- Trang Chủ
- Báo cáo khoa học
- BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI: ĐIỀU TRA, NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT VÀ KHÁNG DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ TỪ XẠ KHUẨN
Xem mẫu
- ð I H C QU C GIA HÀ N I
VI N VI SINH V T VÀ CÔNG NGH SINH H C
========000========
BÁO CÁO K T QU TH C HI N
ð TÀI KHCN ð C BI T C P ð I H C QU C GIA
Tên ñ tài: ði u tra, nghiên c u m t s ho t ch t có kh năng kháng vi sinh v t
và kháng dòng t bào ung thư t x khu n
Mã s : QG. 09. 48
Ch trì ñ tài: TS. Nguy n Huỳnh Minh Quyên
Cơ quan: Vi n Vi sinh v t & Công ngh Sinh h c
Hà N i, năm 2011
- M CL C
PH N I. BÁO CÁO TÓM T T 3
B ng ti ng Vi t 3
B ng ti ng Anh 8
PH N II. BÁO CÁO T NG K T 12
Gi i thích ch vi t t t 13
Danh sách nh ng ngư i tham gia th c hi n ñ tài 13
Danh m c các b ng và hình 14
ðU
M 15
CHƯƠNG I. T NG QUAN TÀI LI U 16
1.1 Kháng sinh 16
1.1.1. Khái ni m chung 16
1.1.2. L ch s phát tri n kháng sinh 16
1.1.3. Phân lo i kháng sinh 18
1.1.4. Kháng sinh kháng kh i u 21
1.1.5. Nhu c u phát tri n kháng sinh m i 21
1.2 X khu n 22
1.2.1. Các ñ c ñi m chung 22
1.2.2. X khu n và các ch t th sinh 23
1.3 Tình hình nghiên c u x khu n Vi t Nam 23
1.4 N i dung và m c ñích c a nghiên c u 24
CHƯƠNG II - NGUYÊN V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 25
2.1. Nguyên v t li u 25
2.1.1. ð i tư ng nghiên c u 25
2.1.2. Hóa ch t 25
2.1.3. Thi t b , d ng c s d ng trong nghiên c u 25
2.2. Phương pháp nghiên c u 25
2.2.1. Phương pháp phân l p x khu n 25
2.2.2. Các vi sinh v t ki m ñ nh 26
2.2.3. Sàng l c x khu n sinh kháng sinh 27
2.2.4. Chi t b ng ethyl-acetate 28
2.2.5. S c ký các ch t chi t thu ñư c 28
2.2.6. Sàng l c ch ng x khu n sinh anthracycline 29
2.2.7. Phép th ñ c t bào 30
1
- 2.2.8. Các phương pháp phân lo i x khu n 30
CHƯƠNG III. K T QU VÀ TH O LU N 32
3.1. ða d ng sinh h c các ch ng x khu n thu th p ñư c
Vư n Qu c gia Cát Bà 32
3.2. Sàng l c x khu n sinh kháng sinh 33
3.3. Hi u qu tách chi t d ch nuôi c y các ch ng x khu n ch n l c ñư c 35
3.4. Phân tích s c ký d ch nuôi các ch ng x khu n chi t trong ethyl acetate 36
3.4.1. S c ký b n m ng (TLC) 36
3.4.2. S c ký l ng hi u năng cao (HPLC) 38
3.5. ð c ñi m nh n d ng c a các ch ng x khu n ch n l c ñư c 42
3.5.1. ð c ñi m hình thái c a các ch ng thu c Streptomyces 42
3.5.2. Gi i trình t rDNA 16S ñ i v i các ch ng x khu n thu c chi Nonomuraea 44
3.6. Sàng l c kh năng sinh anthracyline c a các ch ng x khu n ch n l c ñư c 45
3.7. Các nghiên c u liên quan ñ n các ch ng có ho t tính ñ c t bào 46
3.7.1. Ho t tính gây ñ c t bào 46
3.7.2. Phân tích HPLC d ch nuôi chi t trong ethyl acetate
c a các ch ng có ho t tính ñ c t bào 47
K T LU N VÀ KI N NGH 53
TÀI LI U THAM KH O 55
PH L C 62
2
- PH N I. BÁO CÁO TÓM T T
1. Tên ñ tài: ði u tra, nghiên c u m t s ho t ch t có kh năng kháng vi sinh
v t và kháng dòng t bào ung thư t x khu n
2. Mã s :QG.09.48
3. Th i gian th c hi n: 2 năm (2009 - 2011)
ð i h c Qu c gia Hà n i
4. C p qu n lý:
5. Ch trì ñ tài: TS. Nguy n Huỳnh Minh Quyên
Vi n Vi sinh v t và Công ngh sinh h c - ðHQGHN
ði n tho i: 37547694; Fax: 37547407; Email: quyennhm@vnu.edu.vn
- TS. Nguy n Quỳnh Uy n
6. Cán b tham gia:
TS. ðinh Thúy H ng
-
CN. Lê Phương Chung
-
- ThS. Phan Th Hà
- CN. Lê H ng Anh
7. M c tiêu và n i dung nghiên c u
Nghiên c u này nh m tìm hi u s ña d ng sinh h c và sàng l c các ch ng x
khu n có ho t tính kháng vi sinh v t trong b sưu t p các ch ng x khu n thu th p t ñ o
Cát Bà, m t vư n qu c gia có ña d ng sinh h c cao Vi t Nam. Các ch t kháng sinh do
các ch ng l a ch n sinh ra ñư c ti p t c nghiên c u nh m tìm ki m b n ch t c a chúng.
