- Trang Chủ
- Ngư nghiệp
- Ảnh hưởng của các liều heat shock protein lên các thông số miễn dịch của tôm sú
Xem mẫu
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LIỀU HEAT SHOCK PROTEIN LÊN CÁC
THÔNG SỐ MIỄN DỊCH CỦA TÔM SÚ
Lê Hồng Phước1*, Nguyễn Hồng Lộc1, Nguyễn Thị Hiền1, Võ Hồng Phượng1
TÓM TẮT
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của các liều khác nhau của protein sốc nhiệt ly
trích từ vi khuẩn (DnaK) lên đáp ứng miễn dịch của tôm sú. Khả năng đáp ứng miễn dịch của tôm được
kiểm tra bằng phản ứng Phenoloxidase thực hiện trên cuvet, so màu bằng quang phổ kế ở bước sóng
492nm và phản ứng định lượng Real-time PCR. DnaK được ly trích từ chủng vi khuẩn E. coli có khả
năng biểu hiện DnaK gắn với hexahistidine sau đó được tinh sạch bằng bộ kít dưới tác dụng của các hạt
từ Dynabead. Lượng DnaK ly trích được kiểm tra bằng phương pháp Bradford. DnaK sau đó được trộn
với dung dịch đệm nạp mẫu và điện di trên bản gel 10% SDS-PAGE. Gel sau khi điện di được nhuộm
với Bio-safe Coomassie stain (phản ứng SDS-PAGE) hoặc chuyển qua màng lai cho phản ứng với kháng
thể đặc hiệu cho DnaK (phản ứng Western Blot). Tôm sú có trọng lượng trung bình 10-12g được tiêm
với các liều khác nhau của DnaK (2, 4, 6, 8, 10 hoặc 15µg/tôm), máu tôm được thu ở các thời điểm 2, 4,
7 và 10 giờ sau khi tiêm DnaK. Biểu hiện của gen prophenoloxidase được kiểm tra bằng phản ứng định
lượng real-time PCR. Tôm được tiêm với 8 hoặc 10 µg DnaK làm tăng biểu hiện của Prophenoloxidase
(proPO) tại thời điểm 2 và 4 giờ sau khi tiêm và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức
khác (p < 0,05). Kết quả này cho phép kết luận DnaK có khả năng điều khiển đáp ứng miễn dịch trên
tôm sú.
Từ khóa: DnaK, tôm sú, HSP70, prophenoloxidase.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiên cứu gần đây cho thấy nhiệt độ gây
Heat shock protein (Protein sốc nhiệt hay sốc không gây chết kích thích sinh ra lượng HSP
Hsp) là loại protein được sinh trong quá trình làm tăng khả năng đáp ứng với hiện tượng nhiễm
sốc do nhiệt hoặc do các yếu tố khác như thay khuẩn của động vật không xương sống (Singh và
đổi đột ngột các yếu tố môi trường sống (pH, Aballay, 2006). Theo Campisi và ctv., (2003), khi
độ mặn,...). Hsp được Ritossa khám phá đầu tiếp xúc với các yếu tố gây sốc mạnh sẽ làm tăng
tiên vào năm 1962 trên ruồi dấm Drosophila cường Hsp72 ở chuột. Đây được xem là một dấu
melanogaster. Tuy nhiên, mãi đến năm 1974 thì hiệu báo động kích thích các phân tử NO hoạt
mới có tên gọi chính thức là Hsp. Theo Lindquist động để chống lại vi khuẩn và làm tăng cường
và Craig (1988), HSP được tìm thấy trên hầu hết khả năng phục hồi từ nhiễm khuẩn.
các cơ thể sinh vật. Hsp chiếm từ 5-10% trên Nghiên cứu trên cá hồi, Sergio và ctv.,
tổng protein của tế bào bình thường và có thể (2007) tìm thấy tiềm năng của Hsp như là kháng
tăng lên gấp 2-3 lần khi gặp phải các yếu tố gây nguyên kích thích sinh miễn dịch. Kết quả kiểm
sốc như nóng, lạnh, thiếu dinh dưỡng, thiếu ôxy tra bằng phản ứng ELISA cho thấy kháng thể
hoặc là nhiễm bệnh (Pockley, 2003). Căn cứ trên trong huyết thanh của cá nhiễm Piscirickettsia
trọng lượng phân tử, HSP được phân làm nhiều salmonis cho phản ứng dương tính với Hsp được
nhóm như Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90,...Một trích từ loài vi khuẩn này. Do đó nhóm nghiên
trong những nhóm Hsp được nghiên cứu nhiều cứu này cho rằng Hsp có thể được sử dụng như
là Hsp70. là vaccine để kích thích sinh kháng thể.
