Xem mẫu
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
Bài tiểu luận Công nghệ tế bào
thực vật " Vaccine ăn "
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang1 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
Mục Lục
I/ ĐỊNH NGHĨA: ...................................................... 4
II. CƠ SỞ KHOA HỌC ........................................... 5
III.NGUYÊN LÝ SẢN XUẤT VACCINE ĂN
ĐƯỢC: ...................................................................... 6
IV.CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO
THỰC VẬT............................................................... 7
1. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium[1] ......................................... 8
2.Chuyển gen ổn định:[1] .............................................................................................. 9
3.Chuyển gen bằng súng bắn gen[2] ............................................................................ 13
4. Kỹ thuật calcium phosphate ..................................................................................... 15
5. Chuyển gen qua liposome ................................ ................................ ........................ 16
1.Vắc-xin từ khoai tây...chuyển gien! .......................................................................... 22
2. Gạo chứa vaccine chống dịch tả ................................ ................................ ............... 23
3.Thuốc lá chuyển gen có chứa vắc-xin chống dịch hạch ......................................... 24
4. Vacxin giúp ngăn ng ừa ung thư:................................ ................................ ........... 25
5.Vacxin cai thuốc lá: ................................................................................................ 26
6.Loại gạo chữa dị ứng chứa vacxin ăn được: .......................................................... 27
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang2 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
7.Tạo lúa chuyển gien chứa vaccine .......................................................................... 27
1.Tạo vắc-xin viêm gan B "ăn được" từ trái cà chua ................................ ............... 29
LỜI MỞ ĐẦU:
Tiêm chủng là một trong những trang bị tối cần thiết để một đứa trẻ lớn lên an
toàn và khoẻ mạnh, tuy nhiên bất kỳ một đứa trẻ nào, (và ngay những trẻ đã lớn)
đều rất “ngại” chỉ cần nghĩ đến việc tiêm thuốc. Vì đường tiêm thường gây đau cho
người sử dụng, cộng thêm số lượng virút gây bệnh nguy hiểm ngày càng nhiều kéo
theo số lượng mũi tiêm cũng tăng lên và mỗi lần tiêm vào mỗi chỗ khác nhau của cơ
thể . Chưa kể đến việc bảo quản, vận chuyển với điều kiện nghiêm ngặt đối với các
vaccine. Giải quyết hết tất cả những vấn đề n ày các nhà khoa học của chúng ta đã
tạo ra một cái gọi là “Vaccine ăn”
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang3 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
Ở nước ta Vaccin ăn có lẻ là một cụm từ khá mới mẻ nhưng đối với các nước
phát triển trên thế giới thì nó không có gì xa lạ lắm, bởi từ những năm đầu thập
niên 90 người ta đã tạo thành công những “cây Vaccine ăn” đầu tiên
Tuy nhiên cho đến nay việc Nghiên cứu và phát triển vaccine ăn vẫn còn đang
là một phương hướng nghiên cứu rất mới của công nghệ sinh học, đặc biệt là ở
những nước đang phát triển và những nước nghèo, nơi mà vấn đề miễn dịch thường
là mối quan tâm lớn.
Nghiên cứu và phát triển vaccine ăn cần sự kết hợp đồng thời giữa lĩnh vực
miễn dịch học và thực vật học. Do vậy việc nghiên cứu, phát triển và thử nghiệm
vaccine ăn thông qua cây trồng chuyển gen vẫn còn nhiều hạn chế, tuy nhiên cũng
đã thu được những nhiều thành tựu to lớn.
I/ ĐỊNH NGHĨA:
Vaccine ăn được từ thực vật là vaccine tiểu phần protein làm kháng nguyên
mong muốn. Vaccine ăn là vaccine tác động vào th ể dịch, kích thích cả hệ thống
m iễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào [1]
Ngoài ra vaccine ăn được còn là vaccine tiểu phần bao gồm một hoặc nhiều
chuổi polypeptitcủa protein kháng nguyên trong vi sinh vật gây bệnh . Người ta chọn
lọc những gen m ã hoá cho các thành phần n ày, đưa vào vectơ, dựa vào h ệ thống di
truyền thực vật để khuyếch đại gen và biểu hiện thành công kháng nguyên protein
mong muốn trong các bộ phận ăn được của thực vật, loại văccine này đư ợc cơ th ể
chấp nhận và nó b ền vững trong dịch tiêu hoá đi qua đường tiêu hoá mà không bị
phân hu ỷ [1]
Vaccine ăn được có hoạt tính tương tự như vaccine thông thưòng, ch ỉ khác là
vaccine này được thực vật sản xuất trong những phần ăn đư ợc như lá, củ, quả, hạt.
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang4 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
Nổ lực sản xuất vaccine đầu tiên từ thực vật đư ợc ghi nhận vào năm 1990 khi công
trình nghiên cứu biểu hiện protein kháng nguyên bề mặt A của vi khuẩn
Streptococus mutans ở cây thuốc lá [1]
II. CƠ SỞ KHOA HỌC
Với các tiến bộ khoa học hiện nay trong việc tạo cây trồng chuyển gen cho
phép tạo cây trồng chuyển gen có chứa vaccine ăn được với các bước:
Chọn lựa và nhân bản đoạn gen kháng nguyên của vi khuẩn và vi rút gây
bệnh.
Thử nghiệm thành công các vectơ biểu hiện gen tái tổ hợp.
