1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Báo cáo: Nghiên cứu các phương pháp phân tích cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá thế hệ T1

Báo cáo: Nghiên cứu các phương pháp phân tích cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá thế hệ T1

Cho tới nay đã có khoảng 2000 loại virus hại thực vật được phát hiện, trong đó có nhiều loài gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất và chất lượng cây trồng. Đê han chê sư lây lan cua virus thưc vât , nhưng biên phap truyên thông đang đươc áp dụng hiện nay như loại bỏ những cây bị bệnh. Báo cáo: Nghiên cứu các phương pháp phân tích cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá thế hệ T1 MƠ ĐÂU ̉ ̀ Cho tới nay đã có khoảng 2000 loại virus hại thực vật được phát hiện, trong đó có nhiều loài gây ảnh

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 40

Ngày tạo 8/29/2018 9:35:51 PM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước

Tên tệp

Tải Báo cáo: Nghiên cứu các phương pháp phân tích ... (.pdf)

Xem mẫu

  1. Báo cáo: "Nghiên cứu các phương pháp phân tích cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá thế hệ T1"
  2. MƠ ĐÂU ̉ ̀ Cho tới nay đã có khoảng 2000 loại virus hại thực vật được phát hiện, trong đó có nhiều loài gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất và chất lượng cây trồng. Đê han chê sư lây lan cua virus thưc vât , nhưng biên phap truyên thông đang đươc ̣̉ ̣́ ̉ ̣ ̣ ̃ ̣ ́ ̀ ́ ̣ áp dụng hi ện nay như loai bo nhưng cây bị bênh ngay khi mơi phat hiên ̣̉ ̃ ̣ ́ ́ ̣ , phun thuôc diêt môi giơi truyên bênh…t ỏ ra kém hiêu qua l ại đoi hoi nhiêu thơi gian , ́ ̣ ́ ̀ ̣ ̣ ̉ ̀ ̉ ̀ ̀ công sưc va anh hương xâu tơi môi trương. Viêc tì m ra cac biên pháp để ngăn chặn ́ ̀̉ ̉ ́ ́ ̀ ̣ ́ ̣ sư phat triên va lây lan cua virus gây b ệnh trên thưc vât đang la môt vân đê đươc ̣ ́ ̉ ̀ ̉ ̣ ̣ ̣̀́ ̀ ̣ quan tâm nghiên cứu. Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học trong thời gian gần đây thúc đẩy nhiều nghiên cứu theo hướng tạo gi ống cây trồng có khả năng kháng virus gây hại bằng công nghệ gen, góp phần phát triển một xu thế mới trong công cuộc phòng chống bệnh hại thực vật. Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học , đa co nhiêu ưng dung sinh hoc ̃́ ̀́ ̣ ̣ phân tư trong chon ta o giông cây trông khang virus , trong đo , công nghê RNA ̉ ̣ ̣ ́ ̀ ́ ́ ̣ interference (RNAi) tỏ ra là một giải pháp hữu hiệu nhất thông qua việc sử dụng các vật liệu di truyền từ virus gây bệnh chuyển vào cây trồng tạo cây chuyển gen kháng chính virus đo với hiệu quả có thể lên tới 80-95%. ́ Ở Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu theo hướng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus gây ra. Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong vi ệc ứng dụng kỹ thuật RNAi trên mô hình cây thuôc la chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc ́́ lá (TMV) hoặc kháng đồng thời cả 2 loại virus trên. Nhằm tiếp tục phân tích các đặc tính di truyền của gen chuyển ở thế hệ sau, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cưu cac phương phap phân tí ch cây thuôc la chuyên gen khang ́ ́ ́ ́́ ̉ ́ bênh kham la thế hệ T1” ̣ ̉ ́ 1
  3. Chƣơng 1. TÔNG QUAN TAI LIÊU ̉ ̀ ̣ 1.1. Bênh virus thƣc vât ̣ ̣ ̣ 1.1.1. Giơi thiêu chung vê bênh virus hai thƣc vât ́ ̣ ̣̀ ̣ ̣ ̣ Virus thực vật được phát hiện vào cuối thế kỉ 19 và đến đầu thế kỉ 20 có rất nhiều virus gây bệnh cho thực vật lần lượt được phát hiện như virus khảm thuốc lá, virus thoái hóa khoai tây, virus hại cà chua,… Virus thực vật gây hại nặng nề tới năng suất và chất lượng nông sản, mức độ thiệt hại có khi lên tới 100%. Theo ước tính thiệt hại hàng năm do bệnh virus gây ra trên th ế giới vào khoảng 70 tỉ USD (Nguyên Văn Ty ̃ ̣ , 2002). Cho đến nay, với sự phát triển của sinh học và sự trợ giúp của trang thiết bị, phương tiện hiện đại, trên 4 ngàn loại virus đã được phát hiện, trong đó có hơn 2000 loài là virus hại thực vật. Virus thưc vât la nhưng vi sinh vât vô cung nho be va co nhưn ̣ ̣̀ ̃ ̣ ̀ ̉́̀́ ̃ g đăc đi ểm : ̣ (PGS.TS Vu Triêu Mân va PGS.TS Lê Lương Tê , 2002) ̃ ̣ ̃ ̀ ̀  Virus co câu tao rât đơn gian : có hai phần chính là lõi axit nucleic và vỏ protein ̣́́ ́ ̉  Thông thương virus thưc vât