C th là:
- Phân l p x khu n t m u ñ t và lá m c ñ o Cát Bà, H i Phòng qua ñó ñánh
giá m c ñ ña d ng c a ñ i tư ng
- Sàng l c các ch ng có ho t tính kháng sinh cao
- Tách chi t sơ b thu các ch t có ho t tính kháng sinh t các ch ng ch n l c ñư c
- Nghiên c u tính ch t c a các ch t kháng sinh thu ñư c b ng s c ký b n m ng
(TLC) và s c ký l ng hi u năng cao (HPLC).
- Phân lo i, ñ nh danh các ch ng x khu n (b ng mô t hình thái ho c b ng gi i
trình t gene 16S c a rDNA) có ho t tính kháng sinh cao.
3
- - Th nghi m ho t tính kháng các dòng t bào ung thư ngư i c a ch t chi t t d ch
nuôi c a m t s ch ng có ti m năng
- Phân tích HPLC ch t chi t t d ch nuôi c a các ch ng có ho t tính kháng t bào
ung thư làm cơ s cho nghiên c u b n ch t c a các h p ch t ñó.
8. Các k t qu ñ t ñư c
8.1. K t qu v m t khoa h c
- 424 ch ng x khu n (g m 353 ch ng t m u ñ t và 71 ch ng t m u lá cây m c) thu
th p t i vư n Qu c gia ñã ñư c phân lo i (b ng quan sát hình thái k t h p v i ñ c
trình t gene rDNA 16S) cho th y g n 70% thu c chi Streptomyces, còn l i thu c
nhóm x khu n hi m. Các chi x khu n hi m có t l cao trong b sưu t p này là
Micromonospora (hơn 7% trong t ng s 424 ch ng), Nonomuraea (4%) và Nocardia
(g n 3%).
- 424 ch ng x khu n này ñã ñư c sàng l c ho t tính kháng sinh v i 4 vi sinh v t ki m
ñ nh ñ i di n cho 3 nhóm vi sinh v t l n là vi khu n (Gram âm: Escherichia coli,
Gram dương: Micrococcus luteus), n m men (Candida albicans) và n m s i
(Fusarium oxysporium).
- 115 ch ng trong s 424 ch ng nói trên ñã bi u hi n ho t tính kháng ít nh t m t trong
b n vi sinh v t ki m ñ nh.
- V i 115 ch ng có ho t tính này có 2 ch ng (A1073, A1393) kháng c 4 ch ng vi sinh
v t ki m ñ nh, 7 ch ng (A232, A390, A1018, A1022, A1041, A1043 và A1470)
kháng v i 3 ch ng ki m ñ nh, 8 ch ng (A45, A149, A154, A160, A396, A410, A427
và A444) có ho t tính kháng 2 vi sinh v t ki m ñ nh. Xét v ñ i tư ng b kháng thì 14
ch ng có ho t tính kìm hãm vi khu n Gram âm (E. coli), 14 ch ng kìm hãm vi khu n
Gram dương (M. luteus); 11 ch ng có ho t tính kháng c hai nhóm vi khu n; 12 ch ng
có ho t tính kháng n m s i (F. oxysporium) và ch 6 ch ng có ho t tính kháng n m
men (C. albicans). Như v y t ng c ng có 17 ch ng có ho t tính kháng ít nh t 2 vi sinh
v t ki m ñ nh ñã ñư c l a ch n cho các nghiên c u ti p theo. ði u thú v là 17 ch ng
này ch thu c 2 chi Streptomyces (10 ch ng) và Nonomuraea (7 ch ng).
- 17 ch ng ñã ñư c nuôi c y thu d ch nuôi và d ch nuôi ñã ñư c chi t b ng ethyl acetate
ñ thu các h p ch t có ho t tính sinh h c. Hi u qu chi t ch t tan trong ethyl acetate
(t 1 lít d ch nuôi c y) dao ñ ng t 30mg (ch ng A154) ñ n 2152mg (ch ng A444).
4
- So v i ch t khô thì ch t chi t ñư c chi m t 0,51% (ch ng A154) ñ n 14,89% (ch ng
A396).