Chuyển thành công gen kháng nguyên vào nhiều loài đối tượng thực vật.
Gia tăng tốc độ và khối lượng protein tái tổ hợp được được sản sinh
trong cây trồng .
Vaccine ăn được có những ưu điểm nổi trội:
Dể dàng tăng qui mô sản xuất và dể thu sinh khối
Tính ổn định cao,dễ bảo quản và sử dụng:
Các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ngay ở nhiệt độ phòng do
chúng được sản xuất và được bao bọc bởi các mô thực vật mà cụ thể là chúng đư ợc
đ ịnh vị trong lưới nội chất, thể Golgi hoặc bề mặt tế bào. Nh ờ tính ổn định này mà
chúng trở n ên dể d àng bảo quản và sử dụng (ngay trong thực vật) m à không cần
giữ lạnh như các vaccine tiêm. Trong quá trình sản xuất vaccine ăn đư ợc người ta
chỉ cần vận chuyển và sử dụng ngay bộ phận thực vật chứa vaccine đó
Tính ăn được:
Loại vaccine trong thực vật này đư ợc chính mô trong thực vật bao bọc, hạn
chế được sự phân huỷ của dịch tiêu hoá ở đư ờng ruột và ổn định, bền vững trong cơ
th ể n ên vaccine này có thể ăn tươi (qu ả, lá) hoặc nấu chín (hạt, củ). Nhiều nghiên
cứu cho thấy nhiều kháng nguyên vaccine được biểu hiện hiệu quả ở rau diếp cá
(lá), khoai tây (củ), cà chua (quả) và ngô (h ạt).
Tính An toàn:
Vì vaccine được sản xuất trong thực vật là vaccine dưới đ ơn vị sử dụng gen
m ã hoá cho một phần protein vỏ virus m à không cần đến virus sống như vaccine
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang5 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
giảm độc lực hay virus chết như vaccine bất hoạt. Do đó vaccine này không trở lại
thành virus gây bệnh cho người và động vật, đồng thời nó cũng tránh được nguy cơ
nhiễm mầm bệnh tiềm tàng từ vaccine. Do đó, không cần tách chiết và tinh sạch
kháng nguyên vaccine
Vaccine ăn được kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống thể dịch hiệu
quả hơn vaccine tiêm
Ta biết rằng hầu hết các vi sinh vật gây bệnh đều xâm nhập vào cơ thể qua bề
m ặt nhầy trong đường tiêu hoá, hô hấp và đường tiết niệu. Khi vaccine ăn vào cơ
th ể theo đường miệng nó sẽ cảm ứng hệ thống miển dịch thể dịch sản xuất các
kháng th ể chống lại vi sinh vật gây bệnh, tiếp đó hệ thống thể dịch lại tác động vào
h ệ thống miển dịch của tế bào, tạo ra các globulin miển dịch tăng cường khả năng
b ảo vệ sớm và hiệu quả cho cơ thể. Khi tiêu hoá vaccine ăn được, kháng nguyên
được giải phong trong ruột non.
Những nghiên cứu bảo vệ kháng nguyên làm vaccine ăn được trước tác động
của dịch tiêu hoá, đặc biệt của cơ th ể con người khẳng định giá trị thực tiễn của
vaccine ăn được sản xuất nhờ thực vật chuyển gen
Với những ưu điểm nỗi bật của vaccine ăn thì việc sản xuất vaccine ăn đuợc
xem là hệ thống sản xuất vaccine lý tưởng đ ơn giản và giá thành th ấp đã thành công
và được đăng kí bảo hộ sáng chế. Sau đó nhiều thành công khác về vaccine thực vật
cũng đựoc công bố trên nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá, rau diếp, cà chua,
khoai tây…Số lượng nghiên cứu về vaccine ăn được đựơc gia tăng đã ch ứng tỏ tính
ưu việt của thực vật như một hệ thống biểu hiện hiệu quả cao, chi phí sản xuất thấp,
an toàn về mặt sinh học, sử dụng và bảo quản dể d àng không cần giữ lạnh
III.NGUYÊN LÝ SẢN XUẤT VACCINE ĂN ĐƯ ỢC:
Quy trình sản xuất vaccie ăn được:
Lựa chọn gen cần được biểu hiện (gen quan tâm) và đưa vào một vector
-
thích h ợp ;
Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen;
-
Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật đã lựa chọn
-
bằng các phương pháp chuyển gen khác nhau;
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang6 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
Kiểm tra biểu hiện
- G en lấy từ nguồn bệnh người được
chuyển vào vi khuẩn gây nhiễm thực vật
của gen quan tâm trong
Vi khuẩn được nhiễm vào các
những bộ phận ăn được của mẫu lá khoai tây
thực vật; mầm tạo đựoc từ các mẫu lá
mang gen bệnh người
Thử nghiệm khả
-
năng đáp ứng m iễn dịch của K hi ăn khoai
tây gây ra
phản ứng miễn
vaccine sản xuất từ thực
dịch mầm
bệnh
vật;
Sử dụng vaccine
-
đã thử nghiệm thành công
bằng cách ăn tươi dưới dạng thức ăn đ ã chế biến.
Thiết kế vector biểu hiện
Điểm quan trọng nhất trong thiết kế
vector biểu hiện là promoter, đây phải là
p romoter kho ẻ, có ái lực mạnh với RNA-
polymerase của vật chủ và ho ạt động của
p romoter đư ợc điều hoà một cách dễ dàng.