co vât chât di truyên la RNA , môt sô í t con lai c ó ̀ ̣ ̣̣́ ́ ̀̀ ̣́ ̀ ̣ vât chât di truyên la DNA ̣ ́ ̀̀  Virus la vi sinh vât kí sinh ơ mưc đô tê bao . Virus thưc vât co thê nhiêm bênh ̀ ̣ ̉ ́ ̣́̀ ̣ ̣́ ̉ ̃ ̣ cho môt hay nhiêu loai cây , và mỗi loài cây có thể nhiễm một hay nhiều loài ̣ ̀ ̀ virus  Virus thực vật cũng như virus động vật, sau khi xâm nhiễm vào tế bào chủ chúng bắt đầu tác động đến sự trao đổi chất của tế bào, virus sử dụng vật chất của tế bào để tạo thành một số virus con mới. Do vậy cơ thể thực vật bị kiệt quệ dần dần, thoái hóa và suy tàn có khi bị chết. Khoảng thời gian từ lúc virus bắt đầu xâm nhiễm đến khi cây thoái hóa và chết phụ thuộc vào đặc điểm gây bệnh của các loài khác nhau và ph ụ thuộc vào từng loại cây cũng như sức chống chịu của từng cây. 2
  4.  Virus không thể phòng chống, tiêu diệt bằng xử lí các chất hóa học như những bệnh vi khuẩn, nấm và sâu bọ. Cách duy nhất để loại bỏ virus là phải loại bỏ những cây trồng bị bệnh. 1.1.2. Những thiệt hại của bệnh virus ở thực vật Do virus có cấu trúc di truyền đơn giản, nên khả năng nhân lên và lây lan trong tế bào vật chủ rất nhanh chóng và gây ra biểu hiện bệnh trong thời gian ngắn. Tác hại lớn nhất của virus là làm cho cây bị thoái hoá, giảm sức sống, dần tàn lụi. Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hưởng tới phẩm chất của các sản phẩm nông nghiệp. Sản phẩm từ cây bị nhiễm virus thường có chất lượng kém xa so với cây trồng bình thường. Hạt lúa bị bệnh vàng lụi thường bị lép không cho thu hoạch, trong trường hợp được thu hoạch hạt thường rất nhỏ và hạt gạo bị đen, khi ăn có vị đắng. Khoai tây bị virus gây hại làm cho cây cằn cỗi, lá khảm loang lổ, củ khoai nhỏ, hàm lượng tinh bột và các chất dinh dưỡng đều thấp. Citrus tristeza virus hại cam quít rất nặng tại vùng bờ biển Địa Trung Hải, Trung Mỹ và Đông Nam Á... Bệnh làm cho quả cam chín ép và rụng sớm, quả còn non đã úa vàng vỏ, nước cam nhạt không mùi vị. Việt Nam có chiều dài gần 2.000 km, khí hậu nhiệt đới gió mùa do vậy cây trồng, thảm thực vật Việt Nam và hệ sinh vật ở nước ta rất phong phú. Đây là điều kiện để bệnh virus ở Việt Nam đa dạng về chủng loại lại dễ lây lan , gây thiệt hại nghiêm trọng tới sản xuất. Gây hại nghiêm trọng nhất có thể kể tới các virus g ây b ệ nh trên cây lúa (b ả ng 1.1). Trong lịch sử trồng lúa ở nước ta đã xảy ra rất nhiều trận dịch lớn vào các năm 1910, 1920, 1940 -1945, 1964 -1969, 2006-2010 đã tiêu huỷ mấy chục vạn ha lúa, tốc độ lây lan rất nhanh. Cây lúa bị bệnh lúc đầu lá sẫm màu, sau đó cây lùn thấp lá xoè ngang, thâm lâu rễ đen, cây chết lụi nhanh chóng. Bệnh có thể xuất hiện từ một vài m2 sau đó lây lan ra hàng trăm, hàng nghìn ha. Làm cánh đồng lúa từ màu xanh biến thành màu nâu và chết lụi trong vòng 10 -15 ngày sau khi phát hiện bệnh. Gạo thu được từ lúa bị bệnh thường có màu sẫm, đắng không ăn được. Do đó, thiệt hại của bệnh có thể tính là 100% (1964 - 1968); đặc biệt dịch bệnh lúa lùn xoắn lá, lúa cỏ, lúa vàng lùn đã 3
  5. phá hoại ở miền tây Nam bộ trên diện tích trên 500.000 ha (năm 2006 - 2007). G ầ n đây (2009 -2010) virus gây b ệ nh lùn s ọ c đen trên lúa c ũng đã xu ấ t h i ệ n ở m ộ t s ố t ỉ nh phía B ắ c như Nam Đ ị nh, Thái Bình,… ( Bênh cây ̣ chuyên khoa - Vũ Triệu Mân ). M ộ t s ố v irus gây b ệ nh khác trên cây cà chua, khoai tây, lạc, đậu tương (bảng 1.1),… cũng có thể làm ảnh hưởng đến 80% năng suât cây trồng. ́ Bảng 1.1. Một số loại virus gây bệnh trên cây lương thưc va hoa mau ̣ ̀ ̀ Cây chủ Bệnh Virus gây hại Lúa Bênh vang la tungro ̣ ̀ ́ Rice Tungro Sperical virus-RTSV Bênh lua co ̣ ́ ̉ Rice Grassy Stunt Virus- RGSV Bênh lun xoăn la ̣ ̀ ́ Rice Ragged Stunt Virus- RRSV Bênh soc đen lun ̣ ̣ ̀ Rice Black Streaked Drap Virus- RBSDV Bênh kham la ngô ̣ ̉ ́ Ngô Maize Mosaic Virus- MMV Bênh kham lun ngô ̣ ̉ ̀ Maize Dawrf Mosaic Virus- MDMV Bênh xoăn vang la ca chua Tomato Yellow Leafcurl Virus- TYLV ̣ ̀ ́̀ Cà chua Bênh đôm heo ca chua ̣ ́ ́ ̀ Tomato Spotted Wilt Virus- TSWV Bênh kham la ca chua ̣ ̉ ́̀ Tomato Mosaic Virus- ToMV Bênh virus Y khoai tây ̣ Khoai Potato Virus Y- PVY Bênh virus A khoai tây ̣ tây Potato Virus A- PVA Bênh virus X khoai tây ̣ Potato Virus X- PVX Bênh virus S khoai tây ̣ Potato Virus S- PVS Bênh virus M khoai tây ̣ Potato Virus M-PVM Bênh cuôn la khoai tây ̣ ́ ́ Potato Leafroll Virus- PLRV Bênh kham Aucuba ̣ ̉ Potato Aucuba Mosaic Virus- PAMV Dưa Bênh kham dưa chuôt ̣ ̉ ̣ Cucumber Mosaic Virus- CMV chuôt ̣ 4
