Xem mẫu
- TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÀI BÁO CÁO
SEMINAR CHUYÊN NGÀNH
ĐỀ TÀI:
ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA
BACILLUS TRONG ỐNG NGHIỆM PHÂN LẬP TỪ
CHÁO LÊN MEN TỰ NHIÊN TỪ VÙNG MÔNG CỔ
CỦA TRUNG QUỐC
GV hướng dẫn: Thầy Nguyễn Văn Minh
Cô Dương Nhật Linh
Nhóm sinh viên:
Ngô Văn Quang 30700406
Hồ Sơn Hải 30700106
Văn Đặng Hồng Cẩm 30700035
Thái Duy Tân 30700442
Nguyễn Anh Tôn 30700536
Đào Minh Thịnh 30660234
TPHCM, ngày 29 tháng 9 năm 2010.
- MỤC LỤC
Danh mục các bảng..........................................................................................3
Lời mở đầu.......................................................................................................4
Phần 1: Probiotic..............................................................................................5
I. Khái niệm, các định nghĩa :……………………………………………5
1...Giới thiệu về probiotic:………………………………………….5
2. Các định nghĩa:………………………………………………….6
II. Tính an toàn của probiotic:…………………………………………….6
1. Tính an tòan về probiotic trước đây và sau này:……………………6
2. Tính an tòan về probiotic trên động vật:……………………………8
3. Tính an tòan về probiotic trên người:………………………………9
4. An tòan của vi khuẩn đề kháng kháng sinh:………………………..10
5. Nghiên cứu lâm sàng:………………………………………………11
6. Giám sát dịch tễ học:……………………………………………….11
Phần 2: Đánh giá các đặc tính probiotic của Bacillus trong ống nghiệm phân lập
từ cháo lên men tự nhiên ở Inner Mongolia của Trung Quốc.........................12
I. Giới thiệu...............................................................................................12
II. Nguyên liệu và phương pháp.................................................................13
1. Phân lập Bacillus từ cháo lên men tự nhiên……………………...13
2. Nhận dạng 16 rDNA……………………………………………..13
3. Thử nghiệm hoạt động kháng khuẩn……………………………….15
4. Các thử nghiệm khuếch tán agar…………………………………...15
Phần 3: Kết quả và thảo luận.........................................................................16
I. Sự cô lập và nhận diện của vi khuẩn Bacillus bằng kết quả phân tích trình
tự gen 16S rDNA…………………………………………………………16
II. Hiệu quả của việc mô tả khả năng vận chuyển của tế bào thực vật của
Bacillus……………………………………………………………..17
III. Sự đề kháng muối mật…………………………………………………18
IV. Hoạt tính kháng sinh………………………………………………..19
V. Kết luận…………………………………………………………………20
- DANH MỤC CÁC BẢNG
Bàng 1. Một số vi khuẩn sử dụng làm probiotic và có khả năng gây bệnh
Bảng 2. Nhận dạng và phân loại 33 chủng Bacillus phân lập từ cháo lên men tự
nhiên ở Inner Mongilia dựa trên trình tự 16S rDNA
Bảng 3. Tỷ lệ sống sót của các chủng Bacillus phân lập được lựa chọn từ cháo lên
men tự nhiên ở Inner Mongolia trong môi trường nuôi cấy ở pH 2.5 và dịch
dạ dày nhân tạo ở pH 2.0
Bảng 4. Khả năng chịu mật của 4 chủng Bacillus được chọn
Bảng 5. Khả năng chịu mật của Bacillus licheniformis IMAUB1002 ở mức độ mật
khác nhau
Bảng 6. Vùng ức chế (mm) của 4 chủng Bacillus được chọn
- Probiotics thường được sử dụng như là chất bổ sung hữu hiệu đối với động vật
bằng cách cải thiện các vi khuẩn ký sinh đường ruột “cân bằng” (Fuller 1992). Hiện tại
không có lớp chung cho vi khuẩn probiotic và các loại hình thương mại nhất hiện có là vi
khuẩn acid lactic và vi khuẩn bifidus (Kleerebezem and Vaughan 2009). Có nhiều nghiên
cứu tập trung vào Bacillus spp, Bifidobacteriumspp cho thực phẩm chức năng sử dụng
chế phẩm sinh học (Kabir et al. 1997; Singh et al. 1997). Ngoài ra, một số chủng Bacillus
cũng cho thấy tiềm năng để có probiotic (Cavazzoni and Adami 1993; Kumprecht and
Zobac 1996).
Cháo lên men tự nhiên (acidic-guel), một thực phẩm lên men truyền thống ở Inner
Mongolia của Trung Quốc, có thể sử dụng như là nguồn tiềm năng để cô lập probiotics.
Nó được sản xuất tại hộ gia đình từ nguyên vật liệu ngũ cốc khác nhau như: cỏ
đuôi chồn, hạt kê và gạo. Hạt kê và gạo được lên men tự nhiên bởi nước bã canh chua
trong một bình ở nhiệt độ phòng để qua đêm và sau đó được sử dụng để nấu cho đến
khi chín. Do đó, cháo lên men được làm đồ ăn với cả hai hương vị thú vị và có chức năng
nâng cao sức khỏe.
Bacillus là một chi của vi khuẩn hình que và là chi của bộ phận Firmicutes. Bacillus
là một loài vi khuẩn hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi, và xét nghiệm dương tính đối với
enzyme catalase (Turnbull 1996). Bacillus được xem là dễ dàng lây lan từ môi trường tự
nhiên qua nhiều loại thức ăn thực vật (Roberts et al 1982). Một số chủng vi khuẩn
Bacillus đã được phân lập từ các loại thực phẩm lên men truyền thống bao gồm ngũ cốc
khác nhau, họ đậu và thực vật dựa trên các loại thực phẩm lên men (Gadaga et al. 1999;.
Roy et al. 2007; Valero et al. 2007). Đặc tính chức năng của các loại thực phẩm ngũ cốc
lên men truyền thống dựa trên liên kết chặt chẽ giữa vi sinh vật có lợi và vi khuẩn
Bacillus đã chứng minh là gây một tác dụng đồng lên men với các vi sinh vật khác
(Blandino et al. 2003;. Mante et al. 2003).
So với loài lactobacillus mà chủ yếu nhạy cảm với điều kiện sinh lý bình thường,
một số chủng trực khuẩn có thể tồn tại ở nhiệt độ cao, độ chua của dạ dày và các axít
mật (Hyronimus et al. 2000).Bacillus coagulans--Ganeden BC30TM được chứng minh là an
toàn cho con người (Endres et al. 2009). Hơn nữa, Bacillus subtilis (Hong et al. 2009) đã
được phân lập từ đường tiêu hóa của con người và hội sinh ở ruột. Do đó, trực khuẩn
cho thấy một cái mới lạ và nguồn đầy hứa hẹn của các vi khuẩn probiotic.