Trong nhiều nghiên cứu gần đây, với mục
đ ích biểu hiện kháng nguyên vaccine trong
các bộ phận ăn được của thực vật, người ta
đ ã thiết kế promoter đặc h iệu mô thực vật, ví
dụ promoter đặc hiệu mô củ hoặc mô hạt thì
p rotein sẽ được sản xuất trong củ hoặc hạt.
IV.CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN
GEN VÀO THỰC VẬT
Các phương pháp biểu hiện gen dựa
trên thực vật đã được phát triển từ cuối
những năm 1970 đầu 1980. Hiện nay, có thể
xếp những phương pháp này vào hai nhóm
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang7 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
Hình 1.1 :Tạo thực vật chuyển gen bằng
phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ
Agrobacterium
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
chính sau: Chuyển gen ổn định tức là gen quan tâm được bảo tồn qua nhiều thế hệ
do gắn vào hệ gen vật chủ (chuyển gen vào nhân hoặc plastid) và biểu hiện gen tạm
th ời dựa trên Agrobacterium và vector virus thực vật, theo nguyên tắc có thể sử
dụng bất kỳ phương pháp chuyển gen vào thực vật nào cũng có thể tạo ra thực vật
chứa vaccine ăn được, tuy nhiên hiện nay người ta chỉ mới tạo thành công vaccine
ăn nhờ súng bắn gen và nhờ vi khuẩn Agrobacterium
1. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium[1]
Cây chuyển gen đầu tiên đã được tạo ra năm 1983 sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens. Đây là loại vi khuẩn sống trong đất, gây bệnh cho cây
b ằng cách gắn các đoạn gen vào h ệ gen của tế b ào chủ và sinh ra u nhờ một loại
p lasmid của vi khuẩn này, plasmid Ti. Người ta đã lợi dụng đặc điểm của vi khuẩn
Agrobacterium để chuyển gen mong muốn vào thực vật, trong đó plasmid Ti bị bất
hoạt, nó chỉ còn khả năng gắn DNA vào tế bào và mất khả năng gây bệnh.
Trong sản xuất vaccine ăn được, ngư ời ta thiết kế một vector gồm hai gen:
Một gen mã hoá cho kháng nguyên virus và một gen kháng kháng sinh. Do đó,
trong môi trư ờng có kháng sinh, những tế bào thực vật không mang gen chuyển sẽ
b ị chết, trái lại tế bào mang gen sẽ h ình thành callus, từ đó tạo thành cây hoàn
chỉnh.
Phương pháp này có m ột số bất lợi: plasmid Ti gắn gen ngẫu nhiên vào h ệ
gen thực vật, làm tăng tính không đồng đều về mức độ biểu hiện kháng nguyên
trong cây chuyển gen. Ngoài ra cách gắn gen này có th ể phá vỡ biểu hiện gen dẫn
đ ến sinh trư ởng bất th ường của cây chuyển gen.
Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium là có hiệu quả đối
với một số loài nhưng không phải tất cả thực vật có thể được biến nạp bằng con
đường này. Ðặc biệt, lớp một lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới
như lúa, lúa mì và ngô là không được biến nạp dễ dàng nhờ A. tumefaciens.
Ðể khai thác và sử dụng A. tumefaciens như là một vector chuyển gen các nh à
khoa học đ ã lo ại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T - DNA và thay
th ế vào đó là các m arker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái
của T-DNA và các gen vir. Gen chuyển đư ợc xen vào giữa các vùng bờ của T-
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang8 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
DNA. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào
thực vật
Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium đã được kiểm tra đối
với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc
b iệt.
Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh h ưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được
b iến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức độ khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens
sử dụng, môi trư ờng để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn
lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật.
2.Chuyển gen ổn định:[1]
Chuy ển gen vào nhân
Là phương pháp chuyển gen ổn định do gắn gen quan tâm vào nhiễm sắc thể
thực vật được ứng dụng phổ biến trong sản xuất protein chức năng. Ngo ài ra, có th ể
đưa gen vào lục lạp. Lục lạp là cơ quan tử của thực vật có nguồn gốc từ vi khuẩn
cộng sinh trong thực vật và có cơ thể di truyền rất giống với các plasmid vi khuẩn.
Người ta tính rằng trong tế bào lá trưởng thành có tới 100 lục lạp, mỗi lục lạp có
chưa 100 bản sao DNA vòng, vì thế mức độ biểu hiện gen rất cao, có thể tới 35%
p rotein tổng số. Tu y nhiên, protein được biểu hiện thường không có chức năng đầy
đủ do bộ máy di truyền của lục lạp ở mức độ cơ quan tử n ên khó có th ể đảm bảo các
b iến đổi sau dịch m ã.[1]
Chuy ển gen trực tiếp vào protoplast
Ðể DNA dễ xâm nhập được vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo
p rotoplast. Protoplast có th ể đ ược duy trì trong môi trư ờng nuôi cấy như các tế bào
sinh trưởng một cách độc lập hoặc với một môi trường đặc hiệu, vách tế bào có th ể
được tạo thành và toàn bộ các cây có thể được tái sinh từ các tế bào này. Quá trình
chuyển gen nh ư thế này được thực hiện một cách trực tiếp bằng một cơ chế vật lý
đ ơn giản, không cần có vector.