  6. 2.1.3 Biên phap phong chông ̣ ́ ̀ ́ Trên thế giới, nhiều biện pháp phòng trừ bệnh virus hại thực vật đã được áp dụng như loại bỏ nguồn bệnh, tiêu diệt côn trùng trung gian, diệt cỏ dại, luân canh cây trồng, dùng giống sạch bệnh hoặc giống chống bệnh, chịu bệnh. Dựa vào đặc điểm của từng loại virus gây hại và đặc tính cây trồng, người ta đã đề ra những biện pháp phòng trừ cho từng nhóm bệnh theo khả năng truyền lan và sự tồn tại của nguồn bệnh. 2.1.3.1 Sử dụng giống cây trông co kha năng kháng b ệnh virus ̀ ́ ̉ Phương pháp này đem lại hiệu quả cao, không gây ô nhiễm môi trường và tạo được cây sạch bệnh. Tuy nhiên biên phap g ặp nhiều hạn chế về số lượng giống ̣ ́ kháng bệnh cũng như nguồn vật liệu di truyền kháng virus phục vụ cho cho công tác lai tạo giống. Hơn nữa, năng suất và chất lượng của gi ống kháng cũng là điều đáng lưu tâm vì rất khó tích hợp được nhiều phẩm chất trong một giống cây trồng. 2.1.3.2 Sử dụng hat, giống cây trông sạch bệnh ̣ ̀ Sử dụng nguồn vật liệu giống sạch bệnh được xem là biện pháp quan trọng nhất để hạn chế bệnh virus ở nhiều loại cây trồng. Có thể tạo nguồn hạt giống, củ, cây giống sạch bệnh bằng những biện pháp như xử lý củ/hạt bằng nhiệt hoặc hóa chất hoặc nhân giống in vitro tạo củ hoặc cây con sạch bệnh. Nhược điểm của biện pháp này là cac loai cây trông co thê bị nhiêm virus trong qua trì nh canh tac trên ́ ̣ ̀ ́ ̉ ̃ ́ ́ đông ruông. ̀ ̣ 2.1.3.3 Biên phap canh tac ̣ ́ ́ Luân canh và xen canh có thể giảm bớt thiệt hại do sâu bệnh gây ra so với trồng thuần một loại cây trồng . Măt han chê cua biên phap nay la rât kho chon ̣̣ ́̉ ̣ ́ ̀ ̀́ ́ ̣ đươc hê thông luân canh và xen canh vưa co hiêu qua đôi vơi môt sô bênh quan ̣ ̣ ́ ̀ ́ ̣ ̉́ ́ ̣̣́ trọng mà vẫn đem lại lợi ích cao về mặt kinh tế . Mùa vụ thích h ợp giúp giảm thiệt hại do sâu bệnh gây ra mà còn giúp gia tăng năng suất rất đáng kể . Gieo trồng tránh mùa phát triển của côn trùng trung gian truyền bệnh (còn gọi là né bệnh) có thể hạn chế được một phần thiệt hại do virus gây ra. 5
  7. 2.1.3.4 Kiểm soát côn trùng trung gian truyền bệnh và loại bỏ các loại ký chủ trung gian nhƣ cỏ dại ,… Hiện nay phổ biến nhất là dung các loại thuốc trừ sâu và diệt cỏ để hạn chế các trung gian này. Tuy nhiên, nhiêu loai virus như TMV ̀ ̣ lây truyên qua đương cơ giơi, virus lây lan trưc tiêp qua khí không hoăc vêt thương ̀ ̀ ́ ̣ ́ ̉ ̣ ́ trên vât chu . Hơn nưa, viêc lam dung thuôc trư sâu co thê gây ô nhiêm môi trương , ̣ ̉ ̃ ̣̣ ̣ ́ ̀ ́ ̉ ̃ ̀ gây nguy hiêm cho nông dân va ngươi tiêu dung . Bên canh đo , virus co thê đươ c ̉ ̀ ̀ ̀ ̣ ́ ́ ̉ ̣ lây nhiêm vơi sô lương rât í t môi giơi truyên bênh , ví dụ : chỉ cần 1 con rây nâu / ̃ ́́ ̣ ́ ́ ̀ ̣ ̀ cây lua đa co thê truyên virus lun lua co (RGSV). ́ ̃́ ̉ ̀ ̀ ́ ̉ 2.1.3.5 Biện pháp công nghệ sinh học: Trong 15 năm qua một số virus đã có thể kiểm soát được thông qua biện pháp tạo cây trồng chuyển gen mang các gen hoặc đoạn gen có nguồn gốc từ chính các virus gây bệnh (Reddy el al., 2009). Các cấu trúc gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh được sử dụng chuyển vào cây trồng để tạo tính kháng có th ể là các loại khác nhau như: các cấu trúc của vius theo chiều xuôi (sense) hay chiều ngược (antisense) (Boogaart et al., 1998), các cấu trúc dạng kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) (Yin et al., 2005) và các miRNA nhân t ạo có đích là các trình tự gen của virus gây bệnh (Niu et la., 2006; Qu và Fang, 2008). Thành công trong việc ứng dụng công nghệ sinh học trong tạo giống cây trồng kháng bệnh virus được đánh dấu bởi công bố của Beachy và cộng sự năm 1986 khi những cây thuốc lá chuyển gen mã hóa protein vỏ của TMV (cấu trúc dạng sense) đã biểu hiện tính kháng với virus này (Beachy, 1990; Register và Nelson, 1992). Sau đó Beachy và cộng sự đã phát triển những thí nghiệm của mình thành phương pháp CP tạo cây trồng kháng virus. Phương pháp này đã được áp dụng tạo những dòng cây chuyển gen kháng nhiều loại virus gây bệnh trên thực vật hai lá mầm và sau đó là thực vật một lá mầm (xem tổng quan của Hull và Davies, 1992). Tuy vậy, các cây chuyển gen này chỉ kháng được duy nhất một chủng virus mang gen mã hóa protein vỏ mà nó chuyển vào. Điều này gây trở ngại trong vi ệc phát triển các giống cây trồng kháng virus dựa trên phương pháp CP do đ ộ đa dạng của virus thường khá cao (Scholthof et al., 1993). Tương t ự như phương pháp CP, biểu hiện gen mã hóa cho enzyme liên quan t ới quá trình tự sao chép hoặc sao mã (các replicase) cũng có thể tạo các cây chuyển gen kháng virus. Cũng nghiên cứu trên 6