Trung Tâm Quan Trắc Môi Trường & Bệnh Thủy Sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2
*Email: lehongphuoc@yahoo.com
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016 25
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Hsp đã được nghiên cứu ở lĩnh vực bệnh khuẩn (DnaK) lên khả năng đáp ứng miễn dịch
trên đối tượng thủy sản thông qua việc sử dụng của tôm sú
ấu trùng Artemia franciscana nuôi trong điều II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
kiện vô trùng như là một mô hình mẫu để gây NGHIÊN CỨU
bệnh thực nghiệm với vi khuẩn. Quy trình sốc
2.1. Ly trích và tinh sạch DnaK
nhiệt không gây chết nhưng có tác dụng kích
thích sản sinh Hsp70 ở Artemia đã được tối ưu DnaK được ly trích và tinh sạch từ chủng
hóa. Cụ thể là ấu trùng Artemia nuôi ở 28°C vi khuẩn E. coli có khả năng biểu hiện DnaK
khi được gây sốc ở 37°C trong 30 phút sau đó gắn với hexahistidine. Bước đầu tiên của ly
là 6 giờ cho khoảng thời gian hồi phục rồi kiểm trích DnaK là cấy E. coli từ ống giữ giống lên
tra khả năng đề kháng của Artemia đã được gây đĩa thạch Luria-Bertani (LB) và ủ ở 37°C trong
sốc với Vibrio campbellii. Kết quả cho thấy quy 24 giờ sau đó chọn khuẩn lạc và cấy tăng sinh
trình này tăng cường khả năng kháng Vibrios trên môi trường lỏng LB đến pha log (mật độ
gây bệnh trên ấu trùng Artemia được gây sốc quang OD600 nm = 0,4 - 0,6). Việc kích thích sinh
nhiệt. Tỷ lệ sống tăng gấp đôi ở nhóm được gây DnaK protein được thực hiện bằng cách thêm
sốc nhiệt so với nhóm đối chứng chứng tỏ rằng đường L-arabinose (0,5 mg/ml) sau đó tiếp tục
Hsp70 có vai trò bảo vệ Artemia đối với tác ủ ở 37°C trong 4 giờ. Toàn bộ vi khuẩn tăng
nhân gây bệnh (Yeong và ctv., 2007, 2008). sinh được chuyển qua ống falcon vô trùng ly
tâm ở 2.200g trong 15 phút, thu cặn hòa vào
Ảnh hưởng của Hsp70 lên khả năng bảo
dung dịch đệm Phosphate-Buffered Saline 1X
hộ của Artemia đối với Vibrio được thực hiện
(PBS, pH = 7,2, Sigma-Aldrich). Vi khuẩn bị
thông qua việc khảo sát hàm lượng và hoạt động
làm vỡ tế bào và đồng nhất bằng dập mẫu mini
của phenoloxidase (Baruah và ctv., 2010). Kết
beadsbeater (Biospec, USA) rồi ly tâm ở 2.200
quả cho thấy PO sinh ra sau khi cho Artemia
g trong 1 phút ở 4°C, thu dịch nổi để tinh sạch
ăn E. coli siêu tổng hợp Artemia-Hsp70 thấp
DnaK bằng bộ kít dưới tác dụng của các hạt từ
và tương đương với nhóm chỉ cho tiếp xúc với
Dynabeads (Dynabeads® His-Tag Isolation và
Vibrio. Tuy nhiên, việc kết hợp cả 2 yếu tố dẫn
Pull down, Invitrogen). DnaK tinh sạch được
đến việc tăng cường hoạt động PO, kết quả
kiểm tra bằng phương pháp SDS-PAGE và
tương thích với lượng RNA thông tin (bằng kỹ
Western Blot.