- Các ch t tan trong ethyl acetate c a d ch nuôi 17 ch ng x khu n ñã ñư c phân tích
s c ký b n m ng (TLC) ñ so sánh v i ba kháng sinh là chloramphenicol, kitasamycin,
erythromycin và v i d ch nuôi c a ch ng ñ i ch ng sinh anthracycline (A16). S băng
thu ñư c sau s c ký dao ñ ng t 1 ñ n 4 băng. Có 8 ch ng (A149, A154, A160, A232,
A410, A427, A1073, A1393) ch cho 1 băng, 3 ch ng (A396, A444, A1018) cho ph
có 2 băng, 4 ch ng (A45, A1041, A1043, A1470) cho ph 3 băng và 2 ch ng (A390,
A1022) cho ph 4 băng. So v i các kháng sinh chu n thì th y ch t chi t t d ch nuôi
c a ch ng A396 là có băng tương ng v i chloramphenicol; ch t chi t t d ch nuôi
ch ng A45 và A410 có băng trùng v i băng c a erythromycin, không có m u nào có
băng tương ñ ng v i các băng c a kháng sinh kitasamycin. So v i d ch nuôi c a
ch ng ñ i ch ng sinh anthracycline, các m u A1018 và A1022 có ph s c ký r t g n
v i ñ i ch ng này.
- Các ch t tan trong ethyl acetate c a 17 ch ng l a ch n ñư c ñư c ti p t c phân tích
qua s c ký l ng hi u năng cao (HPLC) v i các ñi u ki n s c ký như v i các kháng
sinh chu n. K t qu cho th y ngoài ch ng A396 có ñ nh tương t v i ñ nh thu ñư c t
chloramphenicol, t t c các m u còn l i không tìm th y m i tương quan nào so v i các
kháng sinh ñ i ch ng.
- M t trong nh ng nghiên c u n a ñư c th c hi n v i 17 ch ng ch n l c ñư c là th c
hi n th nghi m bi n ñ i màu ph thu c pH. ðây là phép th ñ c hi u ñ i v i các
ch ng sinh kháng sinh thu c nhóm anthracycline. Qua ñó nh n th y có hai ch ng có
bi u hi n dương tính v i phép th này là A1018 và A1073.
- Như v y v i các bư c nghiên c u liên quan, t 17 ch ng có ho t tính kháng sinh
tương ñ i cao, 3 ch ng ñư c l a ch n th nghi m ho t tính gây ñ c t bào ung thư
ngư i là A1018 (có ph TLC và ph n ng ñ i màu pH tương t ch ng ñ i ch ng),
A1022 (có ph TLC tương t ñ i ch ng) và A1073 (ph n ng ñ i màu pH).
- B ng th nghi m v i ba dòng t bào ung thư ngư i là ung thư gan, ph i và cơ vân tim,
các h p ch t chi t t d ch nuôi c a c ba ch ng ch n l c ñư c c a ñ tài ñ u có tác
d ng dương tính v i c ba dòng t bào ung thư. So sánh v ch s IC50 (n ng ñ gây
ch t 50% t bào ung thư, t c ch s này càng nh thì hi u qu gây ñ c t bào càng l n)
thì th y trong ba m u nghiên c u ch t chi t t d ch chi t c a ch ng A1073 có ch s
này th p nh t và th p g n b ng ñ i ch ng dương (m t trong nh ng ch t có kh năng
5
- di t t bào) c a phép th ; th p b ng so v i ch ng ñ i ch ng sinh anthracycline và th p
hơn ñáng k so v i hai ch ng còn l i. ðây là m t trong nh ng k t qu n i b t nh t c a
ñ tài, làm ti n ñ cho các hư ng nghiên c u ti p theo.
- Ch t tan trong ethyl acetate c a d ch nuôi 3 ch ng có ho t tính kháng t bào ung thư
nói trên ñã ñư c phân tích HPLC v i cùng m t ñi u ki n s c ký v i các ñ i tư ng
tương t hi n ñang ñư c th c hi n t i Phòng thí nghi m Vi sinh v t h c phân t ,
Trung tâm công ngh sinh h c qu c t , ð i h c T ng h p Osaka. Qua phân tích k t
qu sau s c ký các ch t chi t ñư c t d ch nuôi ch ng A1018 cho 8 ñ nh khác nhau, t
ch ng A1022 cho 5 ñ nh khác nhau và ch ng A1073 cho 6 ñ nh khác nhau. Các d
li u liên quan hi n ñang ñư c so sánh phân tích v i cơ s d li u hi n có t i cơ s nói
trên nh m tìm ki m b n ch t c a các ch t ñó. ðây là m t k t qu th hi n s h p tác
qu c t c a ñ tài.
8.2. K t qu ñào t o
ð tài ñã góp ph n ñào t o 01 Th c s chuyên ngành công ngh sinh h c thu c
chương trình ñào t o liên k t qu c t v i ð i h c Liege, Vương qu c B v i tên ñ tài là:
“Biodiversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,
Vietnam”. H c viên Nguy n Phương Chung ñã b o v thành công lu n văn v i k t qu
xu t s c trư c H i ñ ng ngày 24 tháng 2 năm 2011.
8.3. Bài báo
K t qu c a ñ tài ñã ñư c ñúc k t thành 02 bài báo:
• Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,
Vietnam. T p chí Công ngh sinh h c (ñã nh n ñăng).