  8. đối tượng TMV, Carr và cộng sự nhận thấy những dòng thuốc lá mang gen mã hóa cho replicase có khối lượng phân tử là 183kDa hoặc 54kDa có khả năng kháng TMV tốt hơn những dòng cây chuyển gen CP. Biểu hiện replicase của virus khoai tây X (potato virus X: PVX) hay virus kh ảm dưa chuột (cucumber mosaic virus: CMV) chứng minh hiệu quả bảo vệ thực vật của phương pháp này (Braun và Hemenway, 1992; Anderson và cộng sự, 1992). Tuy vậy, tương tự như phương pháp CP, phương pháp bảo vệ qua trung gian gen replicase cũng ch ỉ có tác dụng trên từng chủng virus. Hơn nữa, gen mã hóa cho các replicase thường rất lớn, gây trở ngại khi biểu hiện trên thực vật. Nhằm khắc phục những hạn chế của cấu trúc “dạng sense”, các cấu trúc dạng antisense mang một đoạn DNA có trình tự bổ sung với RNA của virus có thể ức chế sự phiên mã với những trình tự RNA tương đồng đã được nghiên cứu và phát triển. Nhiều dòng thuốc lá, khoai tây, cà chua,… kháng virus đã được tạo ra dựa trên kỹ thuật này.Việc sử dụng những đoạn DNA thay vì cả đoạn gen mã hóa đã làm nh ững dòng cây chuyển gen có khả năng kháng với nhiều dòng virus thay vì chỉ một vài dòng nhất định (Boogart et al, 1998). Cho tới những năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu nhất trong vi ệc chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật. Các bước chính trong kỹ thuật này bao gồm: (1) thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi, (2) biến nạp vector chuyển mang cấu trúc RNAi vào cây thông qua vi khu ẩn Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt các mRNA của virus gây bệnh, (3) sàng lọc các cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng virus của các cây chuyển gen (Tenllado et al., 2004). Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen mã hoá protein của virus (gen mã hóa protein vỏ CP, enzyme phiên mã RdRp,…) có kh ả năng kháng lại chính virus đó đã được chứng minh bằng thực tế trong những nghiên cứu tạo cây trồng kháng các loại virus khác nhau như: Potato virus Y PVY (Waterhouse et al., 1998; Smith et al., 2000), cucumber mosaic virus CMV (Kalantidis et al., 2002), Plum pox potyvirus PPV (di Nicola-Negri et al., 2005), Tobacco mosaic virus 7
  9. TMV và Potato virus Y PVY (Sun et al., 2005), , Tomato yellow leaf curl virus TYLCV (Zrachya et al., 2007)Rice tungro bacilliform virus RTBV (Tyagi et al., 2008) African cassava mosaic virus ACMV (Vanderschuren et al., 2009 )… Trong những nghiên cứu này, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo chiều thường được sử dụng để chuyển vào cây và s ẽ được biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen t ừ đó kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây. Ngư ời ta đã nhận thấy rằng khi vùng đệm của hpRNA được lặp lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả ihpRNA tạo ra sự bất hoạt gen là cao nhất (Smith et al., 2000; Wesley et al., 2001). Năm 2007, Bonfim và cộng sự đã tạo ra được một dòng cây đậu chuyển gen kháng virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93%. Cũng năm này, Shinichiro Kamachi và cộng sự đã công bố kết quả tạo ra được một số dòng thuốc lá chuyển gen CP trong cấu trúc ihpRNA có khả năng kháng cao với virus cucumber green mottle mosaic virus CGMMV đ ến thế hệ T2 (12/14 số cây kiểm tra) và những siRNA đã được phát hiện trong những dòng cây chuyển gen này. Nói chung, hầu hết các cây chuyển gen làm chậm sự tích lũy virus và làm chậm hoặc gi ảm nhẹ các triệu chứng bệnh (Gottula et al, 2009) Cho đến nay đã có các loại cây tr ồng chuyển gen kháng bệnh virus được công nhận và trồng thương mại như: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (papaya ringspot virus, PRSV) đã được công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc, Philippine; Bí đao chuyển gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã đư ợc công nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus, được công nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm để đ ược công nhận là giống cây trồng thương mại như: Sắn chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyển gen kháng Sweet 8