Probiotic được định nghĩa là vi sinh vật sống có thể chống lại dạ dày, mật, và tuyến
tụy tiết ra (Del piano et al. 2006). Những đặc điểm có thể được quan sát trong ống
nghiệm và có thể được sử dụng để lựa chọn các chủng (Salminen và Wright von et
al.1998). Mục tiêu của nghiên cứu để đánh giá tính chất tiềm năng probiotic (kháng pH
thấp, dịch dạ dày mô phỏng, muối mật và hoạt tính kháng khuẩn) của một số trực khuẩn
phân lập từ cháo lên men tự nhiên trong ống nghiệm với một nỗ lực để đưa vào danh
sách có thể sử dụng được trong y học như là probiotics.
- Phần 1: PROBIOTIC
I. Khái niệm, các định nghĩa về probiotics:
1.Giới thiệu về probiotic:[1]
Theo (Fuller,1922) , probiotic là những vi khuẩn sống mà nó có ảnh hưởng tốt đến
vật chủ bằng cách cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột và có lợi cho vật chủ. Định nghĩa
này được mở rộng ra probiotic bao gồm cả một vi khuẩn hay một hệ vi khuẩn sống
được dùng cho người hay động vật ảnh hưởng tích cực đến vật chủ bằng cách cải thiện
tính chất hệ vi khuẩn đường ruột giúp cho dễ tiêu hóa ,chúng cũng tác động trực tiếp
đến hệ tiêu hóa .
Trong giới hạn của sự nghiên cứu , probiotic có giới hạn rõ ràng là hệ vi khuẩn chỉ
phù hợp với một hoặc một vài sản phẩm (theo WHO, 1994).
Về lịch sử thì vi khuẩn và nấm men rất có ích trong nông nghiệp và khoa học dinh
dưỡng . Ví dụ phổ biến như là sử dụng vi khuẩn (chủ yếu là vi khẩn Lactic) cho những
sản phẩm lên men như cải bắp (món dưa cải) và những sản phẩm lên men từ sữa như
sữa chua, ngoài ra còn có phomat và kefir. Còn nấm men (chủ yếu là Saccharomyces
cerevisiae) cho sản phẩm như bánh mì, bia và rượu.
Hệ thống nghiên cứu trong probiotic cho người bắt đầu sử dụng vào thế kỉ 20.
Elie Metchnikoff là nhà sinh học Nga người mà làm việc vào khoảng 1900 ở Institut
Pasteur tại Pháp học được sự màu nhiệm, kỳ vọng có đời sống thọ của người Cô –đắc ở
Bungari. Ông ấy kỳ vọng vào việc nâng cao tuổi thọ lên 115 năm và họ đã sử dụng nhiều
sản phẩm lên men từ sữa. Ông tìm ra tên thích hợp cho sự lên men Bacillus bulgaricus và
sau đó phân loại là Lactobacillus bulgaricus mà được sử dụng lần nữa giúp giảm được
bệnh đau dạ dày ở người sớm vào năm 1920.
Có một chủ đề hấp dẫn về probiotic trong suốt 10 năm từ 1960-1970 khi họ đã tái
phát hiện khoa học dinh dưỡng ở người và động vật. Sản phẩm có hiệu lực đầu tiên về
khoa học dinh dưỡng trên động vật là đáp ứng nhu cầu đặc trưng là chất cho thêm vào
thức ăn của động vật. Không xuất hiện ở thị trường châu Âu cho tới giữa 1980.
- Ngày nay, nguồn khoa học dinh dưỡng hiện đại ở động vật có sự xuất hiện đầy đủ
những định nghĩa của probiotic bao gồm nhóm vi khuẩn Lactic, bào tử Bacillus và nấm
men.
2. Các định nghĩa:
Probiotic là những vi sinh vật như vi
khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực phẩm
với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường
ruột của sinh vật chủ (Parker, 1974).
Định nghĩa của Guamer và Schaafsma (1998):
" những vi sinh vật sống, nếu được đưa vào có thể
với một số lượng đủ có thể đem lại sức khoẻ cho người sử dụng”.
Định nghĩa của FAO/WHO[4]: “Probiotic là những vi thể
sống mà với số lượng được kiểm soát hợp lý sẽ giúp bồi
bổ sức khoẻ cho người tiếp nhận”.
Vậy: Probiotic là những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm
men nếu được đưa vào cơ thể với số lượng được kiểm
soát hợp lí sẽ đem lại sức khỏe cho người sử dụng.
Ngoài ra, chúng có thể được thêm vào sản phẩm lên men sữa, và cũng góp một
phần trong việc hình thành sản phẩm lên men, hoặc được bổ sung dưới dạng bột đông
khô.
II. Tính an toàn của probiotics:
1. Tính an toàn về probiotic trước đây và hiện nay:[2]
Hiện tại, thông thường probiotic có lợi ích chung là bảo vệ hệ đường ruột và cải
thiện khả năng tiêu hóa. Những chủng vi khuẩn khác thì đang được nghiên cứu cho khả
năng chữa trị bệnh viêm ruột, ức chế vi khuẩn gây bệnh, cải thiện bệnh tiêu chảy của
những bệnh nhân khác, ngăn ngừa bệnh sâu răng, và làm giảm bớt chứng dị ứng.
Đó là những yêu cầu đối với probiotic có vai trò trong sự miễn dịch và ngăn chặn
được sự phát sinh bệnh ung thư. Trong khi nghiên cứu tập trung trên probiotic sao cho
phù hợp với hệ vi khuẩn đường ruột bao gồm dùng qua đường uống, đường hô hấp trên
hay niệu sinh dục (dùng tại chỗ).
- Probiotic thông thường là những chủng Lactobacillus và Bifidobacterium. Ngoại lệ
trong số đó cũng có loài Enterococcus và Saccharomyces .Các chủng này được coi là an
toàn bởi vì chúng đã được sử dụng từ rất lâu trong sản xuất bơ sữa. Có những vi khuẩn
khác không phải là probiotic thích nghi sống trong vùng ruột non và chúng thường là điều
kiện dẫn đến sự nhiễm trùng và gây bệnh.
Hệ vi sinh vật được xem là probiotic khi có ảnh hưởng tích cực trong sản phẩm bơ
sữa và những thực phẩm lên men truyền thống.
Thành phần của các sản phẩm probiotic trong nhiều thế kỉ thì không có tác dụng
phụ rõ ràng. Probiotic tiêu thụ trong thực phẩm và bổ sung vào chế độ ăn kiêng được
công nhận là an toàn theo GRAS.
Và không cần thực hiện thêm một nguyên tắc nghiêm ngặt nào hơn đối với
probiotic, mà đòi hỏi phải được cải thiện hoặc ngăn chặn bệnh khi đưa vào phân tích
“lịch sử của tính an toàn khi sử dụng “ như là một tiêu chuẩn phân loại an toàn đối với vi
sinh vật thực phẩm .
Trước đây định nghĩa này chưa được xác định pháp lý.
Để khắc phục tình trạng này, liên đoàn Quốc tế ngành sữa và thực phẩm châu Âu
cùng nhau xem xét hệ vi sinh vật và lịch sử sử dụng trong sản xuất thực phẩm. Kiểm tra
danh sách phân loại và ứng dụng của vi khuẩn Lactic ở loài Enterococcus và
Streptococcus, nấm men và nấm mốc.