thuật RT-PCR). Từ các kết quả này cho thấy hệ
thống miễn dịch có thể trước tiên được hoạt hoá 2.2. Phương pháp xác định hàm lượng
bằng Hsp70, sau đó được kích thích tối đa tại protein
thời điểm tiếp xúc với tác nhân gây bệnh. Điều Xác định hàm lượng protein được thực
này cho thấy khả năng đạt được tình trạng hoạt hiện theo quy trình Quick StartTM Bradford
hóa của hệ miễn dịch có thể tồn tại và là một đặc Protein Assay (BIO-RAD). Máu chứa enzym
điểm quan trọng ở vật nuôi thủy sản. Quy trình phenoloxidase được pha loãng với nước cất,
hoạt hóa hệ thống miễn dịch lần đầu tiên được lấy 100µL máu pha loãng cho vào một cuvet
thực hiện trên động vật nuôi thủy sản cụ thể là 1ml, thêm 1ml dung dịch Bradford, trộn
tôm sú, nếu thành công sẽ có khả năng ứng dụng đều và ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút. Đo OD
cho chương trình chọn giống tôm sú dựa vào bằng pháy quang phổ (Smart SpecTM Plus
tính trạng kháng bệnh. Spectrophotometer) ở bước sóng 595nm. Nồng
Mục đích của nghiên cứu này là kiểm tra độ protein chứa trong mẫu được xác định dựa
ảnh hưởng của protein sốc nhiệt ly trích từ vi theo đường chuẩn y = 0,0299x + 0,0128 được
26 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
xây dựng bởi nhóm tác giả thực hiện dự án 2.3. Phương pháp SDS-PAGE và
về HSP trong đó có nội dung nghiên cứu của Western Blot
bài viết này. Đối với mẫu DnaK được tinh Phương pháp SDS-PAGE được ứng dụng
sạch tiến hành đo hàm lượng protein tương theo Yeong và ctv., (2008) và Baruah và ctv.,
(2010). Toàn bộ quy trình phản ứng SDS-PAGE
tự như trên.
và Western Blot được tóm tắt như sau:
Sau khi nhuộm xong với kháng thể thứ đơn dòng 8E2/2 được điều chế từ chuột kháng
hai, rửa màng lai 2 lần bằng Trissaline và 1 lần lại DnaK với độ pha loãng 1:1000 (Stressgen
bằng 0,1M Trissaline. Cuối cùng nhuộm màng Bioreagents). Kháng thể thứ hai là Horseradish
lai bằng diamino benzidine tetrahydrochloride peroxidase conjugated donkey anti-mouse IgG
dehydrate (DAB) có sự hiện diện của H2O2. với độ pha loãng là 1:2500 (Affinity BioReagents
Ghi chú: Kháng thể thứ nhất là kháng thể Inc., Golden,CO).
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016 27
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
2.4. Phản ứng Phenoloxidase (PO assay) T0646) như là chất xúc tác. 200 µl HLS được
Phản ứng được tham khảo có bổ sung từ ủ với 200 µL 0,1% trypsin trong CAC buffer ở
Ji và ctv., (2009). Trước hết là chuẩn bị dịch nhiệt độ phòng trong 30 phút sau đó thêm 200
chiết từ tế bào máu bị phá vỡ haemocyte lysate µL of L-DOPA 0,3% trong CAC. Mỗi phản ứng
supernatant (HLS). Máu tôm sau khi lấy được được thêm vào 600 µL CAC buffer và trộn đều
ly tâm 800g trong 10 phút ở 4oC. Thu phần cặn sau đó đo OD ở bước sóng 492 nm.