  10. potato feathery mottle virus (Potyvirus)…. (Reddy et al, 2009). 2.1.4. RNAi và cơ chế kháng bệnh bằng phƣơng pháp chuyển gen virus RNAi là một cơ chế căn bản để kiểm soát chuỗi thông tin di truyền hay cách vô hiệu hoá hoạt động của các gen xác định do hai nhà khoa học Andrew Z. Fire và Craig C. Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/12/1998 RNAi (RNA interference) được coi như một phương thức miễn dịch tự nhiên giúp sinh vật chống lại sự xâm nhập của virus RNA bằng cách phân huỷ các trình tự nucleotide tương đồng của chúng. Nó làm trung gian kháng lại cả acid nucleic ngoại bào và nội bào, cũng nhờ điều khiển sự biểu hiện gen mã hóa protein. Nó được thực hiện khi có sự xuất hiện của phân tử RNA mạch kép trong cơ thể sinh vật gây nên ức chế sự biểu hiện gen của một loại trình tự đặc hiệu. Hình 1.1: Cơ chế gây bất hoạt gen c ủa RNAi Cơ chế RNAi được bắt đầu bằng việc phân cắt phân tử RNA chuỗi kép (dsRNA) bởi enzyme Dicer - một trong những enzyme thuộc họ RNase III, tạo thành các phân tử RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích thước khoảng 21 - 26 nucleotide. Các siRNA này được giải xoắn và một mạch gắn kết với một phức hợp protein một cách chọn lọc gọi là phức hợp cảm ứng sự bất hoạt RNA (RISC – RNA Induced Silencing Complex). Argonaute (protein Argonaute) trong RISC có 9
  11. chứa RNase-H hoạt động nhờ một endonuclease sẽ tách siRNA thành những chuỗi RNA đơn, trong đó chỉ có một chuỗi đơn RNA có đầu 5‟ có lực bắt cặp base (base pairing) nhỏ nhất được chọn để tiếp tục đi vào phức hệ RISC. Sau đó, RISC sẽ thu nhận các phân tử phiên mã mRNA nội sinh của tế bào có trình tự tương đồng với trình tự của chuỗi siRNA đang có mặt trong phức hệ bằng cách bắt cặp với các base theo nguyên tắc bổ sung. Khi đã được nhận diện các mRNA nhanh chóng bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi xoắn kép siRNA-mRNA và bị tiêu hủy bởi các RNA nuclease (Helicase) có trong RISC. S ợi RNA bị phân cắt, tiếp tục hình thành các siRNA. Quá trình tiếp diễn liên tục nhờ vậy sẽ phân hủy các bản mã sao hình thành, kết quả là ức chế biểu hiện của gen mong muốn. 2.1.5. Môt sô th ành tựu của cây trồng chuyển gen kháng virus ở Việt Nam ̣́ Virus la nguyên nhân gây hai tơi nhiêu loai cây trông trên thê giơi cung như ơ ̀ ̣́ ̀ ̣ ̀ ́ ́ ̃ ̉ Viêt Nam. Hâu hêt cac bênh thưc vât do virus gây ra cho tơi nay chưa co thuôc đăc ̣ ̀ ́́ ̣ ̣ ̣ ́ ́ ́ ̣ trị, do vậy tạo giống cây trồng kháng bệnh virus là mục tiêu nhiều nghiên cứu tại nươc ta. Tư năm 1999, phòng Công nghệ tế bào thực vật , viên Công nghê sinh hoc ́ ̀ ̣ ̣ ̣ phôi hơp vơi 5 nươc trong khu vưc ASEAN tham gia vao chương trì nh nghiên cư u ́ ̣ ́ ́ ̣ ̀ ́ phát triển cây đu đủ chuyển gen kháng virus đốm vòng (Papaya ringspot virus : PRSV) do tô chưc ISAAA (International Service for Acquisition of Agri -biotech ̉ ́ Application) tài trợ . Trong khuôn khô đê tai nhom thưc hiên đa phân lâp đươc g en ̉̀̀ ́ ̣ ̣ ̃ ̣ ̣ CP cua môt sô chung virus tai miên Băc va Nam Trung Bô . Gen CP đươc sư dung ̉ ̣́ ̉ ̣ ̀ ́ ̀ ̣ ̣ ̣̉ để thiết kế các cấu trúc chuyển gen vào cây đu đủ nhằm tạo cây chuyển gen kháng virus đôm vong . Môt sô dong cây đu đu chuyên gen đa biêu hiên tính kháng virus ́ ̀ ̣́̀ ̉ ̉ ̃̉ ̣ sau khi thư nhiêm bênh nhân tao (Lâm Đai Nhân, 2000; Lê Trân Bì nh, 2008) ̉ ̃ ̣ ̣ ̣ ̀ Thơi gian gần đây đã có một số nghiên cứu theo hướng ứng dụng kỹ thuật ̀ RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus gây ra. Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học do GS. Lê Trần Bình và TS . Chu Hoàng Hà đứng đầu là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus . Một trong những kết quả của đê tài cấp Viện KH &CN Viêt Nam đươc tiên hanh ̀ ̣ ̣ ́ ̀ 10
