- Trang Chủ
- Ngư nghiệp
- Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm của chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2
Xem mẫu
- Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(94)/2018
ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG SINH
HOẠT TÍNH KHÁNG Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH TRÊN TÔM
CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces aureofaciens 25.2
Nguyễn Xuân Cảnh1, Trần Thị Thúy Hà2,
Phạm Thị Hiếu1, Ngô Thùy Dương1
TÓM TẮT
Nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu đánh giá các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng
hợp chất kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm. Các thí nghiệm được thiết kế và thực hiện trong các điều kiện nuôi cấy khác
nhau để đánh giá khả năng sinh chất kháng khuẩn tối ưu của chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2. Kết
quả nghiên cứu cho thấy chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 bắt đầu sinh chất kháng khuẩn ở ngày nuôi
cấy thứ 3 và đạt cực đại sau 5 ngày với điều kiện nuôi lắc 150 vòng/phút. Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng xạ
khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 sinh chất kháng khuẩn tốt nhất là 30oC, pH môi trường ban đầu từ 5 - 7 với thể
tích dịch nuôi cấy khoảng 15% trong bình tam giác 250 ml. Môi trường dinh dưỡng phù hợp được xác định có bổ
sung nguồn cacbon là 13 g/l glucose và nguồn ni tơ là 0,6 g/l casein, lúc này chủng xạ khuẩn cho đường kính vòng
kháng khuẩn lần lượt là 26 mm và 23,3 mm.
Từ khóa: Tôm, bệnh, điều kiện nuôi cấy, Streptomyces aureofaciens, Vibrio parahaemolyticus
I. ĐẶT VẤN ĐỀ nhằm xác định các điều kiện nuôi cấy phù hợp cho
Xạ khuẩn được biết đến là nhóm vi sinh vật phân chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 sinh
bố rất rộng rãi trong tự nhiên, chúng có khả năng hoạt tính kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.
sinh ra rất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh
học trong đó có chất kháng sinh. Theo ước tính chi II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Streptomyces tạo ra đến 80% trong số các hợp chất 2.1. Vật liệu nghiên cứu
có hoạt tính sinh học được phát hiện từ vi sinh vật Nghiên cứu này sử dụng chủng xạ khuẩn
(Watve et al., 2001). Đã có rất nhiều các nghiên cứu Streptomyces aureofaciens 25.2 đã được phân lập,
ứng dụng xạ khuẩn trong đời sống và sản xuất, đặc nghiên cứu và định danh lưu trữ tại phòng thí nghiệm
biệt là việc dùng xạ khuẩn để ức chế các tác nhân Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp
gây bệnh khác nhau. Năm 2016, Nguyễn Xuân Việt Nam. Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
Cảnh và cộng tác viên đã phân lập và xác định được gây bệnh trên tôm nhận từ Viện Công nghệ môi
chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 có trường thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio Việt Nam (Nguyễn Xuân Cảnh và ctv., 2016).
parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy trên tôm
(Nguyễn Xuân Cảnh và ctv., 2016), đây là một trong 2.2. Phương pháp nghiên cứu
những tác nhân gây hại đặc biệt nghiêm trọng cho Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn và vi khuẩn được
nghề nuôi tôm trên thế giới cũng như ở Việt Nam sử dụng theo nghiên cứu trước đây (Nguyễn Xuân
(Christopher et al., 2011). Tính từ đầu năm 2011 đến Cảnh và ctv., 2016).