tế bào và rửa bằng dung dịch đệm PBS sau đó 2.5. Phản ứng Realtime-PCR với mồi
hòa với 0,6 ml dung dịch đệm được giữ lạnh proPO
cacodylate-citrate buffer rồi ly tâm lần nữa. Thu Theo Liu và ctv., (2006) có thể sử dụng hai
cặn tế bào và hòa vào 0,6 ml cacodylate (CAC) cặp mồi proPO.Pm và β-actin để xác định biểu
buffer, ly tâm 15.000g trong 20 phút ở 4oC, thu hiện của gen đích proPO và tham chiếu β-actin
dịch nổi chính là HLS. Lượng Phenoloxidase ở tôm sú. Vì vậy, trong phần nghiên cứu này
hoạt hóa trong HLS được xác định bằng chúng tôi phát triển quy trình này nhằm mục
quang phổ kế bằng cách cho L-DOPA (L-3,4- đích lựa chọn quy trình thích hợp hơn cho các
dihydroxyphenylalanine, Sigma,USA) như thí nghiệm tiếp theo. Trình tự mồi được mô tả
là chất nền và trypsin (Sigma, USA, cat. no. chi tiết ở Bảng 1
Bảng 1. Trình tự mồi proPO
Gen Mã số trong ngân hàng gen Trình tự mồi
Prophenoloxidase AF521948 F- CGACTCCTGGATGCCATACAT
(proPO) R- CATCGCGAAGAGGAACTTTGT
AF100986 F- CACCACCGCTGAACGAGAA
β-Actin
R-AAGGGCGACATAGCAAAGTTTC
Thành phần phản ứng realtime PCR: Chu trình nhiệt độ chảy:
2X SYBR Master Mix (Promega) 12,5µl 95oC/ 1 phút
F primer 1µl 55oC/ 1 phút
R primer 1µl Tăng nhiệt độ từ 55oC lên 95oC trong 80
DND/RNA free water 8,5µl bước, mỗi bước tăng 0,5oC trong 10 giây.
cDNA mẫu 2 Tính giá trị ∆CT gen đích = CT mẫu thử -
CT mẫu đối chứng (CT là số chu kỳ mà tại đó
Chu trình nhiệt: tín hiệu huỳnh quang bắt đầu vượt qua giá trị
threshold). Nếu quy trình qPCR có lặp lại thì
50oC/ 2 phút
tính giá trị trung bình ∆CT gen đích. Thực hiện
95oC/10 phút tương tự để được giá trị trung bình ∆CT gen
95oC/15 giây tham chiếu.
35 chu kỳ
60oC/1 phút Tính giá trị ∆∆CT = trung bình ∆CTgen
95 C/5 phút
o đích - trung bình ∆CT gen tham chiếu
Tỉ lệ biểu hiện gen (R) = 2-∆∆CT
28 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
2.6. Bố trí thí nghiệm còn thực hiện phản ứng định lượng RT-PCR từ
Thí nghiệm có 7 nghiệm thức gồm một máu tôm thu được.
nghiệm thức đối chứng và 6 nghiệm thức tiêm III. KẾT QUẢ
với 6 nồng độ Hsp70 (2, 4, 6, 8, 10, 15 µg/0,2
3.1. Ly trích DnaK
ml/tôm). Mỗi nghiệm thức gồm 5 tôm có trọng
lượng trung bình 10-12 g ở mỗi thời điểm thu DnaK được tinh sạch bằng bộ kít dưới tác
mẫu. Thu máu tại 4 thời điểm 2, 4, 7 và 10 dụng của các hạt từ Dynabeads (Dynabeads®
giờ sau khi tiêm DnaK. Thực hiện phản ứng His-Tag Isolation & Pull down, Invitrogen)
phenoloxidase đọc bằng quang phổ kế theo được mô tả cụ thể trong phần phương pháp.
phương pháp trình bày ở phần trên. Ngoài ra
Hình 1. Tinh sạch DnaK bằng các hạt từ Hình 2. Bước cuối cùng của tinh sạch
trong eppendroff (qua lọc và ly tâm)
Xác định hàm lượng protein của DnaK được làm cơ sở cho phản ứng SDS-PAGE và Western
tinh sạch dựa theo quy trình Quick StartTM Blot. Kết quả ly trích và tinh sạch thu được
Bradford Protein Assay (BIO-RAD). Việc định lượng DnaK với nồng độ thông thường từ 1-2
lượng protein trong DnaK được tinh sạch dùng µg/µl.
Hình 3. Chuyển bản gel sau khi điện di SDS- Hình 4. Bản gel sau khi ghép với màng lai
PAGE lên màng lai để thực hiện phản ứng được vào bồn điện di để thực hiện phản ứng
Western Blot Western Blot
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016 29
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Hình 5. Kết quả điện di SDS-PAGE của DnaK được sản sinh từ E. coli (1µg DnaK tinh sạch được
điện di và nhuộm với Commassie Biosafe; M = thang protein) (hình trái). DnaK được xác định
sau khi thực hiện phản ứng Western Blot (hình phải)
3.2. Ảnh hưởng của các liều DnaK lên
đáp ứng miễn dịch của tôm sú
3.2.1. Kết quả phản ứng PO assay khi với quy trình của Baruah và ctv., (2011) với quy
tiêm tôm sú với các liều DnaK khác nhau trình tương tự nhưng trên đối tượng là Artemia.