  12. trong 2 năm 2007-2008: “Nghiên cưu ưng dung ky thuât RNAi trong tao giông cây ́́ ̣ ̃ ̣ ̣ ́ trông chuyên gen khang bênh virus” là đã tạo được các cây thuốc lá chuyển gen ̀ ̉ ́ ̣ kháng virus khảm dưa chuột (CMV), khán g virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus trên. Hình 1.2: Dòng thuốc lá T -CMV -49 biêu hiên khang bênh hoan toan va cây đôi ̉ ̣ ́ ̣ ̀ ̀ ̀ ́ chưng WT2- 1 sau 3 lân lây nhiêm ́ ̀ ̃ Tiêp đo , đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu tạo giống cây ăn qua khang bênh ́ ́ ̉ ́ ̣ virus phô rông băng chuyên gen đa đoan” (KC.04.03/06-10) đa thiêt kê thanh công ̣̉ ̀ ̉ ̣ ̃ ́́̀ 2 đoan gen nhân tao mang đa đoan gen CP , Nib va HC -pro cua PRSV gây bệnh ̣ ̣ ̣ ̀ ̉ đốm vòng trên cây đu đủ và 2 đoan gen đa đoan RdRp -CP-p20-p23 của virus tàn ̣ ̣ lụi (Citrus tristeza virus , CTV) và thiết kế thành công những cấu trúc RNAi mang các gen đa đoạn này . Thư nghiêm tí nh khang vơi cac dong đu đu va cam chuyên ̉ ̣ ́ ́́ ̀ ̉̀ ̉ gen mang câu trúc RNAi trên cho thấy sự có mặt của vir us gây bênh trên cac dong ́ ̣ ́ ̀ cây chuyên gen nhưng không thây cây co biêu hiên bênh (Chu Hoang Ha, 2010). ̉ ́ ́ ̉ ̣ ̣ ̀ ̀ 11
  13. Hình 1.3: Dòng đu đủ biêu hiên khang bênh hoan toan ̉ ̣ ́ ̣ ̀ ̀ (hình A) và cây đối chưng (hình B) sau 2 tháng lây nhiễm ́ Đây la cơ sơ quan trọng chứng tỏ khả năng làm chủ công nghệ RNAi của các nhà ̀ ̉ khoa hoc Viêt Nam va mơ ra kha năng ưng dung công nghê RNAi đôi vơi cac đôi ̣ ̣ ̀̉ ̉ ́ ̣ ̣ ́ ́́ ́ tương cây trông khac. ̣ ̀ ́ 2.2. Cây thuôc la - mô hì nh nghiên cƣu tao cây trông chuyên gen kha ng virus ́́ ́ ̣ ̀ ̉ ́ 2.2.1 Giơi thiêu chung vê cây thuôc la ́ ̣ ̀ ́́ Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotiana sp; thu ộc ho (Family) : Solanaceae ̣ (họ cà), chi (Genus): Nicotiana, loài (Species): Nicotiana tabacum L. Các nhà khoa học đã phân chia Nicotiana thành 3 chi phu , 14 phân chi va 65 ̣ ̀ loài. Trong sô 65 loài là cây bản địa Bắc và Nam Mỹ , 15 loài bản địa Australia ́ trong đó loài N . tabacum thuôc phân chi Genuinae la đươc gieo trông thương mai ̣ ̀ ̣ ̀ ̣ trên khăp thê giơi. Ở Việt Nam, cây thuốc lá đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nông ́ ́ ́ dân và thu nhập quốc gia. Theo thống kê của Tổng công ty thuốc lá Việt Nam (Vinataba) trong 3 năm (2006 -2008) tổng doanh thu đạt 47.656 tỷ đồng, nộp ngân sách nhà nước được 9.653 tỷ đồng, kim ngạch xuất khẩu đạt 192,136 triệu USD, việc làm của người lao động được đảm bảo, đời sống từng bước được nâng cao với thu nhập bình quân đầu người tăng 15,59%/ năm. Thuốc lá có giá trị kinh tế cao, ngoài việc tiêu dùng trong nước nó còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Ngoài ra, 12
  14. cây thuôc la con đươc coi la mô hì nh đê tiên hanh nhiêu nghiên cưu sinh hoc cơ ́́̀ ̣ ̀ ̉́ ̀ ̀ ́ ̣ bản về chức năng , vai tro cung như cơ chê hoat đông cua cac gen cung như đươc ̀̃ ́ ̣ ̣ ̉ ́ ̃ ̣ sư dung lam mô hì nh thư nghiêm va phat triên nhưng nghiên cưu ứng dụng như ̣̉ ̀ ̉ ̣ ̀ ́ ̉ ̃ ́ biêu hiên cac protein tai tô hơp co gia trị . ̉ ̣ ́ ̣́̉ ́ ́ 2.2.2. Tình hình bệnh virus hại thuốc lá Hiên nay , bênh virus la môt trong nhưng nguyên nhân làm gi ảm năng suât va ̣ ̣ ̣̀ ̃ ́̀ chât lương cây thu ốc lá nguyên liệu. Trong đo , virus khảm thuốc lá (TMV) và ́ ̣ ́ virus khảm dưa chuột (CMV) là hai virus gây bệnh phổ biến và nghiêm trọng nhất (Nguyên Văn Chí n va Nguyên Ngoc Bí ch, Tông công ty thuôc la Viêt Nam). ̃ ̀ ̃ ̣ ̉ ́́ ̣ Bênh kham la xuât hiên kha sơm ngay sau khi cây phuc hôi ho àn toàn với tỷ lệ ̣ ̉ ́ ́ ̣ ́́ ̣ ̀ thâp (2,3-5,2%) và tăng dần hoặc tăng nhanh sau 20-50 ngày tùy theo vùng , tư ́ ̀ 18,5-26,5% thâm chí lên tơi 100% như ơ xa Lâu Thương , tỉnh Thái Nguyên; trong ̣ ́ ̉̃ ̣ đo giông thuôc la rât mân cam vơi TMV va CMV chu yê u la K 326. Thiêt hai do ́ ́ ́ ́́ ̃ ̉ ́ ̀ ̉́ ̀ ̣̣ virus gây ra ơ cây thuôc la lên đên hang chuc ty đông ̉ ́́ ́ ̀ ̣̉̀ (Nguyên Văn Chí n va ̃ ̀ Nguyên Ngoc Bí ch, 2008) ̃ ̣ Đối với bệnh do virus nói chung và bệnh khảm lá do hai virus TMV và CMV gây ra noi riêng hiên vân chưa co loại thuốc hóa học nào khả dĩ có thể phòng trị ́ ̣ ̃ ́ đươc môt cach hưu hiêu , do đo cac biên phap phong bênh tôt nhât la sư dung cac ̣ ̣́ ̃ ̣ ́́ ̣ ́ ̀ ̣ ́ ̣́̀̉ ́ hạt giống sạch bệnh để trồng , không sư dung cac hat giông tư cac ruông trươc đo ̣̉ ́ ̣ ́ ̀́ ̣ ́ ́ đa bị bệnh nói trên để làm giống cho vụ sau . Thương xuyên kiêm tra đông ruông ̃ ̀ ̉ ̀ ̣ để phát hiện và phun thuốc diệt trừ các loại côn trùng chích hút như bọ cách tơ , bọ phân, rêp muôi…băng cac loai thuôc trư sâu đê tranh lây lan . Khi phat hiên cac ́ ̣ ̣ ̀ ́ ̣ ́ ̀ ̉́ ́ ̣ ́ triêu chưng bênh trên đông ruông cân tâp trung nhô cây , đem ra khoi ruông tiêu ̣ ́ ̣ ̀ ̣ ̣̀ ̉ ̉ ̣ hủy để tránh lây lan. 2.2.3. Virus gây bênh kham thuôc la (Tobacco mosaic virus, TMV) ̣ ̉ ́́ TMV thuộc loại Tobamovirus là một trong những virus gây hại trên thực vật được mô tả sớ m nhất bởi Mayer (1886), Iwanowski (1892), Allard (1914) và Stanley (1935) (Kung and Yang, 1998). 13