• Bư c ñ u nghiên c u sàng l c kháng sinh ch ng ung thư t x khu n thu th p
vư n Qu c gia Cát Bà, T p chí Khoa h c và Công ngh , ð i h c Qu c gia Hà N i
(ñã nh n ñăng).
9. Tình hình s d ng kinh phí
- T ng kinh phí c a ñ tài ñư c duy t: 100.000.000 VNð
- T ng kinh phí c a ñ tài ñã quy t toán: 100.011.400 VNð, bao g m các m c:
+ Chi phí thuê mư n: 40.000.000
+ Chi phí nghi p v chuyên môn: 49.084.000
+ Photo tài li u, văn phòng ph m: 4.235.000
6
- + H i h p: 1.500.000
+ Thông tin liên l c: 442.000
+ Chi khác (l phí c a ñơn v DT): 4.750.000
Xác nh n c a cơ quan Ch trì ñ tài
Xác nh n c a ð i h c Qu c gia
7
- SUMMARY
Investigation and study some substances which have antibiotic
1. Project title:
activities against microorganisms and cancer cell lines from
actinomycetes
2. Code: QG.09.48
3. Duration: 2009 – 2011
4. Organizer: Institute of Microbiology and Biotechnology,
Vietnam National University, Hanoi (VNUH)
5. Project leader: Dr. Nguyen Huynh Minh Quyen
Dr. Nguy n Quỳnh Uy n
6. Key participants:
Dr. ðinh Thúy H ng
BSc. Lê Phương Chung
MSc. Phan Th Hà
BSc. Lê H ng Anh
7. Objectives and study contents
Objective: This project was carried out to study biodiversity and to screen antibiotics from
actinomycete strains collected from a national park with high biodiversity in Vietnam,
named Catba National Park. The antibiotics produced by these strains were studied
further in order to find out their nature.
Study contents:
• Isolating actinomycete strains from soil and litter samples on Catba island (Hai
Phong) and then evaluating their biodiversity
• Screening the strains possessing high antibiotic activities
• Primary extracting the antibiotics from these strains
• Studying the properties of these antibiotics by use thin layer chromatography
(TLC) and high pressure liquid chromatography (HPLC)
• Classifying and identifying the strains possessing high antibiotic activities by use
their morphology and the sequences of 16S rDNA gene
• Testing cytotoxic activity of some potential strains
• HPLC analyses of the extracts from the strains capable of producing anticancer
agents to obtain data base in order to study their nature.
8. The obtained results
8
- • 424 actinomycete strains, including 353 strains from soil and 71 strains form litter
samples, were collected at Cat Ba island and then were classified. As the result
through their observation morphology and the sequences of 16S rDNA gene, the
genus Streptomyces occupied about 70%, the rare actinomycetes were the rest.
Among the latter, Micromonospora occupied more than 7%, Nonomuraea
appeared about 4% and Nocardia was 3% in total.
• 424 above strains were screened their antibiotic activity against 4 tested
microorganisms, representative for bacteria (Negative Bacterium: Escherichia coli;
Positive Bacterium: Micrococcus luteus), yeast (Candida albicans) and fungi
(Fusarium oxysporium).
• Of 424 strains above, 115 strains out were shown antimicrobial activity against at
least one of the 4 testes microrganisms.
• Among these 115 strains, 2 strains (A1073, A1393) were shown activity against all
of the 4 tested microrganisms, 7 strains (A232, A390, A1018, A1022, A1041,
A1043 và A1470) against 3, 8 strains (A45, A149, A154, A160, A396, A410,
A427 và A444) against 2 testes microrganisms. Regarding the tested
microorganisms, 14 strains were shown inhibitory activity to Negative bacterium
(E. coli), 14 strains were shown inhibitory activity to Positive bacterium (M.
luteus); 11 strains were shown activity against both of these; 12 strains were shown
activity against fungi (F. oxysporium) and just only 6 strains were shown activity
against yeast (C. albicans). In general, 17 strains in total possessing activity
against at least 2 tested microoragnisms were selected for further study.
Interestingly, 17 these strains jsut belonged to 2 genus Streptomyces (10 strains)
and Nonomuraea (7 strains).
• 17 strains were cultured to get their cultured broths and the cultured broths were
extracted by ethyl acetate in order to obtain bioactive compounds. The yeild of
extracted substances soluble in ethyl acetate (from 1 liter cultured broth) was
variable from 30mg (strains A154) to 2152mg (strains A444). In comparison with
their respective dry mass, extracted subtances occupied from 0,51% (strains A154)
to 14,89% (strains A396).