Kiểm tra phản ứng phenoloxidase bằng Các tác giả này khi thực hiện PO assay đo OD
phản ứng tạo màu đo bằng quang phổ kế ở bước bằng máy đọc ELISA. Tuy nhiên cũng có tác
sóng 492nm. Máu tôm sau khi thu được chứa giả thực hiện phản ứng trên cuvet đơn và đo OD
trong eppendroff và giữ lạnh (Hình 6) sau đó bằng máy quang phổ (Sritunyalucksana và ctv.,
tiến hành ly tâm thu cặn tế bào và thực hiện các
1999; Sung và ctv., 1998) nghiên cứu trên tôm
bước làm vỡ tế bào như mô tả ở phần phương
sú và tôm càng xanh. Về cơ bản PO assay được
pháp. Cuối cùng thực hiện phản ứng PO assay
trong cuvet (Hình 7). Trong nghiên cứu này, thực hiện nhờ L-DOPA và dung dịch đệm (có
PO assay được tham khảo có bổ sung và so sánh thể là đệm citrate hoặc Tris saline buffer).
Hình 6. Máu tôm được thu và chứa trong dung Hình 7. Phản ứng PO assay được thực hiện
dịch kháng đông, giữ lạnh trong cuvet
30 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Ở thời điểm 2 giờ sau khi tiêm DnaK có thức tiêm 10µg DnaK có phenoloxidase tăng ở
sự tăng nhẹ của phenoloxidase ở nghiệm thức cả 2 thời điểm thu mẫu 2 và 4 giờ. Tuy nhiên,
tiêm 8, 10 và 15µg protein, các liều tiêm còn việc tăng giảm phenoloxidase ở các nghiệm
lại có phenoloxidase tăng rất ít và không khác thức chưa có sự khác biệt rõ rệt. Chính vì vậy,
nhiều so với đối chứng (Đồ thị 1). Khuynh phản ứng định lượng bằng realtime PCR cần
hướng này cũng được ghi nhận ở lần thí được thực hiện để xem biến động về mặt định
nghiệm thứ 2 (Đồ thị 2). Ở các thời điểm 7 và lượng ở các nghiệm thức theo các thời gian
10 giờ sau khi tiêm DnaK, hầu hết các nghiệm thu mẫu khác nhau như thế nào (Kết quả được
thức tiêm DnaK có biến động phenoloxidase trình bày ở phần sau).
gần bằng với nghiệm thức đối chứng. Nghiệm
Đồ thị 1. Biến động lượng phenoloxidase sau khi tiêm DnaK liều 2, 4, 6, 8, 10 và 15 µg/tôm
(thí nghiệm 1)
Đồ thị 2. Biến động lượng phenoloxidase sau khi tiêm DnaK liều 2, 4, 6, 8, 10 và 15 µg/tôm
(thí nghiệm 2)
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016 31
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
3.2.2. Kết quả định lượng phenoloxidase thức tiêm 8 và 10 µg DnaK. Sự khác biệt này
bằng RT-PCR trên máu tôm thu sau khi tiêm còn được tìm thấy ở thời điểm 4 giờ. Tuy nhiên
với các liều khác nhau của DnaK ở các thời điểm 7 và 10 giờ không tìm thấy sự
Kết quả ở Đồ thị 3 cho thấy ở thời điểm 2 khác biệt về tỷ lệ biểu hiện mRNA ProPO ở các
giờ sau khi tiêm DnaK có sự gia tăng đáng kể nghiệm thức. Ở lần thí nghiệm thứ hai cũng cho
(gấp 4 lần so với đối chứng) của PO ở nghiệm khuynh hướng tương tự (Đồ thị 4)
Đồ thị 3. Kết quả định lượng PO bằng RT-PCR sau khi tiêm tôm với các liều khác nhau của
DnaK (thí nghiệm 1)
Đồ thị 4. Kết quả định lượng PO bằng RT-PCR sau khi tiêm tôm với các liều khác nhau của
DnaK (thí nghiệm 2)
32 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
IV. THẢO LUẬN cứu này cho thấy rằng Hsp70 có nguồn gốc từ
Hsp70 là một loại protein được nhận định là prokaryotic hay eukaryotic đều là nguồn khơi
thường hiện hữu trong hầu hết các loại tế bào, dậy tác dụng bảo hộ miễn dịch ở Artemia chống
tăng mạnh khi đáp ứng với các điều kiện stress lại tác nhân gây bệnh bằng cách hoạt hóa hệ
hay yếu tố lạ và tôm sú cũng không phải là điều thống ProPO. Đây là một trong những nghiên
ngoại lệ. Ở liều tiêm 8 và 10 μg DnaK đã kích cứu đầu tiên về hoạt động hoạt hóa của Hsp70 ở
thích biểu hiện PO cao gấp 4 lần ở thời điểm động vật không xương sống.
2 giờ sau khi tiêm. Lượng PO vẫn còn cao ở Theo Ryckaert và ctv., (2010) thì Hsp70
nghiệm thức này tại thời điểm 4 giờ nhưng sau tái tổ hợp khi tiêm vào playfish (Xiphophorus
đó giảm đáng kể ở các thời điểm thu mẫu còn maculates) có vai trò kích thích miễn dịch
lại. Có thể là do bản chất DnaK hay đáp ứng kháng lại tác nhân gây bệnh Yersinia ruckeri.
miễn dịch của tôm chỉ biểu hiện và kéo dài trong Tuy nhiên, hiệu quả bảo hộ vẫn chưa so sánh
một khoảng thời gian ngắn. Ở các thời điểm sau được với vaccine.
4 giờ có thể là do sự bình ổn của hệ miễn dịch
Trong nghiên cứu này, các nghiệm thức
nên không thấy tăng giảm PO đáng kể.
tiêm Hsp70 liều 2, 4, 6 µg DnaK hầu như không
Đã có rất nhiều nghiên cứu cho rằng HSP70 có sự khác biệt lớn về phenoloxidase so với
đóng vai trò như yếu tố hoạt hóa hệ miễn dịch nhóm đối chứng ở các thời điểm thu mẫu. Theo
tự nhiên (Pockley, 2003; Tsan, 2004) cụ thể là các nghiên cứu trước đây thì lượng PO sinh ra
kích thích hoạt động của các tế bào trong hệ có liên quan đến chu kỳ lột xác của tôm. Liu và
miễn dịch. Nghiên cứu đầu tiên về ứng dụng ctv., (2004) nghiên cứu trên tôm thẻ chân trắng
HSP70 tái tổ hợp cho thấy HSP70 có khả năng 8,0–14,4 g ở các giai đoạn lột xác khác nhau
kích thích sự sản sinh cytokines như IL-1 hay cho thấy tổng số tế bào máu cao nhất ở giai
TNF-α từ bạch cầu đơn nhân lớn ở người hay đoạn sau lột xác lớp vỏ đã cứng (intermoult)
đại thực bào ở chuột trong điều kiện in vitro nhưng thấp nhất ở giai đoạn vừa sau lột xác.
(Basu và ctv., 2002; Galdiero và ctv., 1997). Hoạt động phenoloxidase cao nhất ở giai đoạn
Prophenoloxidase đóng vai trò quan trọng trong intermoult và thấp nhất ở giai đoạn vừa sau lột
đáp ứng miễn dịch ở giáp xác. Các nghiên cứu xác. Hoạt động thực bào của tôm với Vibrio
cho thấy ProPO có vai trò quan trọng trong cơ alginolyticus giảm một cách đáng kể ở giai
chế miễn dịch chống lại các bệnh nhiễm khuẩn đoạn vừa sau lột xác và giai đoạn tiền lột xác.
hay ký sinh trùng (Cerenius và Söderhäll, 2004). Trong một thí nghiệm khác, khi tiêm tôm thẻ
Hiện tại chưa thấy công bố nghiên cứu về chân trắng ở các giai đoạn lột xác khác nhau
ảnh hưởng của tiêm Hsp70 lên PO trên tôm sú. với 105 CFU V. alginolyticus cho thấy sau 10
Tuy nhiên, ảnh hưởng kết hợp của Hsp70 và vi giờ tiêm cho thấy tỷ lệ chết ở nhóm vừa sau
khuẩn Vibrio campbellii lên PO trên Artemia lột xác cao hơn và có ý nghĩa so với nhóm ở
đã được Baruah và ctv., (2011) nghiên cứu. giai đoạn intermoult. Sau 48-120 giờ theo dõi
Theo nhóm tác giả này khi cho Artemia nuôi cho thấy nhóm tôm ở giai đoạn vừa sau lột
trong điều kiện vô trùng ăn Hsp70 từ Artemia xác có tỷ lệ chết cao nhất và nhóm intermoult
hoặc Hsp70 được kích thích sinh ra từ E. coli cho tỷ lệ chết thấp nhất. Vì vậy để loại trừ khả
tiếp theo đó là gây nhiễm bằng V. campbellii cho năng ảnh hưởng của các giai đoạn lột xác đến
thấy tăng cường hệ thống ProPO được chứng phenoloxidase sau khi tiêm với các liều khác
minh bằng mRNA và ở mức độ protein. Nghiên nhau của DnaK, trong nghiên cứu này chúng
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016 33
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
tôi đã chọn lựa tôm đồng đều về giai đoạn lột (lvHSP70) (lv = left ventricular). Tuy nhiên,
xác trước khi tiến hành thí nghiệm. không phải tất cả các gen điều hòa miễn dịch
Theo Sung (2014) khi cho ấu trùng tôm thẻ đều tăng sau khi tiêm DnaK và chỉ giới hạn ở
chân trắng ăn E. coli YS 2 có khả năng sản sinh một số và ở các điểm thời gian nhất định.
DnaK khi kích thích bằng Arabinose làm tăng V. KẾT LUẬN
cường khả năng đề kháng khi gây nhiễm với Tiêm tôm với 8, 10 µg DnaK làm tăng biểu
V. harveyi. Bằng phương pháp Realtime PCR hiện của proPO tại thời điểm 2 và 4 giờ sau khi
nhóm tác giả này tìm thấy ở nhóm cho ăn E. coli tiêm, điều này được xác định bằng phản ứng
tăng crustin mRNA gấp 7 lần so với nhóm đối định lượng RT-PCR.
chứng. Tuy nhiên nhóm tác giả này không tìm
Kết quả kiểm tra hoạt tính của phenoloxidase
thấy sự khác biệt so với nhóm đối chứng về các
bằng phản ứng Phenoloxidase được thực hiện
chỉ tiêu miễn dịch khác như ProPO, penaeidin,
trên cuvet chưa thấy sự khác biệt lớn về hoạt tính
hemocyanin và peroxinectin.
phenoloxidase khi tiêm tôm với DnaK. Tuy nhiên
Theo kết quả nghiên cứu của Hu và ctv., với kết quả định lượng cho thấy sự khác biệt có ý
(2014) cho thấy DnaK có khả năng kích thích nghĩa thống kê ở một số thời điểm thu mẫu.
hệ thống miễn dịch của tôm thẻ chân trắng.
Sau khi tiêm tôm thẻ chân trắng với DnaK LỜI CÁM ƠN
tinh sạch liều 5 µg/tôm nhóm tác giả này tìm Nghiên cứu này được thực hiện trong nội
thấy có sự tăng có ý nghĩa thống kê đối với chỉ dung chương trình nghiên cứu song phương
tiêu transglutaminases và prophenoloxidases ở Việt Bỉ với kinh phí từ Quỹ phát triển Khoa
tôm thẻ chân trắng tại thời điểm 3 giờ sau khi học và Công nghệ Quốc gia. Nhóm tác giả
tiêm DnaK. Ngoài sự tăng PO còn có sự tăng chân thành cảm ơn sự tài trợ của Quỹ cũng như
giảm của các gen liên quan đến miễn dịch sự giúp đỡ của các giáo sư thuộc Laboratory
trên tôm thẻ chân trắng như Penaeidin (PEN), of Aquaculture & Artemia Reference Center
Transgluminase (TGase-1), endogenous HSP70 (Gent, Belgium).