  15. TMV là virus hình que có chiều dài 300 A0, đường kính từ 150-170 A0 có cấu tạohình ống rỗng và protein sắp xếp cuộn xoắn xung quanh lõi trung tâm. TMV là virus đơn dương (ssRNA) có hình cu ộn xoắn. Dạng que hoàn chỉnh của TMV có 2130 đơn vị hợp thành capsid (capsomeres), cứ 6 capsomer tạo thành một vòng xoắn. (Stryer Lubert, 1988). Genome của TMV gồm 6400 nucleotide được chia thành 4 khung đọc mở (open reading frames - ORFs). RNA của TMV có cấu trúc mũ 7-methylguanosine ở cuối đầu 5‟ (Zamore et al., 2000), n ối tiếp 68 nucleotide không mã hóa trợ giúp quá trình dịch mã (Gallie et al., 1987). Tiếp theo vùng này là hai vùn g mã hóa cho các protein với kích thước tương ứng là 183kDa và 126 kDa (Goelet et al., 1982). Đây là protein có vai trò quan tr ọng trong quá trình sao chép của virus. Vùng mã hóa th ứ 3 mã hoá cho protein cần thiết cho sự di chuyển qua gian bào của virus (Meishi et al., 1987) có kh ối lượng phân tử khoảng 30 kDa. Protein vỏ (CP) có khối lượng phân tử 17,5kDa nằm trong vùng mã hóa thứ 4. Hình 1.4. Cấu trúc TMV và tổ chức hệ gen (Chapman, 1998) Vị trí của các ORF của hệ gen RNA được biểu thị bởi các hình chữ nhật. Kích thước của protein (kDa) tương ứng với các ORF trên được chỉ ra trong ngoặc. Vỏ protein với kích thước 17,5 kDa được mã hoá bởi ORF thứ 4. Các đặc điểm của hệ gen và các subgenomic được chú thích ở phía trên và bên dưới. Gen CP của TMV theo sau vùng không dịch mã có chứa vài trình tự pseudoknot, trình tự này liên quan đến sự tăng cường dịch mã (Leather et al., 1993). Tại đầu 3‟ của hệ gen RNA mang cấu trúc giống RNA vận chuyển (tRNA) có thể được aminoacyl hóa. CP là protein cần thiết cho quá trình hình thành virion và có th ể điều khiển sự lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác của virus (Saito et al., 14
  16. 1990; Kawakami et al., 2004). Vai trò của gen CP cũng cho phép sử dụng gen CP làm nguyên liệu cho tạo cây trồng chuyển gen kháng virus TMV bằng cơ chế bất hoạt RNA (RNA interference) (Yan et al., 2007) TMV có thể gây bệnh ít nhất 199 loài trong 35 h ọ (Shew and Lucas, 1991) thực vật khác nhau nhưng nhiều nhất là trên cây thuốc lá . Khi cây bị bênh ̣ các lá non đều biến màu thành dạng khảm bao gồm các vùng xanh nhạt xanh đậm không đông đêu xen lân nhau , hình loang lổ như da ếch , hay con goi la dang ̀ ̀ ̃ ̀ ̣̣̀ khảm. TMV được lan truyền bằng đường cơ giới do tiếp xúc virus thâm nhập vào các tế bào qua các vết thương và qua khí khổng lá, thân hoặc rễ. TMV rất bền như ở dạng kết tủa cồn, ở lá khô virus vẫn còn hoạt tính gây bệnh sau một năm. Trong nhiều trường hợp TMV phối hợp với virus X khoai tây (PVX) cùng gây hại trên cà chua gây ra bệnh đốm sọc đôi (double virus streak hay là Mixed virus streak). Bệnh nặng làm đầu lá bị khô và ngọn cà chua bị chết (Gibbs, 1999). 15
  17. Chƣơng 2. VÂT LIÊU VA PHƢƠNG PHAP NGHIÊN CƢU ̣ ̣ ̀ ́ ́ 2.1 Vât liêu ̣ ̣ 2.1.1. Vât liêu thƣc vât : ̣ ̣ ̣ ̣ Hạt thuôc la Nicotiana tabacum L. (giống K326) thế hệ T1 chuyên gen mang câu ́́ ̉ ́ trúc TMV_RNAi do phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp 2.1.2. Hóa chất, máy móc, thiêt bị ́ - Hóa chất: Yeast extract, Agarose, K2PO4, KH2PO4, SiC, HCl, NaOH, MgCl2, Etanol 70%, nươc Javen, nươc khư ion, kháng sinh kanamycin, Taq DNA ́ ́ ̉ polymerase va cac hoa chât thông dung khac ̀́ ́ ́ ̣ ́ - Máy móc, thiêt bị : Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di ́ Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech , Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant , Mỹ), máy ly tâm , cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ Tế bào Thực vât, Viên Công nghê Sinh hoc ̣ ̣ ̣ ̣ 2.2. Phƣơng phap nghiên cứu ́ 2.2.1. Khử trùng hạt thuốc lá 2.2.1.1. Khử trùng hạt bằng dung dịch Javel Ngâm hạt trong cồn 70% khoảng 20‟‟, lắc nhẹ sau đó loại bỏ cồn bằng pippet khử trùng. Ngâm hạt trong dung dịch tẩy (Javel thương phẩm 10-30% có bổ sung Tween20 0,05-0,1%) khoảng 20‟ có lắc nhẹ. Sau khi loại bỏ dung dịch tẩy bằng pippet, rửa hạt 4-5 lần bằng nước cất khử trùng. 2.2.1.2. Khử trùng hạt bằng khí Clo 16