Ðể nâng cao hiệu quả biến nạp, người ta đã đã xử lý protoplast với P GE
(polyethylene glycol) hoặc bằng xung điện.
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang9 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
Phương pháp chuyển gen này rất có hiệu quả, đặc biệt đối với những loài thực
vật m à phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium không thể thực hiện
được. Với ph ương pháp này, các nhà khoa học đ ã chuyển gen thành công vào một
số loài cây m ột lá mầm như loài lúa phụ Japonica (Datta, 1990), ngô (Doon, 1990),
lúa mì (Vassil, 1992).
Chuy ển gen bằng kỹ thuật xung điện
Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương pháp cơ học đư ợc sử dụng
đ ể đưa các phân tử phân cực vào trong
tế b ào chủ qua màng tế bào. Trong
phương pháp này, một xung điện cao
th ế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn
giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc
m àng kép phospholipid (hình 2.14),
tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép
Hình 2.14:Sơ đồ màng phospholipid
các phân tử DNA ngoại lai từ môi
trường xâm nhập vào bên trong tế b ào.
Nhiều kỹ thuật nghiên cứu trong sinh học phân tử yêu cầu đưa gen hoặc
p rotein ngoại lai vào trong tế bào chủ. Vì lớp phospholipid kép của m àng sinh ch ất
có một đầu ưa nước phía ngoài và m ột đầu ưa nước phía trong , nên b ất kỳ phân tử
phân cực nào, bao gồm cả DNA và protein, đều không có khả năng đi qua màng
một cách tự do
Sơ đồ bên cho thấy các thành phần hóa học của màng sinh ch ất. Các đầu ưa
nước phân cực hướng về phía ngo ài trong khi các đuôi kỵ n ước hướng về phía trong
và tương tác với đuôi kỵ nước khác đ ể cùng bám giữ m àng. Các phân tử phân cực
không th ể đi qua màng này nếu như không có sự hỗ trợ bên ngoài.
Nhiều phương pháp đã được phát triển để vượt qua rào cản n ày, cho phép đưa
DNA và các phân tử khác vào trong tế
b ào đã được nghiên cứu. Một trong những
phương pháp này là kỹ thuật xung điện.
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang10 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
Hình 2.15: Cuvette nhựa có điện cực
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái tương đối yếu của các tương tác k ỵ
nước của phospholipid kép và khả năng tập hợp lại một cách tự động của nó sau khi
b ị rối loạn (Purves, 2001). Vì vậy, một xung điện chớp nhoáng có thể gây ra rối
lo ạn ở các vị trí của m àng một cách nhất thời, làm cho các phân tử phân cực có thể
đ i qua, nhưng sau đó màng có thế đóng kín lại nhanh chóng và tế b ào không bị ảnh
hưởng gì cả.
Các tế b ào chủ và DNA ngoại lai được
tạo th ành d ịch huyền phù và cho vào trong một
cuvette nhựa có điện cực (hình 2.15)
Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một
th ời gian ngắn người ta sử dụng một thiết bị
gọi là máy xung gen (gene pulser). (hình 2.16)
Quá trình cơ bản diễn ra bên trong máy
Hình 2.16 :Máy xung gen (Gene pulser)
n ày có thể đ ược trình bày bằng sơ đồ (h ình ( Hãng Biorad)
2 .17)
Sơ đồ n ày cho thấy mạch điện cơ bản cung cấp điện cho kỹ thuật xung điện.
Khi công tắc thứ nhất đóng, tụ điện
n ạp điện vào và tích một điện áp cao.
Khi công tắc thứ hai đóng, điện áp
n ày phóng qua dịch huyền phù tế b ào.
Mộ t xung điện cần thiết cho kỹ thuật
n ày thường là khoảng 10.000 -100.000
v/cm (thay đổi tùy theo kích thước
của tế bào) trong vài phần triệu giây
đ ến một phần ngàn giây. Xung điện
Hình 2.17: Sơ đồ bố trí mạch cơ bản của máy
n ày làm rối loạn phospholipid kép của xung điện
m àng tế bào và tạo ra các lỗ tạm thời.
Khả năng điện qua màng tế bào cùng lúc tăng lên 0,5-1,0 v vì vậy các phân tử đ ã
được nạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng cách thức tương tự
như điện di (Hình 2.18).
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang11 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
Lối DNA đi vào tế b ào không thể quan sát thấy dưới kính hiển vi, nhưng hình
vẽ này cho th ấy khái niệm cơ bản của sự tạo
thành các lỗ trên màng mà DNA có th ể đi qua.