Nó mở ra sự thay đổi định nghĩa về vi sinh vật là thêm vào hay bớt ra với những
thay đổi trong nguyên tắc phân loại. Bắt đầu là mục lục có hệ thống các vi sinh vật
được cho là hợp lý và cho là an toàn. Vì mức độ sử dụng của chúng trong thực phẩm thì
không gây bệnh
Nó quy định căn bản cho những chủng, loài, giống về tính an toàn và nguồn gốc từ
những giống vi khuẩn mới thì luôn luôn làm ra những sản phẩm probiotic mới.
Mức độ an toàn hợp lý của vi khuẩn probiotic mới thì không thể được giả đinh.
Trước khi kết hợp của những giống mới trong sản phẩm hiệu lực của chúng phải được
đánh giá cẩn thận và sự đánh giá phải dựa vào mức độ an toàn của vi sinh vật trong sản
phẩm.
- Người tiêu dùng chống lại sự biến đổi gen của vi sinh vật trong sản phẩm. Như
vậy sự biến đổi gen của probiotic thì ít có khả năng được sử dụng gần đây. Ngoại trừ có
thể có của các ứng dụng lâm sàng.
Và đã chứng tỏ một probiotic Lactococcus lactics đã tiết ra cytokine interleukin (IL)-
10 ngăn ngừa viêm kết tràng trong thí nghiệm trên chuột.
Một chủng tái tổ hợp của Bacilus subtilis 2335 được dùng trong sản xuất protein
với tính chất kháng khuẩn và virus là tăng hiệu quả trị liệu trên chuột.
Từ việc thí nghiệm trên một loài chuột người ta đã phát triển hơn và ứng dụng điều
trị cho người theo đánh giá yêu cầu về mức độ an toàn đối với probiotic theo GMO.
Việc chứng minh tính hiệu lực của probiotics đã mang lại những cơ hội lớn để phát
triển đối với các sản phẩm cho người và động vật. Việc bổ sung những chủng vi khuẩn
mới trong thực phẩm và các sản phẩm điều trị cần được xem xét lại tính an toàn.
Những sản phẩm probiotic có yêu cầu về dinh dưỡng chức năng hoặc điều trị. Sự
khác biệt giữa những hình thức bổ sung vào chế đô ăn hoặc uống thuốc đang là những
thách thức để điều chỉnh phù hợp với người tiêu dùng.
Bằng chứng cho sự an toàn và hiệu quả của probiotic gần đây được đưa vào những
nghiên cứu nhỏ.Vi khuẩn lactic và nấm men dùng trong sản xuất các loại thực phẩm lên
men truyền thống được xem là an toàn mà không có bất kì tiêu chuẩn khoa học nào bởi vì
chúng tồn tại rất rộng rãi và sự hiện diện của chúng không gây bất lợi nào.
Sự giới thiệu một probiotic mới đòi hỏi phải có những chỉ tiêu an toàn, được đề ra
bao gồm bản chất của vi khuẩn, cũng như sự hoạt động của enzym, sự đề kháng kháng
sinh và sự nhiễm trùng.
2. Tính an toàn probiotic trên động vật: [2]
Việc sử dụng probiotic ở động vật và nuôi trồng thủy sản thì được đánh giá
cao.Probiotic giúp cải thiện sức khỏe của động vật, giúp tăng trọng và ngăn chặn tác
nhân gây bệnh. Sự lạm dụng kháng sinh trong ngành chăn nuôi và khả năng đề kháng
kháng sinh đã làm tăng mối quan tâm đến probiotics.
Việc sử dụng probiotics trong thực phẩm được đề xuất rằng có thể làm giảm nguy
cơ gây bệnh truyền từ thực phẩm sang người.
- Thí nghiệm phân lập E.faecalis và E faecium từ người, gà, lợn có tính nhạy cảm đối
với 12 chủng vi sinh khác và mã hóa gen đề kháng bằng phương pháp PCR. Những sự
kết hợp của tính đề kháng kháng sinh được giám sát trong quá trình phân lập mẫu từ
người và động vật và các gen mã hóa cho tính đề kháng đã được phát hiện.
Ủy ban khoa học châu Âu (EC) về dinh dưỡng động vật (2003) đã khuyến cáo rằng,
những giống vi khuẩn trước đây có thể chấp nhận như một probiotic động vật thì bản
chất của gen đề kháng kháng sinh phải được xác định.
Đối với các loài biết được bản chất của sự đề kháng kháng sinh ví dụ như khả
năng đề kháng vancomycin của lactobacillus, cần xác nhận các gen đề kháng chưa được
biết đến.
Những chủng mang gen đề kháng kháng sinh được sử dụng trong y dược thì không
nên bổ sung vào thức ăn chăn nuôi trừ khi vi khuẩn đó có đột biến trên gen đề kháng
kháng sinh. Chính sách này sẽ ngăn chặn được việc sử dụng các vi khuẩn có khả năng
truyền gen kháng kháng sinh sang các vi khuẩn khác làm probiotic bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi. Điều này cũng hạn chế ứng dụng của probiotic cho người.
Thực tế probiotic cần thiết được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi trong nông nghiệp
và nuôi trồng thủy sản và an toàn đối với người.
Probiotic sử dụng cho động vật có nguy cơ nhiễm vào thức ăn của người hoặc
truyền khả năng đề kháng kháng sinh, do đó nó cần được chứng minh là an toàn đối với
người và động vật.
Sự bám dính lên niêm mạc đường tiêu hóa của vi khuẩn probiotic được xem là cơ
chế quan trọng để ngăn chặn các tác nhân gây bệnh.
3. Tính an toàn của probiotic trên người: [3]
Những tiêu chuẩn an toàn về probiotic được đề cập rất nhiều. Một vấn đề gây
tranh cãi là có nhất thiết probiotic phải bắt buộc có nguồn gốc từ người hay không.Tuy
nhiên hầu hết các chủng probiotic được sử dụng thành công hiện nay đều có nguồn gốc
từ người.Ngoài ra cũng có những tranh luận khác cho rằng chức năng hoạt động của
probiotic sẽ tốt hơn trong một môi trường mà có những tính chất ban đầu mà chúng
được phân lập( chẳng hạn như đường ruột của người). Khía cạnh an toàn bao gồm:
• Có định danh chính xác
• Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người
• Được phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh
- • Được chứng minh là không có khả năng gây bệnh
• Không liên quan tới bệnh tật, (nhiễm trùng nội mạc cơ tim,hay gây rối loạn
tiêu hóa)
• Không gây khử liên hợp muối mật
• Đặc điểm di truyền ổn định
• Không mang các gen đề kháng kháng sinh có thể truyền được.
Bảng 1: Một số vi khuẩn sử dụng làm probiotic và có khả năng gây bệnh
Tên vi sinh vật Khả năng gây bệnh
Lactobacillus Không gây bệnh, đôi khi gây nhiễm trùng cơ hội ở các
bệnh nhân suy giảm miễn dịch
Streptococcus Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng cơ
hội
Enterococcus Một vài chủng là tác nhân gây bệnh cơ hội với hoạt tính
và có khả năng đề kháng kháng sinh.
Bifidobacterium Phần lớn không gây bệnh và một số gây nhiễm trùng ở
người
Saccharosemyces Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở
người.