nay, bệnh này đã xuất hiện trên tôm sú ở rất nhiều Chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2
địa phương khác nhau như Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà được nuôi cấy ở các điều kiện khác nhau, thu nhận
Mau, Bến Tre, Trà Vinh… với nguy cơ gây chết 100% dịch nuôi cấy và thử nghiệm tính đối kháng với vi
trong ao nuôi và là mối lo hàng đầu của người nuôi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Xác định các điều
tôm. Do đó việc tìm kiếm các giải pháp vừa an toàn kiện nuôi cấy tối ưu để chủng xạ khuẩn sinh chất
vừa hiệu quả để khống chế sự bùng phát dịch bệnh do kháng khuẩn cao nhất. Các thí nghiệm xác định điều
vi khuẩn này gây ra là hết sức cấp bách đối với ngành kiện nuôi cấy của chủng xạ khuẩn được nghiên cứu
nuôi tôm của Việt Nam hiện nay và trong tương lai bao gồm: Ảnh hưởng của trạng thái nuôi cấy, nhiệt
(Đỗ Thị Thanh Dung và ctv., 2017). Với mục đích sử độ nuôi cấy, pH môi trường nuôi cấy và độ thông khí
dụng chủng xạ khuẩn đã sàng lọc để ứng dụng trong khi nuôi cấy... được thực hiện theo phương pháp đã
sản xuất chế phẩm ức chế sinh trưởng của vi khuẩn mô tả trong nghiên cứu trước đây (Ababutain et al.,
gây bệnh trên tôm, nghiên cứu này được thực hiện 2013; Oskay, 2011).
1
Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
2
Trung tâm Công nghệ sinh học thủy sản, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1
114
- Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(94)/2018
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu kiểm định Vibrio parahaemolyticus sau mỗi khoảng
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm thời gian 3, 4, 5, 6 và 7 ngày. Qua kết quả đo đường
khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp kính vòng kháng khuẩn, nhận thấy rằng ở trạng thái
Việt Nam từ tháng 2/2016 đến tháng 2/2017. nuôi lắc sau 5 ngày nuôi cấy, chủng Streptomyces
aureofaciens 25.2 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN nhất với kích thước vòng kháng khuẩn là 17 mm, sau
3.1. Ảnh hưởng của thời gian và trạng thái nuôi đó có sự biến thiên theo chiều hướng giảm dần và
cấy tới hoạt tính của chủng xạ khuẩn sau 7 ngày nuôi vẫn còn giữ được hoạt tính (Hình 1).
Chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 Từ đó kết luận được rằng, trạng thái nuôi cấy lắc
được nuôi trong môi trường lỏng trong ở nhiệt độ (150 vòng/phút) là trạng thái tốt để chủng xạ khuẩn
30oC trong cả hai trạng thái nuôi tĩnh và nuôi lắc này sinh chất kháng khuẩn, và thời gian nuôi cấy
150 vòng/phút. Sử dụng dịch nuôi cấy để thử khả tối ưu là 5 ngày để sinh tổng hợp chất kháng khuẩn
năng sinh chất kháng khuẩn với chủng vi sinh vật mạnh nhất.
nuôi cấy lắc (150 vòng/phút) nuôi cấy tĩnh
Kích thước vòng kháng khuẩn (mm)
Thời gian nuôi cấy (ngày)
Hình 1. Ảnh hưởng của thời gian và trạng thái nuôi cấy
đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của chủng Streptomyces aureofaciens 25.2
3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng cho thấy chủng 25.2 có khả năng phát triển và sinh
khuẩn của chủng xạ khuẩn chất kháng khuẩn trong khoảng nhiệt độ từ 25 -
Chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 40oC, tại thời điểm 30oC chủng xạ khuẩn sinh tổng
được nuôi trong môi trường lỏng ở trạng thái lắc 150 hợp chất kháng khuẩn mạnh nhất với đường kính
vòng/phút với các mức nhiệt độ 25 oC, 30 oC, 35oC, vòng kháng khuẩn đạt 17 mm, sau đó hoạt tính giảm
40 oC, 45 oC, 50oC trong 5 ngày. Kết quả nghiên cứu dần ở nhiệt độ cao hơn và mất hẳn ở 50oC (Hình 2).
Hình 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh chất kháng khuẩn
của chủng Streptomyces aureofaciens 25.2
115
- Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(94)/2018
3.3. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng khuẩn sau là 17 mm ở pH = 7; nhưng khi pH môi trường
của chủng xạ khuẩn lớn hơn 8 thì hoạt tính kháng khuẩn giảm dần
Chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 (Hình 3). Tuy nhiên, kết quả cho thấy tại giá trị
được nuôi trong môi trường lỏng, lắc 150 vòng/phút pH = 6 hoạt tính kháng khuẩn lại thấp hơn khi nuôi
ở nhiệt độ 300C với các điều kiện pH ban đầu khác cấy ở pH = 5 và 7, điều này có thể giải thích do sai
nhau từ 3 - 11. Sau 5 ngày nuôi cấy xác định hoạt số trong thí nghiệm hoặc tại giá trị pH này tác động
tính kháng khuẩn với chủng Vibrio parahaemolyticus trực tiếp đến khả năng sinh hoạt tính kháng khuẩn
25.2 bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Kết của chủng xạ khuẩn, điều này sẽ làm rõ trong các
quả thu được cho thấy, trong dải pH từ 4 đến 10 thì nghiên cứu tiếp theo. Tuy nhiên, với kết quả này có
chủng 25.2 đều có thể sinh trưởng và biểu hiện hoạt thể thấy chủng xạ khuẩn 25.2 sinh tổng hợp chất
tính kháng khuẩn tương đối mạnh. Chủng 25.2 sinh kháng khuẩn tốt hơn cả là trong điều kiện pH môi
tổng hợp chất kháng khuẩn đạt cực đại ở pH = 5 với trường hơi axit và trung tính.
đường kính vòng kháng khuẩn là 18 mm; tiếp theo
Hình 3. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh chất kháng khuẩn
của chủng Streptomyces aureofaciens 25.2
3.4. Ảnh hưởng của độ thông khí tới hoạt tính biểu hiện khá mạnh khi nuôi với thể tích dịch nuôi
kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn từ 10 - 20%, hoạt tính tối ưu nhất đạt được ở 15%
Chủng xạ khuẩn nuôi lắc trong bình tam giác thể tích dịch nuôi với đường kính vòng kháng
250 ml ở nhiệt độ 300C với tốc độ 150 vòng/phút và khuẩn là 19 mm; sau đó hoạt tính giảm dần khi
các thể tích dịch nuôi lần lượt là 5, 10, 15, 20, 25, 30, tăng thể tích dịch nuôi (Hình 4). Như vậy trong các
35, 40% thể tích bình. Sau 5 ngày kiểm tra hoạt tính điều kiện khác tối ưu, trong điều kiện phòng thí
kháng khuẩn với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nghiệm để hoạt tính kháng khuẩn cao nhất thì cần
bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Kết quả nuôi với lượng môi trường lên men chiếm 15% thể
nghiên cứu cho thấy hoạt tính của chủng xạ khuẩn tích bình.
Hình 4. Ảnh hưởng của thể tích dịch nuôi đến hoạt tính của chủng Streptomyces aureofaciens 25.2
3.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới hoạt tính maltose, lactose, saccharose với các nồng độ từ
kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn 8 - 13 g/l vào môi trường và nuôi cấy chủng xạ khuẩn
Để khảo sát ảnh hưởng, bổ sung riêng biệt nguồn theo các điều kiện tối ưu đã xác định và kiểm tra
các ngồn cacbon khác nhau gồm tinh bột, glucose, hoạt tính đối kháng. Kết quả cho thấy hoạt tính
116
- Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(94)/2018
kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn không chịu ảnh đó hoạt tính này chịu tác động nhiều khi nuôi xạ
hưởng bởi nguồn đường maltose và ảnh hưởng ít khuẩn trên môi trường có nguồn cacbon là glucose,
bởi nguồn saccharose cũng như tinh bột. Trong khi với nồng độ thích hợp nhất là 13 g/l (Bảng 1).
Bảng 1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng 25.2
Nồng độ Đường kính vòng kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn (mm)
(g/l) Glucose Lactose Maltose Saccharose Tinh bột
8 22,0 ± 0,3 19,1 ± 0,3 18,0 ± 0,1 18,3 ± 0,2 21,0 ± 0,2
9 22,6 ± 0,3 20,0 ± 0,3 18,0 ± 0,1 18,7 ± 0,2 22,5 ± 0,2
10 23,3 ± 0,3 20,3 ± 0,3 18,0 ± 0,1 19,0 ± 0,2 22,9 ± 0,2
11 24,2 ± 0,3 20,7 ± 0,3 18,0 ± 0,1 19,5 ± 0,2 23,3 ± 0,2
12 24,9 ± 0,3 21,0 ± 0,3 18,0 ± 0,1 19,7 ± 0,2 23,5 ± 0,2
13 26,0 ± 0,3 21,2 ± 0,3 18,0 ± 0,1 20,0 ± 0,2 23,8 ± 0,2
3.6. Ảnh hưởng của nguồn ni tơ tới hoạt tính tăng nồng độ các chất nhưng hoạt tính không thay
kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn đổi. Hoạt tính này chịu ảnh hưởng khả nhiều bởi
Chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 hai nguồn ni tơ là casein và ure, khi tăng nồng độ
được nuôi trên môi trường cơ sở có bổ sung các hai nguồn ni tơ này thì hoạt tính cũng tăng lên, với
nguồn ni tơ khác nhau gồm casein, urea, NH4Cl, nguồn ni tơ là ure thì hoạt tính tối đa là 21,5 mm
NH4NO3 (NH4)2SO4 với các nồng độ 0,1 - 0,6 g/l, (0,4 g/l) sau đó sẽ giảm dần khi tăng nồng độ. Trong
sau đó xác định hoạt tính đối kháng. Kết quả nhận khi đó đường kính vòng kháng khuẩn của chủng xạ
cho thấy hoạt tính kháng của chủng xạ khuẩn khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 đạt cực đại là
Streptomyces aureofaciens 25.2 không chịu ảnh 23,3 mm khi sử dụng 0,6 g/l casein.
hưởng của NH4Cl, NH4NO3 và (NH4)2SO4, mặc dù
Bảng 2. Ảnh hưởng của nguồn ni tơ đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng 25.2
Nồng độ Đường kính vòng kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn (mm)
(g/l) Casein Urea NH4Cl NH4NO3 (NH4)2SO4
0,1 18,5 ± 0,2 18,6 ± 0,2 18,0 ± 0,1 18,0 0,1 18,0 ± 0,1
0,2 19,7 ± 0,2 19,7 ± 0,2 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1
0,3 20,5 ± 0,2 21,0 ± 0,2 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1
0,4 22,1 ± 0,2 21,5 ± 0,2 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1
0,5 22,6 ± 0,2 19,7 ± 0,2 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1
0,6 23,3 ± 0,2 18,2 ± 0,2 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1
IV. KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO
Hoạt tính kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Đỗ Thị Thanh Dung, Võ Đình Quang, Phan Thị Phượng
của chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 Dung, 2017. Phân lập và tuyển chọn Lactobacillus
biểu hiện ở ngày nuôi cấy thứ 3 và đạt cực đại sau spp. kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hội
5 ngày nuôi trong điều kiện nuôi lắc 150 vòng/ chứng chết sớm trên tôm tại Sóc Trăng. Tạp chí phát
phút, tại nhiệt độ 30oC và pH5-7 thì chủng Vibrio triển Khoa học và Công nghệ. 20(3): 5-15.
parahaemolyticus 25.2 biểu hiện hoạt tính kháng Nguyễn Xuân Cảnh, Hồ Tú Cường, Nguyễn Thị Định,
khuẩn tốt nhất. Để lượng chất kháng khuẩn sinh Phạm Thị Hiếu, 2016. Nghiên cứu chủng xạ khuẩn có
ra tốt nhất thì thể tích dịch nuôi cần duy trì trong khả năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus gây
khoảng 15% thể tích bình nuôi. Nguồn cacbon và bệnh trên tôm. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt
ni tơ phù hợp cho chủng Vibrio parahaemolyticus Nam, 14(11): 1809-1816.
25.2 sinh chất kháng khuẩn là glucose với nồng độ Ababutain IM, Aziz ZKA, AL-Meshhen NA, 2013.
bổ sung vào môi trường cơ sở là 13 g/l và casein với Optimization of environmental and nutritional
nồng độ 0,6 g/l. conditions to improve growth and antibiotic
117
nguon tai.lieu . vn
