Xem mẫu
- C¸n bé HDKH: TS. §µo Xu©n t©n
Häc viªn: §µo thÞ ngäc anh
K11- Sinh häc thùc nghiÖm
- 1.1 Cấu trúc phân tử insulin
Insulin là một hoocmon protein do tế bào
tuyến tụy sinh ra. Phân tử protein insulin có khối
lượng khoảng 6000da. Cấu tạo bởi hai chuỗi
polypeptit A và B. Các chuỗi A và B liên kết với
nhau bằng hai cầu nói đisulfua. Hầu hết các loài
chuỗi A gồm 21aa; chuỗi B có 30aa.
- Hình 1: Cấu trúc phân tử insulin
Hình
- 1.2 Vai trò sinh học của insulin
1.2
Insulin là một trong những hoocmon
điều hoà nồng độ glucoz trong máu.
trong
1.2.1. Insulin và trao đổi hydratcacbon
-Insulin tuần hoàn trong máu, khi gắn với
thụ thể trên màng tế bào tạo ra phức hợp
thụ thể - insulin làm phát tín hiệu truyền
thông tin chuyển glucoz ra khỏi huyết
tương.
- Hình 2:Insulin gắn với thụ thể trên màng tế bào và tuần hoàn trong máu
- - Insulin thúc đẩy gan dự trữ glucoz ở dạng
Insulin
glycogen. Glucoz bị photphoryl hoá nhờ enzym
hexokinase nhờ đó glucoz bị bẫy vào trong tế
bào.
- Insulin ức chế hoạt động của glucoz - 6
photphatase. Khi không có mặt insulin, quá trình
tổng hợp glycogen bị dừng lại và các enzym
phân huỷ glycogen hoạt động.
- Insulin ngăn cản lượng
đường quá cao trong máu
nên không được có quá
nhiều insulin, do đó enzym
insulinase kiểm soát mức
độ insulin.
Khi lượng insulin quá cao
enzym insulinase sẽ phân
huỷ hoocmon này với thời
gian 6 phút.
Quá trình này đảm bảo cho
hàm lượng insulin được
ổn định trong máu và
lượng glucoz không bị
giảm xuống mức nguy Hình 3: insulin điều hoà glucoz trong máu
hiểm.
- 1.2.2. Insulin và trao đổi lipit
a- Insulin thúc đẩy sinh tổng hợp các axit béo trong gan.
Khi lượng glycogen trong gan quá cao (> 5% lượng thô của
gan) thì quá trình tổng hợp bị ức chế. Lượng glucoz hấp thụ vào
tế bào gan chuyển sang tổng hợp axit béo và chuyển khỏi gan ở
dạng lipoprotein.
Các lipoprotein đi vào vòng tuần hoàn, cung cấp các axit béo tự do
cho các mô khác như mô mỡ để tổng hợp triglyxerit.
b- Insulin ức chế phân huỷ chất béo trong mô mỡ: bằng cách ức chế
b-
quá trình thuỷ phân triglyxerit thành glixerol và axit béo tự do.
Enzym nhạy cảm với hoocmon này trở nên hoạt động được khi
Enzym
photphoryl hoá. Insulin làm ngăn cản sự kết hợp với thụ thể trên màng
tế bào. Do đó làm tăng sự tích tụ triglyxerit trong tế bào các mô mỡ.
- 1.2.3. Những tác động khác của insulin
1.2.3.
- Insulin làm tăng tính
Insulin
hấp thụ của các axitamin.
- Insulin làm tăng tính
Insulin
thấm các ion kali, magie và
th
photphat vô cơ tạo điều
kiện cho quá trình
photphoryl hoá và sử dụng
glucoz.
Hình 4: Insulin làm tăng tính thấm các ion kali,
magie và photphat vô cơ
- 1.3. Tổng hợp insulin trong cơ thể
1.3.
Insulin được tổng hợp trong tế bào β của tuyến tụy.
Insulin được tạo ra từ một phần của một protein lớn hơn để
đảm bảo sự gấp nếp đúng.
mARN dịch mã protein preproinsulin. Preproinsulin
gồm một trình tự đầu aa để tiền chất này đi qua lưới nội
chất tham gia vào quá trình sau dịch mã.
Tại quá trình sau dịch mã preproinsulin bị thuỷ phân
tạo thành dạng proinsulin. Sau khi hình thành 3 cầu đisulfua
một số peptitdaza cắt proinsulin thành insulin hoàn chỉnh và
hoạt động.
Insulin được đóng gói và chứa trong các hạt tiết tích tụ
trong tế bào chất đến khi được kích hoạt để giải phóng.
- Hình 5: Tổng hợp insulin trong cơ thể
Hình
- 6: Các bước cải biến sau dịch mã của phân tử insulin
Hình
Hình
- Hiện nay công nghệ ADN tái tổ hợp được sử dụng để sản
Hi
xuất.
2.1. Phương pháp 1
Tạo ra các chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học hoặc tạo một tiền
chất chuỗi đơn proinsulin người, sau đó phân cắt để tạo thành
insulin hoàn chỉnh.
Bước 1: Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân
tử tách được gen mã hoá proinsulin người trên nhiễm sắc thể
số 11.
Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ
của người. Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để
khuếch đại gen. Do hầu hết các mARN của người đều có
đuôi polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với đuôi
polyA đó.
Sử dụng sắc kí ái lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho
quá trình dịch mã; còn lại loại bỏ ADN và các ARN khác.
Cắt bỏ cầu nối A - T thu được mARN.
- Hình 7: Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người
Hình
- Bước 2: Tách và thiết kế plasmit tái tổ hợp.
Tách
- Cắt gen mã hoá proinsulin và plasmit bằng một loại enzym giới hạn.
Nối bằng ADN ligase của phageT4.
-Thiết kế các trình tự mã hoá cho các protein tín hiệu giúp vận chuyển
insulin ra ngoài tế bào chất.
+Nếu sử dụng mARN tách được từ trên tiến hành như sau:
- Sao mARN tinh khiết thành cADN nhờ enzym phiên mã ngược và nhờ
các dNTP (trong phản ứng RT - PCR)
- Cài đoạn cADN mã hoá insulin hoàn chỉnh vào plasmit đứng sau một
promoter mạnh. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli.
Bước 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn
với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện. Sau quá trình biến nạp, cần
chọn lọc được những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn.
- Hình 8: Tách và biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli
Hình
- Bước 4: Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa vào lên
men.
Nuôi chúng trong nồi lên men sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục,
Nuôi
các chất dinh dưỡng được bổ xung thường xuyên để đảm bảo sự tăng
trưởng của vi khuẩn theo hàm số mũ.
Sau 20 phút có hàng triệu vi khuẩn được nhân lên qua nguyên phân. Chỉ
sau một thời gian ngắn, sinh khối tăng lên rất nhanh và gen insulin được
tổng hợp.
Hình 9: Đưa các vi khuẩn chuyển gen
Hình
vào nồi lên men.
vào
- Bước 5: Tiền tinh sạch
Ti
Sau khi lên men cần
tách tế bào và khử
trùng nhiệt.
Dùng enzym lizozyme
Dùng
phá vỡ màng tế bào,
phá
sau đó dùng hỗn hợp
chất tẩy rửa để tách
lớp màng lipit.
Bằng phương pháp ly
tâm và lọc tách được
proinsulin.
Hình 10: Proinsulin được lọc tách
nguon tai.lieu . vn