  18. Hạt thuốc lá được cho vào từng ống eppendorf, mở nắp và cho vào bình Pyrex dung tí ch 250ml. Mở hé ¼ nắp bình Pyrex có chứa hạt thuốc lá và đặt bên cạnh cốc thủy tinh chứa 100ml dung dịch Javel. Dùng pipet thủy tinh hút lấy 3ml HCl đặc cho vào cốc thủy tinh đựng Javel để tạo khí Clo sau đó đậy kín bình khử trùng và dán parafin. Sau 3-9h tháo parafin và mở hé ¼ năp bình khử trùng trong ́ khoảng 2 phút để bay hết khí, sau đo vặn chặt nắp bình Pyrex và lấy ra ngoài. Mở ́ nắp bình Pyrex trong box c ấy 30 phút để bay hết khí và cấy hạt trên môi trường. 2.2.2. Phân tí ch sƣ phân ly của gen chuyển ̣ Gieo hạt và đánh giá tỉ lệ kháng kanamycine - Gieo hạt trên đĩa nhựa chứa môi trường MS - Sau khi cây con mọc cao khoảng 1cm thì chuyển sang bình tam giác 250ml chứa môi trường MS + kanamycine 50mg/l. M ỗi dòng chuyển 80 cây và đặt 10 cây/ bình tam giác - Sau 3-4 tuần quan sát, đánh giá số lượng cây sống sót trên môi trường có kanamycine 2.2.3. Phân tích sự có mặt của gen chuyển bằng phƣơng pháp PCR 2.2.3.1. Tách ADN tổng số: - Nghiền mẫu lá (khoảng 50 mg) trong ống eppendorf 2 ml bằng nitơ lỏng - Thêm 500 l “Shorty Buffer” (0,2 M Tris-HCl pH9; 0,4 M LiCl; 25 mM EDTA; 1% SDS và nước đề ion khử trùng ) - Ly tâm 13000 v/p - Hút 350 l dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml có sẵn 350 l isopropanol - Đảo nhẹ và ly tâm 13000 v/p - Loại dịch nổi, làm khô cặn - Bổ sung 50-100 l nước đề ion khử trùng để hòa tan cặn. - DNA được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%. 17
  19. 2.2.3.2. Phản ứng PCR Phản ứng PCR được tiến hành với cặp mồi TMV-Fi/ TMV-Ri với trình tự như sau: TMV-Fi: 5‟- CACCATGAAACCTTCACCACA -3‟ TMV-Ri: 5‟- CTAGGTCCAAACCAAACCAG-3‟ Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR Thành ph ần Thể tích (µl) STT 1 Nước cất khử ion, khử trùng 10,1 + 2 Buffer PCR (NH 4) 2 3 MgCl2 2 4 dNTPs 1,6 Primer – Fi 5 0,8 Prim er – Ri 6 0,8 7 Taq polymerase 0,2 8 Template 2,5 Tổng 20 Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Nhiệt độ (OC) Bước Phản ứng Thời gian Chu kì Biến tính 1 94 3 phút 1 Biến tính 2 94 1 phút Gắn mồi 3 50 1 phút 25 Kéo dài chu ỗi 4 72 1 phút Hoàn tất kéo dài 5 72 10 phút 1 Kết thúc phản ứng ∞ 6 4 2.2.4. Phƣơng phap lây nhiêm virus nhân tao ́ ̃ ̣ 18
  20. Các cây chuyển gen sau khi trồng ngoài nhà lưới cao khoảng 10-30 cm đươc kiêm ̣ ̉ tra tí nh khang virus nhân tao cua Herbers va cac công sư (1996) có cải tiến. Các ́ ̣ ̉ ̀́ ̣ ̣ bươc tiên hanh như sau: ́ ́ ̀ - Mẫu lá bị bệnh được nghiền trong đệm phosphat 100 mM (~1g mẫu lá trong 20 ml buffer) với pH = 7. - Lá lây nhiễm được gây tổn thương nhẹ bằng SiC. - Cho dịch virus lên phần lá đã gây xước, sau vài phút rửa lá bằng nước. - 10-20 ngày sau khi lây nhiễm, triệu chứng sẽ xuất hiện trên cây. - Có thể lây nhiễm thêm nếu sau khi lây nhiễm lần 1 không thấy bệnh biểu hiện trên cây WT. - Đánh giá kiểu hình của các cây lây nhiễm nhân tạo sau 10-20 ngày 2.2.5. Phƣơng phap ELISA ́ Lấy 200 mg lá non (lá thứ 3 hoặc thứ 4 từ trên xuống) nghiền thành dịch - đồng nhất với 2 ml đệm PBST (16 mM Na2HPO4, 3,9 mM Na H2PO4, 127 mM NaCl và 0,05 % Tween 20 (pH 7,2)) có chứa 0,1 % albumin bò (Sigma). - Dịch nghiền được ly tâm ở 5000 v/p, 4 oC, 10 phút. - Thu dịch nổi (gọi là kháng nguyên). Từ đ ĩa 96 giếng, bổ sung 200 l kháng nguyên vào mỗi giếng và ủ 37 oC khoảng 1 h. - Sau khi, rửa 3 lần với đệm PBST, kháng thể (IgG) kháng CMV, TMV và PVY được hòa tan vào đệm PBST theo tỷ lệ thích hợp, sẽ được bổ sung vào những giếng có kháng nguyên và ủ 37 oC trong 1 h. - Đĩa được rửa lại 3 lần trước khi thêm 200 l alkaline phosphatse-kết hợp đoạn F(ab‟)2 đã tinh sạch từ IgG thỏ hòa tan 1:2000 trong bệm PBST chứa 0,1 % albumin bò. 19
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược