Sacchi (1987) có biến đổi cho phù hợp với được hiệu chỉnh hết sức cẩn thận thông qua mục tiêu thu nhận DNA (thay đổi chỉ số pH các phần mềm Seaview, BioEdit, BLAST, … của phenol từ 4 thành 8) và bổ sung thêm chất Các trình tự sau khi hiệu chỉnh được sắp gióng bổ trợ là β-mercaptoethanol và CTAB. cột và đồng bộ hóa với bộ dữ liệu tham chiếu thu nhận từ công trình của tác giả Sung et al.
  3. Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 3 (2007). Cuối cùng, bộ dữ liệu được tiến hành joining (NJ), Maximum parsimony (MP) và dò tìm mô hình tiến hóa phù hợp nhất theo Maximum likelihood (ML) và mô hình tiến chuẩn Bayesian Information Criterion (BIC) hóa phù hợp nhất từ kết quả dò tìm bằng phần bằng phần mềm MEGA 6.0 (Tamura et al., mềm MEGA 6.0; Cây phát sinh loài được 2013). đánh giá bằng phương pháp bootstrap lặp lại Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phần 1000 lần với mức đạt ý nghĩa khi giá trị ủng mềm MEGA phiên bản 6.0 (Tamura et al., hộ lớn hơn 50 và so sánh về mặt địa hình học 2013). Các phương pháp được sử dụng để xây (Topology) với cây phát sinh loài tham chiếu dựng cây phát sinh loài bao gồm: Neighbor của Sung et al. (2007). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tách chiết DNA, PCR các gen mục tiêu nồng độ DNA cao hơn (kết quả không trình Xây dựng thành công quy trình tác chiết bày). Chúng tôi đã tiến hành tối ưu hóa thành DNA tổng số từ hệ sợi nấm bằng phương pháp công quy trình PCR cũng như các nhiệt độ bắt phenol/Chloroform có bổ sung β- cặp cho từng gene đại diện như trong hình 1. mercaptoethanol và CTAB cho kết quả tối ưu, Hình 1. Điện di sản phẩm PCR gen nrLSU, nrSSU, Rpb1, Tef1. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel trên cho kết quả về mặt địa hình học agarose 2% cho kết một băng sản phẩm duy (Topology) đều tương ứng với nhau (dữ liệu nhất trùng khớp với kết quả khảo sát in silico không trình bày). Tuy nhiên nhằm tăng hiệu và tham khảo từ công trình nghiên cứu của quả phân tích, việc ghép các gen với nhau làm Sung et al. (2007) cụ thể kích thước 950, 1102, tăng chiều dài trình tự giúp tăng độ chính xác, 803 và 1040 nucleotides, tương ứng lần lượt thông qua các thông số về phát sinh chủng loài với các gen nrLSU, nrSSU,rpb1 và tef1 (Sung như giá trị ràng buộc (bootstrap), đơn vị đo et al., 2007). khoảng cách biến đổi (substitution) và đồng Xây dựng cây phát sinh loài quan điểm với nhiều công trình nghiên cứu Các gen sau khi hiệu chỉnh được tiến khác trên thế giới, chẳng hạn như nghiên cứu hành đồng bộ hóa với cơ sở dữ liệu tham chiếu của Sung et al. (2007), Johnson et al. (2009), của từng gen nrLSU, nrSSU, rpb1 và tef1, Chan et al. (2011). Atp6, Tub được xây dựng dựa trên công trình Phương pháp luận hỗ trợ định danh được tái nghiên cứu của Sung et al. (2007). Các cây kiểm tra với kết quả định danh hình thái với phát sinh loài được xây dựng bằng phần mềm các mẫu đã được định danh đến mức loài. Cụ MEGA 6.0 gồm cây NJ, MP, ML dựa trên bộ thể là các mẫu DL004, DL0038A, DL0038B. dữ liệu tham chiếu đơn gen của các mẫu nấm
  4. Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 4 Hình 2. Một phần của cây phả hệ phân tử mẫu DL004 xây dựng bằng phương pháp MP. (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần) Hình 3. Một phần của cây phả hệ phân tử mẫu DL0038A, DL0038B xây dựng bằng phương pháp MP. (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần). Dựa trên cây phát sinh loài cho mẫu DL004 DL0038 được kết luận là Cordyceps (Hình: 3), cho thấy địa hình học của cây NJ, takaomontana (thể vô tính là Isaria tenuipes). MP, ML đều tương tự như nhau và mẫu Từ những kết quả trên, phương pháp DL004 phân nhóm với trình tự tham chiếu luận mà chúng tôi xây dựng một lần nữa được Ophiocordyceps neovolkiana (HQ215593, tái kiểm tra cho thấy kết quả định danh phân HM852531) với giái trị bootstrap đạt lần lượt tử hoàn toàn ủng hộ kết quả định danh hình là 100/100/94 lần lượt trên cây NJ/MP/ML. thái. Kết quả kiểm định trên giúp cung cấp Giá trị bootstrap > 70% tương ứng với giá trị thêm cơ sở khoa học cho phương pháp luận xác xuất > 95% thì giá trị phân nhóm được ủng chúng tôi xây dựng hướng đến ứng dụng định hộ mạnh mẽ[2]. Dựa trên hình thái mẫu danh đối với các mẫu nấm khác, đặc biệt là đối DL004 được định danh là Cordyceps với các chi nấm Cordyceps và các chi lân cận. neovolkiana (Lê et al., 2010). Như vậy, Kết Đối với mẫu DL0067, DL0069, quả phân tích phân tử đối với mẫu DL004 đều DL0075, DL0077 đã được định danh hình thái trùng khớp với kết quả định danh hình thái, đến mức chi. Cụ thể, mẫu DL0067 khi xây mẫu DL004 được kết luận là Cordyceps dựng cây phát sinh loài đơn gen và đa gen đều neovolkiana. luôn phân nhóm với trình tự tham chiếu là Mẫu DL0038A, DL0038B khi được xây Isaria tenuipes giá trị bootstrap ủng hộ cao cho dựng cây phát sinh loài đa gen luôn phân sự phân nhóm này. Khi xây dựng cây phát sinh nhóm với Isaria tenuipes (thể vô tính của loài đa gen thì mẫu DL0067 lại phân nhóm với Cordyceps takaomontana)[6] với giá trị DL0038A với giá trị bootstrap trên cả 3 cây bootstrap ủng hộ mạnh mẽ cho sự phân nhóm NJ/MP/ML lần lượt là 100/100/100 và 2 mẫu trên lần lượt là 98/99/95 đối với 3 cây NJ, MP, nấm này đều phân nhóm với Isaria tenuipes ML. Về hình thái, mẫu DL0038A, DL0038B thuộc ngân hàng giống OSC111005 với giá trị được định danh là Cordyceps takaomontana bootstrap là 98/99/95 lần lượt trên 3 cây (Lê et al., 2010). Kết quả định danh phân tử NJ/MP/ML. Kết quả cây phát sinh loài đơn và của 2 mẫu trên tương đồng và phù hợp với đa gen thì mẫu DL0067 được định danh phân định danh hình thái, mẫu DL0038A và tử là Isaria tenuipes (thể vô tính của
  5. Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 5 Cordyceps takaomontana). Hiện mẫu DL0067 danh phân tử cho kết quả đến mức loài là đang được tiếp tục nuôi cấy trong phòng thí Isaria tenuipes giúp cung cấp thêm thông tin nghiệm với mong muốn thu nhận được quả thể để hỗ trợ nhóm nghiên cứu định danh sau này. để có thêm thông tin định danh dựa trên hình Như vậy, chúng tôi kết luận mẫu DL0067 là thái. Kết hợp với định danh hình thái mẫu Isaria sp. và có quan hệ rất gần hoặc chính là DL0067 là Isaria sp. (Lê et al., 2010) thì định loài Isaria tenuipes Hình 4. Một phần của cây phả hệ phân tử mẫu DL0069, DL0077 xây dựng bằng phương pháp MP. (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần) Về hình thái, tương tự mẫu DL0067 thì hai hợp với cây phát sinh loài đa gen của 4 gen mẫu DL0069, DL0077 cũng chỉ mới được nrLSU, nrSSU, rpb1, Tef1 cũng phân cùng định danh đến mức chi Simplicillium (Lê et nhóm Simplicillium với các thông số al., 2010). Mẫu DL0069, DL0077 khi được bootstrap của 3 cây NJ/MP/ML lần lượt là xây dựng cây phát sinh loài đơn gen luôn phân 100/90/99.Như vậy, chúng tôi kết luận mẫu nhóm với Simplicillium lamellicola (CBS DL0069, DL0077 là loài thuộc chi 116.25) và Simplicillium lanosoniveum (CBS Simplicillium sp. và có quan hệ rất gần với 101267) của chi Simplicillium với giá trị loài Simplicillium lamellicola hay bootstrap đều ủng hộ cho sự phân nhóm này ở Simplicillium lanosoniveum. mức ý nghĩa (kết quả không trình bày). Kết Hình 5. Một phần của cây phả hệ phân tử mẫu DL0069, DL0077 xây dựng bằng phương pháp MP. (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần). Trường hợp mẫu DL0075 khi được tiến hành hình thái mẫu DL0075 mới định danh được tới xây dựng cây đơn gen và đa gen luôn phân mức chi là Cordyceps sp.Vì vậy, chúng tôi kết nhóm với trình tự tham chiếu là Cordyceps luận mẫu DL0075 là loài thuộc Cordyceps sp. staphylinidicola với giá trị bootstrap ủng hộ và có quan hệ rất gần hoặc chính là loài cao cho sự phân nhóm của cây đa gen ở 3 cây Cordyceps staphylinidicola. NJ/MP/ML lần lượt là 100/100/100. Về mặt
  6. Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 6 KẾT LUẬN Phương pháp luận dựa trên việc áp dụng kỹ quả định danh dựa trên phân tử cho thấy: mẫu thuật sinh học phân tử - kết hợp với tin sinh DL0067 được định danh là loài thuộc Isaria học được xây dựng thành công hỗ trợ định sp. và có quan hệ rất gần hoặc chính là loài danh các loài nấm ký sinh côn trùng. Phương Isaria tenuipes. DL0075 được nhận định là pháp này được chúng tôi khẳng định và tái loài thuộc Cordyceps sp. và có quan hệ rất gần kiểm tra trên các mẫu DL004, DL0038A, hoặc chính là loài Cordyceps staphylinidicola. DL0038B. Kết quả định danh phân tử hoàn Mẫu DL0069, DL0075 được nhận định là loài toàn trùng khớp với kết quả định danh hình thuộc Simplicillium sp. và có quan hệ rất gần thái, các mẫu này được kết luận lần lượt là với loài Simplicillium lamellicola hay DL0038, DL0038B chính là Cordyceps Simplicillium lanosoniveum. Kết quả định takaomontana - thể hữu tính và Isaria tenuipes danh này cung cấp cho chúng tôi thêm nhiều - thể vô tính. DL004 chính là là Cordyceps thông tin cơ sở khoa học cho công tác định neovolkiana. Đối với các mẫu nấm chưa thể danh dựa trên hình thái sau này định danh đến mức loài dựa trên hình thái, kết . TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Andreas, D, B, Ouellette, B, F, Bioinfomatics A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Methods of Biochemical Analysis, Vol. 43, pp. 323-359. 2. Capote, N., Pastrana, A, M, Aguado, A, and Torres, P, S, 2012.Molecular Tools for Detection of Plant Pathogenic Fungi and Fungicide Resistance, Plant Pathology, InTech. 3. Chan, W, H, Ling, K, H, Chiu, S, W, et al. (2011), Molecular Analyses of Cordyceps gunnii in China, J Food & Drug Anal 19: 18-25. 4. Cummings; John, N, 2009. Entomopathogenic fungi in New Zealand native forests : the genera Beauveria and Isaria, Biological Sciences, 10. 5. Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên, 2015.Nghiên cứu nhóm nấm Cordyceps ở Tây Nguyên và khảo sát tiềm năng ứng dụng của chúng trong y dược,Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài Sở Khoa Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 6. Kobayasi, Y, 1982.Keys to taxa of genera Cordyceps and Torrubiella, Transactions of the mycological society of Japan; Vol. 23, 329-364. 7. Sung, G, H,; Jones, N, L, H; Jae, M, S,; Luangsaard, J, J,; Shrestha, B,; Spatafora, J, W, 2007. Phylogenetic classification of Cordycepsand the clavicipitaceous fungi, Studies in Mycology; Vol 57; pp.5-59. 8. Sung, G, H, Sung, J, M, Hywel-Jones, N, L, Spatafor, J, W, 2007.A multi-gene phylogeny of Clavicipitaceae (Ascomycota, Fungi):Identification of localized incongruence using a combinational bootstrap approach, Molecular Phylogenetics and Evolution.
nguon tai.lieu . vn
Nông nghiệp Ngư nghiệp Lâm nghiệp Sinh học Hoá học Ngôn ngữ học Ngân hàng - Tín dụng