4. An toàn của vi khuẩn đề kháng kháng sinh: [3]
Việc sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi ở người và thú y đã góp phần gia tăng
tình trạng đề kháng kháng sinh và dẫn đến vấn đề nghiêm trọng trong việc điều trị
nhiễm trùng do tự nhiên hoặc mắc phải. Đề kháng tự nhiên được xem như là một đặc
điểm tự nhiên của loài, trong khi đó đề kháng mắc phải là do những đột biến về di
truyền hay thu được từ gen của những vi khuẩn đề kháng kháng sinh khác.
Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng đề kháng tự nhiên với nhiều loại kháng sinh,
nhưng trong hầu hết các trường hợp thì các chủng này không có khả năng truyền gen đề
kháng kháng sinh. Các chủng Lactobacillus có gen đề kháng kháng sinh không truyền
- được chưa hẳn được xem là an toàn khi sử dụng một vài chủng Lactobacillus như L.
rhamnosus, L. casei có tính đề kháng tự nhiên dối với vancomycin.đã có một lịch sử được
sử dụng lâu dài một cách an toàn như là probiotic, và không có biểu hiện nào cho thấy
chúng truyền gen đề kháng này cho những vi khuẩn khác.
5. Nghiên cứu lâm sàng: [2]
Nghiên cứu lâm sàng ở người đã điều tra về hiệu lực khi uống probiotic với sự cân
bằng hệ vi khuẩn đường ruột và các dạng rối loạn. Cho đến gần đây có nhiều nghiên
cứu với cách bố trí không phù hợp và các số liệu không đáng tin cậy. Đặc điểm của cá
nghiên cứu không phù hợp bao gồm: (a) sự vắng mặt của một nhóm bệnh nhân cần
kiểm soát ; (b) các nhóm điều trị nhỏ; (c) các nhóm điều trị không được xác định; (d)
phạm vi rộng lớn về tuổi trong một nhóm điều trị; (e) đa dang về phương pháp điều trị
kháng sinh; (f) thiếu những tiêu chuẩn về liều lượng và thời gian; (g) các đối tượng với
những triệu chứng xảy ra đồng thời gây nhầm lẫn trong sự theo dõi của những tác dụng
bất lợi. Các tiêu chuẩn vàng là nghiên cứu được kiểm soát một cách ngẫu nhiên, các kết
quả kế thừa phải được xử lý, dùng giả dược, những nhóm không được điều trị.
Sự an toàn của probiotic liên hệ mật thiết đến hiệu quả của nó. Những nghiên cứu
thử nghiệm đối với probiotic mới sẽ đưa ra bằng chứng lý tưởng về sự hiện diện của
nó, tính bền hoặc là sự lấn át giữa những nhóm điều trị dùng giả dược trước khi điều trị
và những nhóm sau khi điều trị, số lượng các vi sinh vật và khả năng sống trong lúc khởi
phát và kết luận các thử nghiệm lâm sàng cũng phải được liệt kê.
6. Giám sát dịch tễ học: [2]
Hai nghiên cứu của Phần Lan đã điều tra tỉ lệ mắc bệnh nhiễm trùng kết hợp với
LAB. Trong nghiên cứu đầu tiên, phương pháp 16S rRNA được sử dụng để mô tả và
định danh những vi khuẩn lactic phân lập từ máu của người bệnh ở phía nam Phần Lan.
Tổng số ca nhiễm bởi lactobacilli thì rất thấp, và các chủng probiotic mới vừa được giới
thiệu trong sữa lên men không liên quan đến các trường hợp nhiễm trùng.
Trong một nghiên cứu tiếp theo, Lactobacilli phân lập từ bệnh nhân nhiễm trùng từ
năm 1989 đến năm 1994 được đối chiếu với các chủng trong chế biến sữa hoặc dược
phẩm.
Từ tổng số 5192 mẫu máu, 12 kết quả dương với lactobacilli , tỉ lệ 0.23%. Không
có trường hợp lâm sàng liên quan đến lactobacilli được sử dụng trong công nghiệp sữa.
Trong cả 2 nghiên cứu, bệnh nhân nhiễm vi khuẩn lactic thì có mang thêm một căn bệnh
khác.
- Trong một nghiên cứu gần đây , Salniment và cộng sự khảo sát tỉ lệ mắc bệnh
nhiễm trùng do lactobacilli trong dân số Phần Lan vào khoảng thời gian mức tiêu thụ
chủng L. rhamnosus GG (ATCC53103) gia tăng nhanh chóng. Chủng này được phân lập
từ vùng ruột non của người và đưa vào các sản phẩm sữa trong năm 1990. Đến năm
1999, mức tiêu thụ bình quân đầu người ước tính khoảng 6L (3.1011CFU)/người/năm.
Đại học Helsenki đã thu thập tất cả các chủng Lactobacillus được phân lập từ máu
và dịch não tủy trong khu vực đó từ năm 1990-2000. Các chủng phân lập từ máu được
sưu tầm lại để báo cáo tất cả các trường hợp nhiễm trùng do Lactobacilus đến Ủy ban
đăng ký các bệnh truyền nhiễm quốc gia vào năm 1995-2000. Loài được đặc trưng và so
sánh với L. Rhamnosus GG bằng phương pháp dịch tễ học phân tử.
Trong số 5,2 triệu người dân Phần Lan, chín mươi trường hợp nhiễm Lactobacillus
đã được xác định từ 1995 đến 2000. Trong số 66 chủng phân lập được định danh cấp
loài, có 48 chủng được phân lập là Lactobacillus, với các chủng phổ biến như L.
rhamnosus (26, 54%), L. fermentum (9, 19%) và L. casei (7, 15%). Trong 35 trường hợp có
nhiều hơn một loài vi khuẩn ngoại trừ Lactobacillus cũng được xác định. Mười tám trong
số 66 chủng (27%) đã được phân lập không phải là Lactobacillus. Mười một trong 26
chủng L. rhamnosus từ probiotic L. rhamnosus GG đã không thể phân biệt bằng PFGE
(điện di trong trường xung).
Theo khảo sát, không có sự gia tăng tỷ lệ nhiễm Lactobacillus mặc dù số ca nhiễm
trùng tăng lên rõ rệt trong giai đoạn này.
Lactobacillus được phân lập gồm có 0.24% được phân lập từ máu không thay đổi
trong báo cáo ở Phần Lan các quốc gia có tỷ lệ trung bình hằng năm của nhiễm
lactobacillus ước tính là 0.29/100.000 người/năm.
Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng bằng mức tiêu thụ của L. rhamnosus GG đã
không dẫn đến sự gia tăng tương ứng trong lactobacillus nhiễm trùng máu.
Phần 2: Đánh giá các đặc tính probiotic của Bacillus trong ống
nghiệm phân lập từ cháo lên men tự nhiên ở Inner
Mongolia của Trung Quốc
I. Giới thiệu:
Có tất cả 33 chủng Bacillus được phân lập từ 16 mẫu cháo lên men tự nhiên ở Inner
Mongolia của Trung Quốc và được xác định bằng phân tích trình tự 16S rDNA. Đặc tính
của chế phẩm vi sinh bao gồm acid, khả năng chịu mật và chịu được dịch tiêu hóa nhân
tạo cũng như sự ức chế vi khuẩn gây bệnh đã được áp dụng để sàng lọc Bacillus. Sau
- khi lựa chọn sơ bộ, trong đó có 4 chủng Bacillus licheniformis IMAUB1002, Bacillus
subtilis IMAUB1011, Bacillus amyloliquefaciens IMAUB1014 và Bacillus
amyloliquefaciens IMAUB1034 cho thấy sức chịu đựng cao đối với dịch dạ dày nhân tạo
ở pH 2.0 trong 3h với tỷ lệ sống trên 92%. Và sau đó cho đi qua đường tiêu hóa, tỷ lệ
sống của 4 giống được trên 90%. Hơn nữa, trong 4 chủng Bacillus, Bacillus licheniformis
IMAUB1002 hoạt động tốt trong muối mật (0,6%) và ức chế được hoạt động của 5
mầm bệnh trong thực phẩm. Kết quả cho thấy rằng Bacillus licheniformis IMAUB1002
cần được xem xét như là một probiotic tiềm năng. Nghiên cứu sâu hơn nữa sẽ tập trung
đánh giá đặc tính của những chế phẩm sinh học trong cơ thể và làm rõ chức năng của
các đặc tính khác để sử dụng nó trong sản xuất thực phẩm chức năng trong tương lai.
II.Nguyên liệu và phương pháp:
1. Phân lập Bacillus từ cháo lên men tự nhiên:
Mẫu thu
Mười sáu mẫu cháo lên men tự nhiên được thu thập từ các vùng khác nhau của
Mông Cổ. Các mẫu được lưu giữ trong thùng đá và vận chuyển đến phòng thí nghiệm
của chúng tôi để phân tích trong vài giờ. pH của các mẫu đã được xác định bằng cách sử
dụng giấy pH.
Phân lập Bacillus
Một ml mẫu được chuyển vô trùng vào các ống 1,5 ml EP, sau đó ngâm trong nước
nóng ở 90oC trong 10 phút. Sau khi làm nóng, 0,2 ml pha loãng thích hợp được trãi trên đĩa
của thạch dinh dưỡng (dung dịch peptone cantaining 0,5%, dịch chiết thịt bò 0,3% và
1,5% agar, pH 7,0-7,2).
Đại diện các mẫu đã phát triển trên đĩa sau khi ủ đã được phân lập và được cấy
vào dung dịch chất dinh dưỡng. Tinh sạch mẻ cấy được thực hiện bằng cách cấy truyền
trong dung dịch dinh dưỡng. Các mẻ cấy được kiểm tra dưới kính hiển vi về độ tinh
khiết.
Mẻ cấy Bacillus được duy trì bằng cách cấy truyền trong canh dinh dưỡng sử dụng
inoculums 1%, và ủ 24h ở 37oC và được lưu trữ ở nhiệt độ 4oC. Mỗi mẻ cấy đã được
cấy truyền hai lần trong canh dinh dưỡng trước khi sử dụng (Sgorbati et al. 1982).
2. Nhận dạng 16 rDNA:
Tách chiết DNA
Tế bào vi khuẩn được thu thập từ 5ml của một mẻ cấy tinh khiết giữ qua đêm tại
37 C bằng cách ly tâm (12.000xg, 5 phút). DNA được chiết xuất bằng phương pháp cổ
o
điển CTBA (Walker et al. 1991).
Khuếch đại gen 16S rRNA bằng phản ứng dây chuyền polymerase (PCR)
Các đoạn của gen 16S rRNA đã được khuếch đại bởi mồi của vi khuẩn (Scarpellini
et al. 2002). Các trình tự của mồi như sau: mồi trước (5'-
- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và mồi ngược (5'-CTACGG CTACCTTGTTACGA-
3'). 25µl hỗn hợp phản ứng PCR chứa 100g mẫu DNA, 2.5µl 10x đệm với 1.5 mmol
MgCl2, 3.0 đơn vị Tag DNA polymerase, 0.2 mmol của dNTP, 10pmol của mỗi mồi.
Các điều kiện phản ứng như sau: 94oC trong 5 phút, 30 chu kỳ ở 94oC trong 1 phút,
58oC trong 1 phút, 72oC trong 2 phút, và sau đó 72oC trong 10 phút và 4oC torng 30
phút. Sản phẩm phản ứng được chuyển điện di trên gel agarose 1.0% và đọc kết quả
sau khi nhuộm ethidium bromide. Và sau đó kết quả được xác thực (1.4kb) bởi Tổng
công ty Sangni Biosciences Thượng Hải - Trung Quốc.
Phân tích rình tự 16S rDNA
Trình tự được phân tích và liên kết bằng cách sử dụng phần mềm DNAMAN (phiên
bản 4.0). Trình tự tìm kiếm đã được kiểm tra tính tương đồng bằng chương trình
BLAST trong cơ sở dữ liệu NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) với các chủng
loại trình tự như trình tự tham khảo. Các trình tự thu được được giải trình trong cơ sở
dữ liệu NCBI. 33 chủng phân lập từ mẫu cháo sản xuất thủ công ở mông cổ và các
chủng loại đã được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài.Cây phát sinh loài dựa trên
dữ liệu trình tự được xây dựng theo phương pháp ghép nhóm không quá tải với trung
bình số học (UPGMA) của MEGA4.0 (Tamura et al.2007).
Chuẩn bị các loại dịch đường dạ dày mô phỏng
Dịch vị giả được chuẩn bị mới mỗi ngày gồm 0,35g pepsin (Sigma, MO, USA)
trong 100ml nước muối 0,2%. pH được điều chỉnh từ 2.0 với nồng độ acid hydrochloric
tập trung, và nước trái cây đã được khử trùng bằng cách lọc qua bộ lọc 0,22 µm.
Một lượng nhỏ dịch ruột mô phỏng đã được chuẩn bị bằng cách đình chỉ 0.1g của
trypsin (Sigma, MO, USA) và 1.8g của muối mật trong 100ml nước cất của 1.1g
bicarbonate natri và clorua natri 0.1g. pH được điều chỉnh đến 8.0 với NaOH 0,5M. Giải
pháp này đã được tiệt trùng bằng cách lọc qua bộ lọc 0.45μm (Kos et al. 2000).
Lựa chọn các chủng kháng acid
Canh trường Man Rogosa Sharpe(MRS, pH 2,5) đã được chuẩn bị và tiêm với 1%
vào huyền phù để qua đêm với tất cả các chủng. Khoảng 0.5ml đã được đổ bỏ tại 0giờ
và 3giờ để xác định tính khả thi của tổng số. Vùng đếm trên MRS agar từ huyền phù ban
đầu và cuối cùng đã được thực hiện để đánh giá khả năng sống sót ở pH 2,5 (Pereira và
Gibson et al. 2002).
Chủng cho thấy sức đề kháng cao ở pH acid 2,5 đã được cấy vào dịch vị ở nồng độ
pH 2.0, và ủ ở 37oC. Khoảng 0.5ml đã được đổ bỏ tại 0giờ và 3giờ để xác định tính khả
thi của tổng số. Chủng cho thấy sức đề kháng cao với dịch vị mô phỏng ở pH 2.0 đã
được chọn.