Khi các ion đ ã nạp điện và các phân tử
đ i qua các lỗ, m àng tế b ào phóng điện và các
lỗ này đóng lại một cách nhanh chóng và Hình 2.18: Sơ đồ plasmid chứa DNA
ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời
phospolipid kép ph ục hồi lại cấu trúc cũ
(Weaver, 1995). Lúc này các phân tử mong
muốn đ ã ở trong tế bào và chúng được sử
dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Phương pháp này có th ể sử dụng đối với gần như tất cả các loại tế bào của các
loài. Lúc đ ầu phương pháp này được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào động
vật có vú, về sau cho cả tế bào thực vật ở dạng protoplast... Với một số cây một lá
m ầm quan trọng (loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì) mà không thể thực hiện được
b ằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium thì người ta đã thành
công với ph ương pháp này. Hiệu quả biến nạp cao. Trong một nghiên cứu ở E.coli,
80% số tế bào nhận đư ợc DNA ngoại lai (Miller và Nickoloff, 1995). Lượng DNA
n goại lai cần thiết là ít hơn so với các phương pháp khác (Withers, 1995). Phương
pháp này có thể thực hiện với các mô in vivo còn nguyên vẹn (Weaver, 1995). Ðoạn
DNA ngoại lai đ ược biến nạp có kích th ước lớn. Tuy nhiên nếu các xung điện có
cường độ và chiều dài không đúng thì một số lỗ của tế bào sẽ trở nên quá lớn hoặc
b ị hỏng không thể đóng lại sau khi tế b ào phóng điện, làm cho tế bào b ị tổn thương
hoặc bị thủng (Weaver, 1995). Một hạn chế nữa là sự vận chuyển DNA ngoại lai
vào và ra khỏi tế bào trong suốt thời gian điện biến nạp là tương đối không đặc hiệu.
Ðiều này dẫn đến kết quả là không cân bằng ion mà sau đó sẽ làm rối loạn chức
n ăng của tế bào và tế bào ch ết (Weaver, 1995).
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang12 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
Kỹ thuật xung điện được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của
sinh học phân tử và y học. Các ứng dụng của kỹ thuật xung điện bao gồm:
Biến nạp DNA: các gen đ ặc
h iệu có thể được tạo dòng trong
p lamid và sau đó plasmid này được
đưa vào tế b ào chủ để nghiên cứu
cấu trúc và chức năng của gen và
p rotein.
Dung h ợp tế b ào đã kích
-
thích: sự tạo th ành các lỗ thủng trên
m àng xảy ra do xung điện chớp
nhoáng tạo ra cho th ấy đã kích thích
sự dung hợp tế bào (Weber và
Berrg, 1995).
3.Chuyển gen bằng súng bắn
gen[2
]
Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng
đ ể đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế
đ ầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực
vật và được phát triển vào đ ầu thập niên 1980 do các
nhà thực vật học ở Ðại học Corrnell cùng với các nh à
n ghiên cứu ở Corrnell Nanofabrication Facility,
Newyork, USA. Súng bắn gen được bán trên thị
trư ờng vào năm 1990. Ðạn sử dụng cho loại súng này
Súng bắn gen
là các h ạt kim lo ại nặng cơ b ản được bao bọc DNA.
Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gen là h ệ thống phân phối hạt biolistics
(biolistic particle delivery system) và k ỹ thuật này thư ờng được gọi một cách đ ơn
giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology (sinh học) và ballistics (sự
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang13 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
b ắn tung)). Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nhau nhưng nguyên lý chung của
phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium để gai tốc các hạt.
Súng b ắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thư ớc 6 “x7“x10“
nối với hai bơm chân không. DNA
n goại lai được gắn vào các h ạt tungsten
có đường kính rất nhỏ, khoảng 1 µm
(các kim loại nặng khác như vàng và
b ạc cũng được sử dụng nhưng không
thường xuyên do giá cả đắt). Các hạt
n ày được đặt trên một cái đĩa ở mặt bên
trong của súng. Sự bùng nổ khí helium
ở 1000psi làm cho cái đĩa bắn về phía
trước với tốc độ 1300 food/s, tương
đương với tốc độ khi một viên đạn rời
khỏi nòng súng. Một tấm chắn làm
Hình 2.21:Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng
dừng đĩa lại và các hạt vàng hay bắn gen
tungsten được phóng về phía các tế bào
đ ích. Chúng xuyên qua vách tế bào và phóng thích các phân tử DNA (Hình 2.21).
Súng bắn gen sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để hợp nhất sự biểu hiện các gen đ ã
phân phối. Các tế bào biến đổi di truyền có thể đ ược sử dụng để tạo thực vật bao
gồm cả sự sửa đổ i di truyền mong muốn ở trong tất cả các tế bào của chúng
(Voiland, 1999).
Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các tế b ào thực vật giống
nhau sinh trưởng trong môi trường gel trên đĩa petri. Sau khi các hạt tungsten đ ã va
chạm vào đĩa, gel và callus b ị phá vỡ nhiều. Tuy nhiên một số tế b ào không b ị phá
vỡ khi va chạm mạnh và đ ã tiếp nhận các hạt tungsten đư ợc bao bọc DNA và cuối
cùng các phân tử DNA ngoại lai đã xâm nhập và hợp nhất vào nhiễm sắc thể thực
vật. Các tế b ào từ đĩa petri được tập h ợp lại và chọn lọc các tế b ào đ ã hợp nhất
thành công và biểu hiện DNA ngoại lai bằng các kỹ thuật hóa sinh hiện đại như sử
dụng gen chọn lọc nối tiếp và Northern blots.
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang14 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
Các tế bào đơn đã chọn lọc từ callus có thể được xử lý với một số hormone
thực vật như auxin, gibberelin và mỗi một tế bào có thể phân chia, biệt hóa thành
các tế bào mô, cơ quan, tế bào chuyên hóa của toàn bộ cây. Cây mới có nguồn gốc
từ một tế bào n ảy mầm thành công có thể mang các đặc tính di truyền mới.
Phương pháp này có ưu điểm là thao tác dễ d àng, có thể chuyển gen vào
nhiều loại tế bào và mô, các tế bào được
b iến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép
đưa các gen vào tế bào ở vị trí mong
muốn....Do vậy nó được sử dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực.
4. Kỹ thuật calcium phosphate
Kỹ thuật calcium phosphate
(calcium phosphate technique) đã được
Hình 2.23: Phức hợp DNA-calcium
phát triển đầu tiên là để xác định sự lây
phosphat
nhiễm của DNA virus (Graham,1973) và
h iện nay được sử dụng rông rãi đ ể thử nghiệm hoạt động biến nạp của DNA virus
cũng như DNA tách chiết từ các tế bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979;
Pellicer, 1980).
Kỹ thuật n ày yêu cầu ủ các tế bào nh ận với các chất đồng kết tủa DNA và
calcium phosphat (Hình 2.23). Kết tủa này bám vào tế bào và sau đó sẽ hấp thụ vào
tế bào qua quá trình ẩm bào (Lo yter, 1982). Trong tế bào, các phân tử DNA ngoại
lai nằm trong không bào được tạo th ành do ẩm bào và lysosome thứ hai nhưng rất ít
DNA đi đến nhân và hợp nhất vào genome chủ
Cho đến nay, đây là k ỹ thuật vô cùng có giá trị đối với các nghiên cứu chuyển
gen vào các tế b ào soma nuôi cấy và đang được sử dụng nhiều để chuyển các dòng
genome vào tế bào đích. Tỉ lệ các tế bào được biến nạp ổn định của kỹ thuật n ày là
tương đương với phương pháp vi tiêm nhưng khác với vi tiêm là nhiều tế bào được
b iến nạp cùng một lần. Phương pháp này được sử dụng phổ biến bởi vì đơn giản
p rotocol dễ thực hiện, ít tốn kém,
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang15 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
Hình 2.24: Cấu trúc tổng quát của lipid cation
tổng hợp
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
số tế b ào ch ết sau biến nạp không đáng kể, sự biểu hiện gen có thể là nh ất thời hoặc
ổn định và quan trọng trong việc thiết kế vector virus tái tổ hợp. Tuy nhiên hiệu quả
b iến nạp và m ức độ biểu hiện của gen chuyển thấp.
5. Chuyển gen qua liposome
Vào thập niên 1980, liposome nhân tạo đã được sử dụng để đưa DNA vào tế
b ào. Lipid với to àn bộ lưới tích điện dương ở pH sinh lý là thành phần lipid tổng
h ợp phổ biến nhất của liposome
được phát triển cho chuyển gen
(Hình 2.24). Thường thì lipid
cation được trộn với một lipid
trung tính như L-dioleoyl
phosphatidyl-ethanolamine
(DOPE) (Hình 2.25). Ph ần cation Hình 2.26: Phức hợp liposome-DNA
của phân tử lipid kết hợp với
Hình 2.25: Cấu trúc của DOPE (L-diolecyl
DNA tích điện âm và kết quả là
phosphatidylethanolamine)
chứa đầy DNA trong phức hợp
liposome-DNA (Hình 2.26). Ðối với các tế bào nuôi cấy, to àn b ộ lưới tích điện
dương của phức hợp liposome-DNA nói chung là gây ra hiệu quả chuyển gen cao
h ơn bởi vì nó cho phép phức hợp n ày kết hợp với màng tế bào tích điện âm bền
h ơn. Nh ờ cơ chế nhập bào, các phức hợp xuất hiện trong endosome và sau đó đi vào
nhân. Chưa rõ DNA đư ợc phóng thích từ endosome và đi qua màng nhân như th ế
n ào. DOPE được xem là một lipid kích thích sự dung hợp và vai trò của nó là phóng
thích các phức hợp này từ endosome cũng như làm cho sự dung hợp của màng tế
b ào phía ngoài với phức hợp liposome-DNA xảy ra dễ dàng. Trong phương pháp
n ày, các đại phân tử trước hết được đưa vào trong các túi phospholipid. Các loại túi
khác nhau đã được mô tả, nhưng túi một lớp mỏng là thích hợp nhất cho chuyển gen
vì chúng có tỉ lệ khoảng trống chứa nước ở b ên trong tương đối cao đối với mỗi đ ơn
vị lipid và bởi vì chúng có tỉ lệ phân phối cao hơn. Sự dung hợp của liposome với
m àng plasma là một sự kiện hiếm. Hiệu quả biến nạp của phương pháp này thấp
h ơn so với phương pháp vi tiêm vào tiền nhân. Các nổ lực nghiên cứu đang được
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang16 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
tiến h ành đ ể tìm ra các điều kiện thí nghiệm mà có thể làm tăng sự phóng thích các
phân tử đã kết nang từ con đường ẩm bào.
Liposome đã được sử dụng để đ ưa protein, lipid và các phân tử nhỏ vào nhiều
lo ại tế b ào nuôi cấy, tuy nhiên hiệu quả thấp hơn vi tiêm đối với RNA hoặc protein.
Cũng nh ư thế, chuyển gen qua liposome và sự biểu hiện của gen chuyển là không
vượt qua được các phương pháp chuyển gen thông thường (nh ư hệ thống virus), sự
b iểu hiện gen chuyển thường nhất thời, sự ức chế bởi các thành ph ần của huyết
thanh có thể xảy ra. Bên cạnh đó, kỹ thuật này có nhiều ưu điểm là gen chuyển sẽ
không hợp nhất vào genome chủ, có hiệu quả tốt đối với cả tế bào in vitro và in
vivo, có th ể mang được các DNA có kích thước rất lớn, độ tinh khiết cao, không gây
m iễn dịch, có thể sử dụng với các tế b ào mà biến nạp bằng kỹ thuật calcium
phosphat không có hiệu quả..
ĐỊNH HƯỚNG VÀ THÀNH TỰU
Trên thế giới:
Những th ành công của các nhóm nghiên cứu trên thế giới đã chứng tỏ việc sản
xuất và đưa sản phẩm vaccine trong thực vật ra thị trường sẽ trở th ành hiện thực
trong một tương lai không xa. Những tiến bộ mà các nhà công ngh ệ sinh học thực
vật trên thế giới đã đạt được tập trung vào một số vấn đề sau:
*Tăng cường mức độ biểu hiện kháng nguyên
Ở phần trên, chúng ta đã biết nhiều kĩ thuật được sử dụng để cải biến di truyền
thực vật, tuy nhiên hầu hết các báo cáo hiện nay về sản xuất vaccine ăn được đều
liên quan đến phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium và promoter phổ biến
nhất trong thiết kế gen biểu hiện là CaMV 35S (promoter của vi khuẩn khảm súp
lơ), một promoter khoẻ cho phép biểu hiện gen ở mức độ cao.
Bên cạnh đó, nhiều hệ thống vector khác cũng đư ợc sử dụng để biểu hiện
kháng nguyên. Việc nghiên cứu sản xuất kháng nguyên dưới đ ơn vị B của độc tố
kém bền nhiệt (LT-B) ở E. coli, được điều khiển bằng promoter đặc hiệu vị trí (đặc
h iệu hạt), làm bằng mức độ biểu hiện LT-B tới 1,8% protein hoà tan tổng số. Đồng
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang17 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
th ời, việc áp dụng hai phương pháp lai tạo giống ngô khác nhau đã nâng thành phần
kháng nguyên gấp 5 và 10 lần. Chikwamba và đồng tác giả cũng biểu hiện LT-B
thành công ở ngô, đây cũng là báo cáo đ ầu tiên sử dụng súng bắn gen để sản xuất
vaccine trong thực vật.
Tuy nhiên hiện nay mức độ biểu hiện kháng nguyên ở thực vật còn thấp là trở
n gại chính trong việc phát triển vaccine này. Trong nỗ lực tìm kiếm giải pháp cho
vấn đề này, Gleba và đồng tác giả (2005) thuộc công ty Genetics (Đức) đã công bố
phương pháp m ới nâng cao mức độ biểu hiện của kháng nguyên vaccine tron g thực
vật. Phương pháp này, gọi là “magnifection” đã kết hợp được những ưu điểm của ba
h ệ thống sinh học là tính hiệu quả và khả năng lây nhiễm hệ thống của
Agrobacterium, tốc độ và mức độ biểu hiện cao của virus, khả năng cải biến sau
d ịch mã và giá thành sản xuất thấp của thực vật. Nguyên tắc của phương pháp này
là lợi dụng sự lây nhiễm của Agrobacterium đ ể vận chuyển và phát tán vector virus
vào thực vật, sau đó vector mang gen quan tâm này sẽ tiến hành sao chép, nhân lên
và lây nhiễm cho to àn bộ tế bào.
Sử dụng phương pháp này trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana và củ cải
đỏ ăn được, nhóm nghiên cứu trên đã thu kết quả rất khả quan. Tốc độ sản xuất
kháng nguyên rất nhanh, vài mg-g trong 3-4 tuần, có thể tăng sản lượng tới
100kg/năm. Mức độ biểu hiện rất cao, đạt 5g protein tái tổ hợp trên 1kg lá tươi
tương đương 80% protein hoà tan tổng số, gấp hơn 10 lần so với các phương pháp
b iểu hiện thông th ường. Nhóm tác giả cũng chỉ ra hạn chế của phương pháp này
như biểu hiện hạn chế các oligopeptide đa thành phần. Tuy nhiên với những ưu
đ iểm vượt trội, phương pháp này tỏ ra rất hiệu quả và có tiềm năng ứng dụng cao để
sản xuất kháng nguyên vaccine thực vật giá rẻ an toàn về mặt sinh học.
Tregoning và đống tác giả (2004) đ ã biểu hiện kháng nguyên vaccine mức độ
cao trong lục lạp thuốc lá với kháng nguyên mô hình là Tet C (kháng nguyên vi
khuẩn uốn ván). Trong nghiên cứu n ày, tác giả đ ã thu được mức độ biểu hiện khác
nhau khi thay đổi hai yếu tố duy trì tính ổn định của promoter (vùng điều khiển gen)
là cách sử dụng m ã bộ ba (codon usage) và vùng trình tự không dịch m ã 5’ (5’
UTR). Ví dụ, khi tăng gấp đôi các codon giàu A-T trong gen, mức độ biểu hiện
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang18 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
cũng tăng gấp đôi từ 10 đến 20% protein ho à tan tổng số. Hoặc khi thay đổi 5’ UTR
từ rbcl UTR th ành T 7gen 10 5’ UTR cũng làm tăng gấp đôi mức biểu hiện của
kháng nguyên TetC. Như vậy, có thể thấy phát hiện n ày rất quan trọng trong việc
chuẩn hoá các đặc điểm của cây chuyển gen vì mức độ biểu hiện gen chuyển qua
cao có thể gây hại cho cây.
*Lựa chọn đối tượng thực vật
Đến năm 2000 đã có 5 kháng nguyên được biểu hiện th ành công ở rau quả.
Trong đó dưới đ ơn vị B của nội độc tố kém bền nhiệt ở E. coli (LT-B), dưới đơn vị
B của độc tố tả (CL-B), protein vỏ capsid virus Norwalk và kháng nguyên b ề mặt
virus viêm gan B đều đ ược sản xuất ở khoai tây. Riêng protein G của virus dại được
b iểu hiện ở cà chua.
Năm 2005, trong một báo cáo mới nhất về vaccine ăn được trong thực vật,
đ ã có nh ững phân tích sâu sắc về các đối tượng thực vật được sử dụng để sản xuất
vaccine, đ ặc biệt là viêm gan siêu vi B. 4 tiêu chu ẩn đối với hệ thống thực vật đáp
ứng mục đích này, đó là:
- Mức độ biểu hiện cao
- Mức độ kháng nguyên đồng đều trong mô thực vật
- Nguyên liệu thực vật phải ăn được
- Kháng nguyên ổn định ở nhiệt độ phòng và có th ể bảo quản lâu dài.
Nhiều nghiên cứư cho thấy, hạt ngô hội tụ 4 tiêu chu ẩn trên của hệ thống biểu
h iện hiệu quả cao, đây cũng là đối tượng mà nhóm ông quan tâm để sản xuất kháng
n guyên vaccine viêm gan B. Năm 2003, họ đã biểu hiện thành công dưới đơn vị B
của độc tố kém bền nhiệt ở E.coli (LT-B). Họ thấy rằng phôi mầm của hạt ngô
chuyển gen tập chung lượng kháng nguyên cao nhất, gấp 6 lần so với bộ phận khác
và nh ững nhân này tương ứng với một liều mg kháng nguyên. Sau đó, năm 2005
nhóm này lại biểu hiện thành công kháng nguyên bề mặt chính của virus viêm gan
B trong h ạt ngô. Mức độ biểu hiện gen trong hạt thu được từ cây chuyển gen thế hệ
thứ nhất là 0,2% protein hoà tan tổng số, trong đó kháng nguyên tập trung tới 20%
trong các phôi mầm của hạt.
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang19 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
- Nhóm: 2 Giáo viên HD:Huỳnh Văn Kiệt
Korban và đồng tác giả đã biểu hiện kháng nguyên vaccine dưới đơn vị virus
RSV ở cà chua, đây là virus gây b ệnh đường hô hấp nghiêm trọng ở trẻ sơ sinh và
trẻ nhỏ. Các thiết kế gen (một loại mang promoter CaMV 35 S và một loại mang
p romoter đặc hiệu quả E-8) chứa gen mã hoá cho kháng nguyên RVS-F được
chuyển vào cà chua thông qua phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium. Sử
dụng promoter đặc hiệu quả cho phép biểu hiện protein chỉ ở trong quả của tất cả
các cây chuyển gen. Protein này tạo đáp ứng miễn dịch khi được thử nghiệm ở
chuột.[3]
*Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của vaccine ăn được
Hầu hết vaccine ăn đ ược ở thực vật đã thử nghiệm ở động vật và giai đoạn 1
ở ngư ời. Một trong những nguyên nhân ảnh hư ởng đến việc thử nghiệm quy mô lớn
ở n gười là do sự ngại rằng vaccine ăn được bị phân huỷ bởi dịch tiêu hoá trong
đường ruột. Do đó, khó có thể thu được kết quả chính xác do không có phản ứng
sinh kháng thể hoặc kháng thể rất ít, không đủ gây đáp ứng miễn dịch. Đồng thời
vaccine ăn được không biểu hiện đồng nhất trong các mô thực vật cũng gây khó
khăn trong việc xác định liều lượng để thử nghiệm.
Thử nghiệm lâm sàng đầu tiên ở người được ghi nhận vào năm 1997 bởi
nhóm nghiên cứu của Arntzen và được sự chấp nhận của Cơ quan quản lí dược
phẩm và thực phẩm Hoa Kì. Trong thử nghiệm vaccine dưới đ ơn vị độc tố E.coli
LT-B này, 11 người đã ăn sống 50-100g khoai tây chuyển gen. Kết quả cho thấy
10/11 người kiểm tra đều tạo kháng thể chống lại LT-B, lượng kháng thể này tương
ứng với kháng thể đo được ở những người niễm E. coli nồng độ 106 . Như vậy,
p rotein LT-B này trong các mô thực vật ăn được không bị phân huỷ trong đường
tiêu hoá và có khả năng đáp ứng miễn dịch ở người.
Hiện nay, Thanavala và đồng tác giả (2005) đang thử nghiệm giai đoạn I và
II vaccine viêm gan B ở khoai tây. Khi ăn 2 đ ến 3 liều, mỗi liều 100g khoai tây
sống tương đương 1mg kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B, 33 người kiểm tra
có phản ứng tạo kháng thể với nồng độ 10 mIU/mL.
Bài tiểu luận:Vaccine ăn trang20 Môn:Công nghệ tế bào thực vật
nguon tai.lieu . vn