• The substances soluble in ethyl acetate of the cultured broths of 17 actinomycete
strains were analysed by thin layer chromatography (TLC) to compare their profile
with that of three standard antibiotics (chloramphenicol, kitasamycin,
9
- erythromycin) and the cultured broth of control strain, capable of producing
anthracycline (A16). The bands obtained after chromatography were varied from 1
to 4 bands. 8 strains (A149, A154, A160, A232, A410, A427, A1073, A1393) were
shown 1 band, 3 strains (A396, A444, A1018) were shown 2 bands, 4 strains (A45,
A1041, A1043, A1470) - 3 bands and 2 strains (A390, A1022) - 4 bands. In
comparison with the standard antibiotics, the substances extracted from the
cultured broth of strain A396 were shown the similar band to chloramphenicol;
substances extracted from the cultured broth of the strains A45 and A410 were
shown the same band of erythromycin, none of them were shown the band similar
to the bands of antibiotic kitasamycin. In comparison with cultured broth of control
strain producing anthracycline, samples A1018 and A1022 were shown the
chromatography profile very close with this of the control.
• The substances soluble in ethyl acetate of the 17 selected strains were analysed by
high performance pressure chromatography (HPLC) in the same condition as that
of the standard antibiotics. Except strain A396, which was shown the peak similar
to that of chloramphenicol, the rest of the samples were not shown any connection
with the control antibiotics.
• Furthermore 17 selected strains tested to change the colour based on the
enviromental pH. This is a specific test for strains producing antibiotic of group
anthracycline. Two strains A1018 and A1073 were shown positive results in this
test.
• 3 strains out of 17 strains above (A1018 (the TLC profile and change the coulour
based on pH were similar to that of the control strain), A1022 (TLC profile is
similar to that of the control) and A1073 (change the coulour based on pH)) with
relatively high antibiotic activity, were selected to test cytotoxicity against human
cancer cell lines. Crude extracts of three strains above exhibited significant
cytotoxic activity against hepatocellular carcinoma, lung cancer, and
rhabdosarcoma human cell lines.
• By testing with hepatocellular carcinoma, lung cancer, and rhabdosarcoma human
cell lines, the substances extracted from the cultured broths of three selected strains
exhibited positive results against all of these cell lines. By the comparison of IC50
value (i.e., the concetration of agents kills 50% cancer cells in number, which
means the smaller this value is, the higher the cytotoxicity is), the substance
10
- extracted from strain A1073 was shown the lowest value and this value is very
close to that of the positive control of this test. This value is also as low as that of
the control strain producing anthracycline and significant lower in comparison with
the rest of the two strains. This is one of the outstanding results of the project and
this provides the base to develop further research.
• Substances soluble in ethyl acetate of the cultured broths of 3 strains above were
analysed by HPLC at the same chromatography condition for similar subjects at
Molecular Microbiology Lab, International Center for Biotechnology, Osaka
University. HPLC analyses of ethyl acetate crude extracts of the three strains
A1022, A1018 revealed relatively high complexity, possessing 5 peaks, 8 peaks
and 6 peaks, respectively. Their data base is going to compare with that available
at this Lab in order to find out the nature of these substances. This is one of
international collaboration of the project.
9.1. Education results
The project contributes to educating 01 Master student, field Biotechnology,
belonged to international program jointed with University of Liege, Belgium. The
dissertation is: “Biodiversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from
Catba island, Vietnam”. The master students Nguy n Phương Chung did defend
successfully on Feb 24th, 2011.
9.2. Publication:
All of the results above resulted in 02 publications:
• Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,
Vietnam. Journal of Biotechnology (accepted).
• Primary screening anticancer antibiotic from actinomycetes isolated at Cát Bà
National Park, Journal of Science, Natural Sciences and Technology, Vietnam
National Unversity, Hanoi (accepted).
Xác nh n c a cơ quan Ch trì ñ tài
Xác nh n c a ð i h c Qu c gia
11
- PH N II. BÁO CÁO T NG K T
12
- GI I THÍCH CH VI T T T
DMSO: Dimethyl Sulfoxide
DNA: Deoxyribonucleic acid
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay
HPLC: High-performance liquid chromatography
rDNA 16 S: gene 16S c a DNA ribosome
ñ m có 10mM Tris-HCl và 1mM EDTA, pH8,0
TE:
TLC: Thin layer Chromatography
DANH SÁCH NH NG NGƯ I THAM GIA TH C HI N ð TÀI
1. Ch trì: TS. Nguy n Huỳnh Minh Quyên
2. Nh ng ngư i th c hi n:
TS. Nguy n Quỳnh Uy n
-
TS. ðinh Thúy H ng
-
CN. Lê Phương Chung
-
- ThS. Phan Th Hà
- CN. Lê H ng Anh
13
- DANH M C CÁC B NG VÀ HÌNH
Danh m c b ng
B ng 1.1 Các nhóm kháng sinh theo c u trúc hóa h c
B ng 2.1 ði u ki n phân tích HPLC c a các ch t chu n
B ng 3.1 Sơ b phân lo i các ch ng x khu n phân l p ñư c
B ng 3.2. Ho t tính kháng vi sinh v t c a 17 ch ng x khu n ch n l c ñư c
B ng 3.3. Hi u qu tách chi t d ch nuôi các ch ng x khu n ch n l c ñư c
B ng 3.4. T ng k t k t qu phân tích HPLC ch t chi t t các ch ng x khu n ch n l c
ñư c
B ng 3.5. Các ñ c ñi m nh n d ng c a 10 ch ng thu c chi Streptomyces
B ng 3.6. K t qu xác ñ nh ho t tính gây ñ c t bào
B ng 3.7. T ng k t k t qu phân tích HPLC ch t chi t t 3 ch ng có ho t tính gây ñ c
t bào ung thư
Danh m c hình
Hình 1.1 Kháng sinh ñư c phát hi n qua các năm
Hình 1.2 S ti n hóa c a penicillin G
Hình 1.3. C u trúc hóa h c c a daunorumycin (DNR) và idarumycin (IDA)
Hình 3.1. ðánh giá ho t tính kháng vi sinh v t c a các ch ng x khu n
Hình 3.2. Ph TLC ch t chi t t d ch ngo i bào c a các ch ng x khu n ch n l c ñư c
Hình 3.3. Ph HPLC c a chloramphenicol (A) và ch t chi t t ch ng A396 (B)
Hình 3.4. Hình thái khu n l c m t s ch ng Streptomyces
Hình 3.5. H s i mang bào t c a m t s ch ng Streptomyces
Hình 3.6. Cây ch ng lo i phát sinh trình t rDNA 16S cho th y v trí c a 7 ch ng x
khu n hi m trong chi Nonomuraea
Hình 3.7. S thay ñ i màu s c theo pH môi trư ng c a các ch ng A1018 và A1073
Hình 3.8. S c ký ñ HPLC ch t chi t t d ch nuôi ch ng A1018
Hình 3.9. S c ký ñ HPLC ch t chi t t d ch nuôi ch ng A1022
Hình 3.10. S c ký ñ HPLC ch t chi t t d ch nuôi ch ng A1073
14
- ðU
M
S c kh e luôn là m t trong nh ng v n ñ ñư c chú tr ng nh t trong m i qu c gia.
M c dù các thành t u có ñư c trong ngành hoá dư c ñã ñem l i s phong phú v ch ng
lo i dư c ph m, nhưng vi c tìm ki m và s d ng tr c ti p các s n ph m t nhiên có ho t
tính sinh h c trong vi c ch a tr các b nh nan y v n luôn là hư ng ñư c quan tâm hi n
nay. Trong m t t ng k t v các lo i dư c ph m hi n ñang lưu hành trên th gi i, Newman
và c ng s (2003) ñã cho bi t t năm 1981 ñ n năm 2002 trong t ng s 868 lo i thu c
ñư c phép ñưa vào s d ng thì có ñ n 58% là có ngu n g c t nhiên. ð c bi t con s này
là 62% ñ i v i thu c dùng trong ñi u tr b nh ung thư.
V i ngu n vi sinh v t vô cùng phong phú và ña d ng, Vi t nam có cơ s ñ phát
tri n ngành công ngh sinh h c theo hư ng ng d ng y-dư c này. ðây cũng là m t bài
toán ñ t ra cho ngành dư c nư c nhà trư c tình hình thu c nh p ngo i chi m v trí áp ñ o
trên th trư ng và trong các b nh vi n l n. ð cung c p ngu n nguyên li u h tr cho
ngành dư c, các nghiên c u v ñ c tính sinh h c t vi sinh v t có tác d ng ch a tr b nh
c n ph i ñư c chú tr ng, nh m t o ti n ñ cho vi c phát tri n dư c ph m m i v i tính
năng ñi u tr cao và ít tác d ng ph không mong mu n. S suy thoái môi trư ng s ng
Vi t nam hi n nay là nguyên nhân d n ñ n ña d ng hoá các tác nhân gây b nh. Các b nh
viêm nhi m và b nh ung thư hi n ñang là ñ i tư ng c n thi t ñ các nhà nghiên c u ñ t
m c tiêu tìm ki m các ch t có công d ng c ch t ngu n vi sinh v t n i ñ a.
Thay ñ i khí h u, ô nhi m môi trư ng s ng là nh ng y u t gây tác ñ ng tr c ti p
ñ n s c kh e c a con ngư i. Theo d báo toàn c u, t i m t s vùng trên th gi i, trong ñó
có Vi t nam, t l ngư i m c b nh viêm nhi m thông thư ng hay các b nh nguy hi m
như ung thư, tim m ch... ngày càng gia tăng (Ashutosh K., 2008; Goodfellow M., 1998).
Do v y, vi c nghiên c u ñ tìm ki m các ch t có ho t tính ch a tr b nh t các ngu n g c
t nhiên là m t trong nh ng hư ng nghiên c u tr ng tâm c a ngành công ngh sinh h c
t i nhi u qu c gia, ñ c bi t các nư c phát tri n. ð n m b t ñư c nh ng k thu t tiên
ti n trong lĩnh v c này và t ng bư c hoà nh p v i s phát tri n chung, ñ ng th i ñ ñáp
ng nhu c u trong vi c b o v s c kho c ng ñ ng, Vi t nam c n chú tr ng khai thác
ngu n ña d ng vi sinh v t c a mình làm nguyên li u ñ phát tri n dư c ph m. Vì l ñó
chúng tôi ñã ñ xu t và ñã ñư c ð i h c qu c gia Hà N i phê duy t th c hi n ñ tài:
“ði u tra, nghiên c u m t s ho t ch t có kh năng kháng vi sinh v t và kháng dòng
t bào ung thư t x khu n”
15
- CHƯƠNG I. T NG QUAN TÀI LI U
1. 1 Kháng sinh
1.1.1. Khái ni m chung
Theo ñ nh nghĩa truy n th ng thì kháng sinh (còn ñư c g i là tr sinh) là nh ng
ch t có kh năng tiêu di t vi khu n hay kìm hãm s phát tri n c a vi khu n m t cách ñ c
c p ñ phân t , thư ng là m t v trí quan tr ng c a vi
hi u. Nó có tác d ng lên vi khu n
khu n hay m t ph n ng trong quá trình phát tri n c a vi khu n. Theo ñ nh nghĩa hi n
nay, kháng sinh ñư c hi u là các h p ch t hóa h c do vi sinh v t sinh ra và n ng ñ
th p chúng có th kìm hãm s sinh trư ng ho c tiêu di t (các) vi sinh v t khác (Nduka,
2007).
Hi n nay các ch t có ho t tính sinh h c có kh năng di t khu n g m các ch t
kháng sinh truy n th ng, các s n ph m trao ñ i ch t như các acid lactic do các vi khu n
lactic sinh ra, các ch t phân gi i như lysozyme, các lo i ngo i ñ c t có b n ch t protein,
các bacteriocin…. Các “vũ khí sinh h c” này ñư c quan tâm ñ c bi t do tính ña d ng và
c do chúng có nhi u trong t nhiên (Margaret & Milind, 2007).
Th c, ñ ng v t b c cao cũng có kh năng sinh “kháng sinh” tuy nhiên các h p ch t
này n m ngoài ñ nh nghĩa nói trên. Tương t như v y, m c dù cũng do vi sinh v t sinh ra
nhưng bacteriocin cũng không ñư c coi là kháng sinh không ch vì chúng có kh i lư ng
phân t không l n như các ch t kháng sinh thông thư ng khác mà còn do chúng ch y u
nh hư ng ñ n các vi sinh v t g n v i vi sinh v t s n sinh ra bacteriocin. So v i
bacteriocin, các ch t kháng sinh ña d ng v b n ch t hóa h c và t n công các vi sinh v t
không có quan h h hàng. ði m khác bi t quan tr ng n a là trong khi thông tin di truy n
c a các ch t kháng sinh thư ng n m trên m t vài gen thì bacteriocin ch c n gen ñơn.
(Nduka, 2007). ð n nay ñã có kho ng 16.500 kháng sinh ñư c phát hi n t vi sinh v t, và
hàng năm hàng ch c kháng sinh m i ñư c phát hi n (Hopwood, 2007).
1.1.2 L ch s phát tri n kháng sinh
Kháng sinh là thu c ñư c con ngư i dùng ch y u ñ ch ng các b nh truy n
nhi m. Các b nh truy n nhi m chi m ph n r t l n trong các b nh c a con ngư i và ñ ng
v t. Cho ñ n n a sau c a th k 19 ngư i ta ñã phát hi n ra r ng vi sinh v t chính là th
ph m gây ra hàng lo t các b nh truy n nhi m. Do ñó li u pháp hóa h c nh m vào các vi
sinh v t gây b nh ñã ñư c phát tri n thành li u pháp ñi u tr chính.
16
- Vào năm 1928, Fleming phát hi n ra penicillin và kháng sinh này ñã ñư c dùng
trong ñi u tr vào nh ng năm 1940. Ngay sau ñó penicillin ñã tr thành m t kháng sinh
n i ti ng vì ñã c u s ng nhi u chi n binh trong chi n tranh th gi i II (Saga &
Yamaguchi, 2008).
T nh ng năm 1940 ñ n cu i nh ng năm 1960, nhi u kháng sinh m i ñư c xác
ñ nh h u h t t x khu n, và ñó tr thành th i kỳ vàng son c a hóa li u pháp kháng sinh
(Hình 1.1).
Hình 1.1 Kháng sinh ñư c phát hi n qua các năm (Hopwood, 2007).
Năm 1944, streptomycin ñư c phát hi n t vi khu n ñ t Streptomyces griseus. Sau
ñó ñ n chloramphenicol, tetracycline, các kháng sinh thu c nhóm macrolide và
glycopeptide (t c vancomycin) ñư c phát hi n t vi khu n ñ t. Các kháng sinh t ng h p
như nalidixic acid, thu c ch ng vi sinh v t có b n ch t quinolone ñã ñư c t o ra vào năm
1962. Vi c c i ti n trong t ng l p kháng sinh ti p t c thu ñư c ph kháng vi sinh v t r ng
hơn, ho t tính kháng vi sinh v t cao hơn ví d như các kháng sinh β-lactam. L p β-lactam
g m penicillin, cephem, carbapenem và monobactam. Penicillin ban ñ u có tác d ng hi u
qu lên vi khu n Gram dương như Staphylococcus aureus. Sau ñó, S. aureus sinh ra các
enzyme phân gi i penicillin- penicillinase, nên ngư i ta phát tri n methicillin. Bên c nh
ñó, ñ m r ng ph tác d ng c a ampicillin (là kháng sinh ch ng vi khu n Gram âm
Enterobacteriaceae) ngư i ta ñã phát tri n ñư c piperacillin có th kháng ñư c c
Pseudomonas aeruginosa (Hình 1.2).
17
- Hình 1.2 S ti n hóa c a penicillin G (Saga et al, 2008)
Vi c phát hi n, phát tri n và s d ng các kháng sinh trong ñi u tr t h k 20 ñã
làm gi m ñáng k t l ch t do nhi m khu n. Tuy nhiên t 1980 s kháng sinh m i ñư c
ñưa vào ñi u tr gi m h n do chi phí cho vi c phát tri n và th nghi m thu c m i ngày
càng l n. Bên c nh ñó, m t hi n tr ng ñáng báo ñ ng là ngày càng tăng các vi sinh v t
gây b nh kháng v i các kháng sinh hi n có. Hi n nay, vi c kháng c a vi khu n ph i ñư c
kh c ph c b ng vi c phát hi n ra các thu c m i. Tuy nhiên vi sinh v t càng ngày càng
nhanh kháng thu c và t c ñ ñó l i nhanh hơn t c ñ t o ñư c thu c m i c a con ngư i.
Do v y, các nghiên c u c n ph i t p trung vào làm th nào ñ vư t qua tính kháng thu c
kháng sinh cũng như phát hi n các kháng sinh m i có các cơ ch ho t ñ ng khác nhau
(Fred, 2006).
1.1.3 Phân lo i kháng sinh
Có m t s phương pháp phân lo i kháng sinh. M t trong nh ng phương pháp ñó là
d a vào ki u ho t ñ ng t c là kháng sinh ñó tác ñ ng lên vách t bào, kìm hãm protein…
Tuy nhiên có khi m t kháng sinh l i có nhi u cơ ch ñ ng th i cùng tác ñ ng nên cách
phân lo i này khó áp d ng. M t s trư ng h p kháng sinh ñư c phân lo i d a trên vi sinh
v t s n sinh ra kháng sinh ñó. Nhưng khi ñó có trư ng h p m t vi sinh v t có th sinh ra
m t s kháng sinh như Streptomyces sp. có th sinh penicillin N và cephalosporin. Ngư c
l i m t kháng sinh cũng có th do nhi u vi sinh v t sinh ra. Kháng sinh cũng ñã ñư c
phân lo i d a theo con ñư ng sinh t ng h p. Ph tác ñ ng cũng ñư c dung, ví d như tác
18
- ñ ng lên vi khu n, n m, nguyên sinh ñ ng v t… Tuy nhiên m t lo i/nhóm kháng sinh
như aminoglycoside l i có th có ph tác d ng khác nhau (Nduka, 2007; Tortora et al,
2010).
Cách phân lo i nêu dư i ñây là d a trên c u trúc hóa h c c a kháng sinh và theo
ñó kháng sinh ñư c phân thành 13 nhóm (B ng 1.1) (Nduka, 2007).
B ng 1.1 Các nhóm kháng sinh theo c u trúc hóa h c
Nhóm hóa h c Ví d
Aminoglycoside Streptomycin
Ansamacrolide Rifamycin
Beta-lactam Penicillin
Chloramphenicol và các ch t tương
Chloramphenicol
t
Linocosaminide Linocomycin
Macrolide Erythromycin
Nucleoside Puromycin
Puromycin Curamycin
Peptide Neomycin
Phenazine Myxin
Polyene Amphothericin B
Polyether Nigericin
Tetracycline Tetracycline
Nh ư ñ ã ñ c p trên có nhi u cách phân lo i kháng sinh và không có cách nào
th a mãn toàn b các yêu c u v phân lo i. Do v y, cách phân lo i d a trên c u trúc hóa
h c nêu ñây cũng ch mang tính ch t tương ñ i và các ví d nêu ra là ñ d dàng nh n
bi t nhóm có kháng sinh ñó mà thôi. Sau ñây là m t s nhóm kháng sinh thông d ng:
a. Aminoglycoside là nhóm các kháng sinh mà các ñư ng amino ñư c liên k t b ng
liên k t glycoside. Streptomycin và gentamicin là các ví d ñi n hình c a nhóm này.
Streptomycin v n còn là thu c thay th trong ñi u tr b nh lao, nhưng do s phát tri n tính
kháng thu c nhanh chóng và các nh hư ng ñ c h i nghiêm tr ng ñã làm h n ch vi c s
d ng kháng sinh này. Các aminoglycoside kìm hãm t ng h p protein nhi u vi khu n
Gram âm và m t s vi kh n Gram dương. ðôi khi chúng ñư c dùng k t h p v i penicillin.
19
nguon tai.lieu . vn