Xác định khả năng chống chịu
Các chủng có sức đề kháng cao ở pH acid 2,5 đã được cấy khoảng 1% vào dịch vị
mô phỏng ở pH 2.0. Các hỗn hợp được trộn trong 10s và ủ ở 37oC. Dịch dạ dày nhân tạo
- đã được nghiên cứu bằng cách xác định tính khả thi trong tổng số dịch dạ dày bị thu hồi
tại thời điểm 0, 1, 2, và 3giờ.
Sau đó 0.5ml các loại dịch dạ dày mô phỏng nuôi cấy trong 3giờ được cấy để 4.5ml
dịch đường ruột mô phỏng ở pH 8,0, và ủ ở 37oC trong điều kiện yếm khí. Sức chịu
đựng khi đi qua dịch ruột non đã được nghiên cứu bằng cách xác định tính khả thi trong
tổng số dịch ruột chiết rút ở 0, 3, 6, và 24 giờ (Hashimoto và Tabata et al. 2004).
Xác định tổng số có thể tồn tại
Tổng số sống được của các loài vi khuẩn Bacillus được xác định bằng một phương
pháp đổ đĩa bằng cách sử dụng môi trường thạch MRS sau khi pha loãng nhiều lần tại
phục hồi tối đa. Môi trường thạch MRS đã được ủ trong điều kiện yếm khí ở 37oC trong
48 giờ.
Tính chịu mật
Tác dụng của muối mật đối với tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn Bacillus
licheniformis IMAUB1002, Bacillus subtilis IMAUB1011, Bacillus licheniformis
IMAUB1014 và Bacillus amyloliquefaciens IMAUB1034 được thực hiện bằng cách sử
dụng một phương pháp mô tả bởi Walker và Gilliland (1993). Canh trường MRS-Thio
[MRS có bổ sung natri thioglycollate 0,2% (Kanto, CICA, Nhật Bản)] có bổ sung 0,3%
(w/v) oxgall (mật tươi khử nước, DIFCO, PQ, Canada) được chuẩn bị tươi và cấy với
1% dịch huyền phù để qua đêm đối với các chủng được chọn. Mẫu kiểm soát không có
oxgall đã được chuẩn tốt. Hấp thụ ở 600nm được đo mỗi giờ so với mẫu không cấy
tương ứng. Sự tăng trưởng này được tiếp tục cho đến khi đạt được một sự khác biệt 0,3
đơn vị trong hấp thụ. Và sự khác biệt về thời gian (h) giữa các môi trường nuôi cấy
được xem như là pha lag (LT).
Sức chịu đựng muối mật ở nồng độ tối đa của Bacillus licheniformis IMAUB1002
được xác định. Canh trường MRS bổ sung muối mật với nồng độ khác nhau được chuẩn
bị và cấy với 1% huyền phù để qua đêm của Bacillus licheniformis IMAUB1002 ở 37oC.
Hấp thụ được đo tại 600nm lúc 24h. Các chủng được cấy trên đĩa thạch MRS, và ủ
trong điều kiện yếm khí ở 37oC trong 48 giờ để xác định sự tăng trưởng.
3. Thử nghiệm hoạt động kháng khuẩn
Chuẩn bị phi tế bào nổi trên mặt
CFS thu được bằng ly tâm (3.300 × g, 10min) của các mẻ nuôi cấy qua đêm (37oC.
Aerobic, canh trường MRS) và khử trùng bằng cách lọc qua một lỗ lọc 0.22μm.
Chủng chỉ thị
Các chủng chỉ thị bao gồm Escherichia coli O157882364, Shigella flexneri CMCC
(B) 51592, Salmonella typhimurium S50333, Listeria monocytogenes C53-3,
Staphylococcus aureus AC1.2465, với môi trường nuôi cấy LB, NB, BHI và TSB tương
ứng. Các chủng này được cung cấp bởi Học viện Khoa học Trung Quốc, Bộ sưu tập
Trung tâm Văn hóa y tế Trung Quốc (CMCC) và Bộ sưu tập của Văn hóa Nông Trung
Quốc (ACCC).
4. Các thử nghiệm khuếch tán agar
- Các thạch thử nghiệm phổ biến được sử dụng để thử nghiệm hoạt tính kháng
khuẩn của CFS theo tài liệu (Ouoba et al. 2007). Mẫu bệnh nuôi cấy qua đêm của vi sinh
vật chỉ thị (0.1ml, khoảng 106 cfu/ml) được cấy chuyền trên môi trường thạch MRS
20ml trong một đĩa Petri vuông. CFS (100μl) đã được bổ sung vào cốc Oxford (một xi
lanh không gỉ, bên ngoài có đường kính 7,8 ± 0,1 mm, bên trong có đường kính 6,0 ± 0,1
mm và chiều cao 10,0 ± 0,1 mm) được đặt trên bề mặt của thạch này. Các kích thước
của vùng khuếch tán khắp nơi trên cốc (bao gồm cả các 'Oxford ly' 7,8 mm) được đo và
kết quả được báo trong milimet (mm). Thí nghiệm được thực hiện trong các bản sao.
Phân tích thống kê
Phân tích thống kê các dữ liệu thu được được thực hiện bằng cách sử dụng 2002
SAS 9.0 (SAS Institute Inc, Cary, Hoa Kỳ). Việc so sánh sự khác biệt giữa các phương
tiện của phương pháp điều trị đã được thử nghiệm bởi ANOVA ở mức ý nghĩa của P
- Từ kết quả cuối cùng và BLAST tìm trực tuyến, nó cho biết rằng 33 tình trạng trên
chính xác thuộc về việc chịu đựng được giá trị PH thấp của tình trạng 33 trong số những
tình trạng khác.
Lựa chọn sơ bộ các chủng
Tỷ lệ sống sót của Bacillus trong mức độ phát triển bình thường ở PH = 2.5 và
trong dịch vị PH = 2 được đưa ra trong bảng 2. Điều đó cho biết 11 cá thể Bacillus đều
có acid chống chịu được PH = 2.5 và tỷ lệ sống sót hơn 90%. 11 cá thể này có thể chịu
đựng được dịch vị 90% được thử nghiệm sâu hơn ở PH = 2, trong dịch vị và 6 (trong 11
cá thể chọn) đã sống sót với tỷ lệ 90% và được chọn để tiến hành thử nghiệm xa hơn
nữa.
Sức chịu đựng acid là thuộc tính mà bất kỳ chủng nào đều mong đợi để có thể phát
triển được trong đường tiêu hóa (Salminen et al. 1996). 11 chủng (33.33%) của Bacillus
từ việc lên men cháo tự nhiên của người Mông Cổ có thể phát triển, tăng trưởng trung
bình tại PH 2.5 và tỷ lệ sống là hơn 90%. Hơn nữa 6 chủng sống sót tốt trong dịch vị
với PH 2.0 sau 3 giờ ủ. (Hyronimus et al. 2000) đã báo cáo chỉ có Bacillus laevolacticus
DSM6475 có thể sống tại PH 2.5 sau 3 giờ ủ với thỷ lệ là 86%, và những chủng Bacillus
coagulans, Bacillus racemilacticus, Sporolactobacillus inulinus racemicus có thể sống
trong môi trường thô. So sánh với báo cáo được miêu tả ở trên, những chủng của chúng
ta có khả năng chịu đựng tốt hơn. Thông qua việc phân tích, nguồn gốc những chủng của
chúng ta (lên men cháo) và những loài đặc biệt có thể xem như là nhân tố chính để so
sánh sức chịu đựng acid nào cao hơn.
II. Hiệu quả của việc mô tả khả năng vận chuyển của tế bào thực vật
của Bacillus
Hiệu quả của việc mô phỏng dịch vị và ruột nhỏ trên khả năng sống của 6 chủng đã
chọn thì được miêu tả ở hình 2. 6 chủng này cho thấy tỷ lệ sống tương đối cao, mà hầu
hết không đổi sau khi ủ trong dịch vị tại PH 2.0 với 3 giờ. Sau đó ủ trong dịch ruột 24
giờ, ta thấy chúng vẫn sống sót, đặc biệt là 4 chủng Bacillus licheniformis IMAUB1002,
Bacillus subtilis IMAUB1011, Bacillus licheniformis IMAUB1014 và Bacillus
amyloliquefaciens IMAUB1034 có sức chịu đựng cao trong đường tiêu hóa tại PH 8.0
trong 24 giờ với tỷ lệ sống 92,6 ± 0,3%, 92,3 ± 0,6%, 91,0 ± 0,6% và 91,4 ± 0,3%, được
xem là có khả năng chịu được khi đi qua dịch dạ dày.
Bàng 3: Tỷ lệ sống sót của các chủng Bacillus phân lập được lựa chọn từ cháo lên men
tự nhiên ở Inner Mongolia trong môi trường nuôi cấy ở pH 2.5 và dịch dạ dày nhân tạo ở
pH 2.0
Chủng Môi trường nuôi Dịch dạ dày nhân tạo
cấy Tỷ lệ sống (%)
Tỷ lệ sống (%)
Bacillus licheniformis IMAUB1002 98.72 ± 2.65ab 94.41 ± 1.41ab
Bacillus licheniformis IMAUB1009 93.75 ± 1.93cd 91.14 ± 0.92c
Bacillus subtilis IMAUB1011 93.48 ± 0.73cd 92.57 ± 0.84bc
Bacillus cereus IMAUB1022 92.84 ± 0.32d 85.64 ± 0.41de
Bacillus licheniformis IMAUB1014 97.95 ± 1.96ab 93.15 ± 0.78b
Bacillus pumilus IMAUB1015 91.91 ± 0.68d 83.02 ± 0.37f
Bacillus cereus IMAUB1020 95.90 ± 0.47bc 82.11 ± 0.26f
- Bacillus licheniformis IMAUB1012 91.93 ± 0.71d 83.77 ± 0.28ef
Bacillus amyloliquefaciens 98.94 ± 2.25a 96.17 ± 1.52a
IMAUB1034
Bacillus subtilis IMAUB1031 93.65 ± 0.81cd 86.67 ± 0.52d
Bacillus subtilis IMAUB1036 97.52 ± 1.23ab 92.81 ± 2.36bc
Những thí nghiệm trong ống nghiệm đã chỉ ra rằng nhiều điều kiện có thể quyết
định đến sự sống sót của probiotic thông qua sự tăng lên trong dạ dày, acid dạ dày, thời
gian tiếp xúc lâu với acid, sự thiếu nước và điều kiện tiếp xúc lâu với muối mật, mức
độ thủy phân của muối mật và những thứ khác cũng chưa nói rõ bản chất của những
probiotic (Carteris et al. 1998; Bezkorovainy et al. 2001).
Ít nguyên cứu chỉ ra rằng khả năng vượt qua những tác động được mô phỏng lên tế
bào sinh dưỡng của Bacillus. Mặc dù tất cả những bào tử của Bacillus được kiểm tra
cấy phân lập là giống nhau về sự đề kháng với tác động của dịch mô phỏng dịch dạ dày,
những tế bào sinh dưỡng của Bacillus thì rất dễ tiếp xúc với tác động của dịch mô
phỏng dịch da dày với một sự giảm xuống những tế bào sống sót hơn 98% trong vòng 5
phút. Như vậy kết quả của chúng tạo ra tiềm năng probiotic có lợi từ những giống đã
cấy phân lập trong thời gian hiện tại sự nguyên cứu chắc chắn thừa hưởng những giống
tự nhiên được lên men đông lạnh.
III. Sự đề kháng muối mật
Bốn giống được chọn với sự phát triển với sự hiện diện của 0,3% mật bò, kết quả
trên được ghi nhận trên bảng 3, chúng chỉ ra rằng tác động của muối mật len sự phát
triển của mẻ cấy và khả năng chống chịu của chúng đối với muối mật.
(Chateau et al. 1994), ngưòi đã phân biệt được 4 nhóm khi theo dõi thời gian ủ với sự
xuất hiện của mật bò: những giống đề kháng (thời gian ủ phát triển d ≤ 15 phút), những
giống chịu mặn (15< d ≤ 40 phút), những giống chống chịu yếu (40 < d ≤ 60 phút) và
những giống nhạy (d > 60 phút). Bốn chủng Bacillus thử nghiệm được xem là nhạy cảm
(d > 60 phút) (bảng 3).Những kết quả đó giống với những điều kiện được theo dõi
những thứ khác không phải SFLAB như là B.subtilis và B.toyoi (Cosson and Deschamps
1994). Trong nguyên cứu hiện nay, những giống B. coagulans được tiềm thấy trong cả 2
nhóm ‘chống chịu yếu’ và ‘dễ dàng’. Điều này không đúng cho sự theo dõi với
Lactobacillus acidophilus và đặc biệt là Enterococcus faecium (Gilliland et al. 1984;
Taranto et al. 1997).
Bảng 4: Khả năng chịu mật của 4 chủng Bacillus được chọn
Chủng Thời gian cần thiết để tăng A600 bằng 0.3
đơn vị (h)
MRS-THIO MRS-THIO + Pha lag (LT)
muối mật
Bacillus licheniformis IMAUB1002 8.90 ± 0.11 21.50 ± 0.47a 12.60 ± 0.36b
a
Bacillus amyloliquefaciens IMAUB1034 4.23 ± 0.09c 20.07 ± 0.82b 15.84 ± 0.73a
Bacillus subtilis IMAUB1011 5.64 ± 0.16b 14.21 ± 0.12c 8.57 ± 0.04c
Bacillus licheniformis IMAUB1014 5.68 ± 0.31b 14.77 ± 0.60c 9.09 ± 0.31c
- Khi đi qua ống dạ dày, vi khuẩn hệ tiêu hóa phải đối mặt với sự thay đổi các hợp
chất độc như muối mật. Sự cô đặc của muối mật trong phạm vi ruột non từ khoảng 0,2
đến 2% (w/v), tùy thuộc vào cá thể, loại và số lượng tiêu thụ thức ăn (Dawson 1998).
Một nghiên cứu với 40 chủng Bacillus cereus cho thấy Bacillus cereus rất nhạy cảm bởi
muối mật (Kristoffersen et al. 2007). Một nghiên cứu khác của Hyronimus vào năm
(2000) cho thấy giảm tối thiểu nồng độ của Bacillus coagulans, Bacillus racemilacticus
và Bacillus laevolacticus theo thứ tự >1,0.7,0.1 và chỉ có chủng Bacillus coagulans BCI4
LMAB có sức chịu đựng yếu và những chủng khác thì nhạy cảm bởi muối mật. Trong
các nghiên cứu này, Bacillus licheniformis IMAUB1002 cho thấy khả năn chịu đựng muối
mật cao nhất (0.6%) so với nghiên cứu trước đây, nghiên cứu của chúng ta có thể cho
thấy rằng Bacillus licheniformis được sử dụng ở mức trung bình trong loài Bacillus.
Bảng 5: Khả năng chịu mật của Bacillus licheniformis IMAUB1002 ở mức độ mật khác
nhau
Mật (%) Bacillus licheniformis IMAUB1002
A600 MRS agar
a
0.3 0.718 ± 0.014 +
b
0.4 0.599 ± 0.011 +
c
0.6 0.257 ± 0.010 +
d
0.8 0.032 ± 0.008 +
d
1.0 0.034 ± 0.006 +
d
1.2 0.032 ± 0.005 +
d
1.4 0.028 ± 0.003 +
d
1.6 0.030 ± 0.001 +
1.8 0.023 ± 0.001d -
Từ kết quả ở bảng 4, cho thấy sự khác biệt đáng kể sức chịu đựng muối mật khi
nồng độ thấp hơn 0.6%. Tuy nhiên khi nồng độ vượt quá 0.6% thì kết quả sẽ không có
sự khác biệt đáng kể. Do đó 0.6% có thể được xem như là 1 điểm giới hạn để kiểm tra
sức chịu đựng với muối mật. Đây là cơ sở để tìm kiếm Bacillus licheniformis
IMAUB1002 có sức chịu đựng muối mật tốt hơn.
IV. Hoạt tính kháng sinh
Các ức chế trong 5 yếu tố gây hỏng thức ăn và vi khuẩn gây bệnh. Được lựa chọn
bởi 4 chủng Bacillus bao gồm B. licheniformis IMAUB1002, B. subtilis IMAU1011, B.
licheniformis IMAUB1014 và B. amyloliquefaciens IMAUB1034, cho thấy ở bảng 5.
Bảng 6: Vùng ức chế (mm) của 4 chủng Bacillus được chọn
Chủng Staphyloco Listeria Shigella Salmonella Escherichia
ccus aureus monocytoge flexneri typhimurium coli O157
ACI.2465 ns C533 CMCC (B) S50333 882364
51592
Bacillus 10.87 ± 13.54 ± 8.35 ± 0.71b 9.65 ± 0.39a 10.38 ±
licheniformis 0.68a 0.59a 0.17a
IMAUB1002
Bacillus 8.27 ± 0.58c 9.36 ± 0.51c - 9.19 ± 0.26a 9.35 ± 0.75b
amyloliquefacie
- ns IMAUB1034
Bacillus subtilis 9.65 ± 0.40b 9.88 ± 0.48bc 8.25 ± 0.44b - 10.21 ±
IMAUB1011 0.45ab
Bacillus 9.82 ± 10.35 ± 11.25 ± - 7.58 ± 0.55c
licheniformis 0.69ab 0.34b 0.52a
IMAUB1014
Lên men nổi không bào của MRS của B. licheniformis IMAUB1002 thì ức chế đáng
kể bởi Gram dương (Listeria monocytogenes C53-3, Staphylococcus aureus AC1.2465) và
vi khuẩn gram âm (Escherichia coli O157 882364, Shigella flexneri CMCC (B) 51592,
Salmonella typhimurium S50333). Đồng thời nó cũng cho thấy những chủng khác của
Bacillus có hoạt tính kháng kháng sinh cao mặc dù chúng có sức chịu đựng acid cao. Từ
bảng 5 chúng ta cũng thấy 3 chủng khác của Bacillus licheniformis IMAUB1011, Bacillus
licheniformis IMAUB1014 và Bacillus amyloliquefaciens IMAUB1034 một phần sinh
sống ở 5 chủng chỉ định. Nó có ý nghĩa quan trọng bởi vì chất kháng sinh đươc sản xuất
bỏi 3 chủng có phạm vi hẹp.
Một cơ chế quan trọng là đưa đặc tính probiotic vào sử dụng, nhiều nghiên cứu
trọng điểm trong việc sản xuất chất kháng sinh (Servin 2004). Nghiên cứu trước đây cho
thấy B. licheniformis AnBa9 hiển thị dòng quang phổ hẹp của hoạt tính kháng sinh và ức
chế 1 vài vi khuẩn Gram dương khác như chủng Listeria và vi khuẩn Gram âm (Anthony
năm 2009). Tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn của cerein 8A được sản xuất từ Bacillus
cereus có thể ức chế vi khuẩn Gram âm như là E.coli, S. enteritidis và L. monocytogenes
(Bizani et al. 2005). Một chất kháng khuẩn từ một loài vi khuẩn Bacillus mới phân lập từ
lưu vực sông Amazon đã ức chế một loạt các chủng chỉ số, bao gồm cả vi khuẩn gây
bệnh và hư hỏng thực phẩm (Motta et al. 2007). Bacillus licheniformis IMAUB1002 cũng
cho thấy một tác động ức chế nhiều loại vi khuẩn gây bệnh và hư hỏng thực phẩm của
cả gram dương và âm, hoạt động kháng khuẩn của 3 chủng vi khuẩn Bacillus hiển thị
khác nhau trong quang phổ thu hẹp.
Đây sẽ là điều kiện thích hợp để thực hiện nghiên cứu sâu hơn về hoạt động kháng
khuẩn của Bacillus licheniformis IMAUB1002 bị cô lập để cô lập, đặc điểm và xác định
các hợp chất kháng khuẩn sản xuất chống lại các mầm bệnh. Kể từ khi một số các
chủng vi khuẩn Bacillus cho thấy tính chất thú vị kháng khuẩn, đó cũng là hữu ích để
nghiên cứu tính probiotic của chúng.
V. Kết luận
33 chủng Bacillus được phân lập từ 16 mẫu cháo lên men truyền thống ở Inner
Mongolia của Trung Quốc và được xác định bằng cách phân tích trình tự 16S rDNA.
Bacillus cereus và Bacillus subtilis là chủng chiếm ưu thế. Trong số tất cả các vi khuẩn
Bacillus, Bacillus licheniformis IMAUB1002, Bacillus subtilis IMAUB1011, Bacillus
amyloliquefaciens IMAUB1014 và Bacillus amyloliquefaciens IMAUB1034 có khả năng
chống chịu với dịch vị mô phỏng ở pH 2.0 trong 3 giờ và có khả năng chống chịu để
chuyển hóa với tỷ lệ sống cao (tất cả trên 90%). Hơn nữa, Bacillus licheniformis
IMAUB1002 có khả năng chống chịu với muối mật (0,6%) và cho thấy hiệu ứng tương
phản cao nhất so với 5 tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm. Nghiên cứu này cho
thấy truyền thống lên men cháo, mà chế biến đa dạng sinh học của Bacillus có thể được
sử dụng như một nguồn tiềm năng cho sự cô lập của probiotic Bacillus.
nguon tai.lieu . vn