34 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
TÀI LIỆU THAM KHẢO Ryckaert, J., Pasmans, F., Tobback, E., Duchateau, L.,
Decostere, A., Haesebrouck, F., 2010. Heat shock
Basu, N., Todgham, A.E., Ackerman, P.A., Bibeau,
proteins protect platyfish (Xiphophorus maculatus)
M.R., Nakano, K., Schulte, P.M., Iwama, G.K.,
from Yersinia ruckeri induced mortality. Fish &
2002. Heat shock protein genes and their functional
Shellfish Immunology 28: 228–231.
significance in fish. Gene 295: 173–183.
Sergio, H. M., Pablo, C., Marcela, Z., Jorge, O.,
Baruah, K., Ranjan, J., Sorgeloos, P. and Bossier, P.,
Fernando, G., Patricio, C., and Vitalia, H., 2007.
2010. Efficacy of heterologous and homologous
Immunological characterization of a bacterial
heat shock protein 70s as protective agents to
protein isolated from salmonid fish naturally
Artemia franciscana challenged with Vibrio
infected with Piscirickettsia salmonis. Vaccine
campbellii. Fish & Shellfish Immunology 29:
25: 2095–2102.
733-739
Singh, V., and Aballay, A., 2006. Heat-shock
Baruah, K., Ranjan, J., Sorgeloos, P., Macrae, T.H. and
transcription factor (HSF)-1 pathway required for
Bossier, P., 2011. Primming the prophenoloxidase
Caenorhabditis elegans immunity. Proceedings
system of Artemia Franciscana by heat shock
of the National Academy of Sciences USA 103:
proteins protects against Vibrio campbellii
13092-13097.
challenge. Fish & Shellfish Immunology
31(1):134-41 Sritunyalucksana, K., sithisarn, P., withayachumnarnkul,
B., and flegel, T.W., 1999. Activation of
Cerenius, L., Soderhall, K., 2004. The prophenoloxidase-
prophenoloxidase, agglutinin and antibacterial
activating system in invertebrates. Immunology
activity in haemolymph of the black tiger prawn,
Review 198: 116–126.
Penaeus monodon, by immunostimulants. Fish &
Galdiero, M., de l’Ero, G.C., Marcatili, A., 1997. Shellfish Immunology 9: 21–30.
Cytokine and adhesion molecule expression in
Sung, H.H., Chang, H.J., Her, C.H., Chang, J.C.,
human monocytes and endothelial cells stimulated
Song, Y.L., 1998. Phenoloxidase activity of
with bacterial heat shock proteins. Infecion and
hemocytes derived from Penaeus monodon
Immunity 65 (2): 699-707
and Macrobrachium rosenbergii. Journal of
Hu, B., Phuoc, L.H., Sorgeloos, P., Bossier, P., 2014. Invertebrate Pathology 71(1): 26-33.
Bacterial HSP70 (DnaK) is an efficient immune
Sung, Y.Y., 2014. Heat Shock Proteins: An Alternative
stimulator in Litopenaeus vannamei. Aquaculture,
to Control Disease in Aquatic Organism. Journal
418–419, 87–93.
of Marine Science: Research & Development
Ji, P-F., Yao, C-L., Wang, Z-Y., 2009. Immune response 4:e126. doi: 10.4172/2155-9910.1000e126.
and gene expression in shrimp (Litopenaeus
Tsan, M.F., 2004. Cytokine function of heat-shock
vannamei) hemocytes and hepatopancreas against
proteins. AJP: Cell Physiology, 286, 739-744.
some pathogen-associated molecular patterns.
Fish & Shellfish Immunology 27: 563-570 Yeong, Y.S., Van Damme, E. J.M., Sorgeloos, P., and
Bossier, P., 2007. Non-lethal heat shock protect
Lindquist, S., and Craig, E. A., 1988. The heat shock
gnotobiotic Artemia franciscana larvae against
proteins. Annual Review Genetic 22: 631-637.
virulent Vibrios. Fish & Shellfish Immunology
Liu, C-H., Yeh, S-T., Cheng, S-Y., and Chen, J-C., 22: 318-326.
2004. The immune response of the white shrimp
Yeong, Y. S., Pineda, C., MacRae, T. H., Sorgeloos,
Litopenaeus vannamei and its susceptibility to
P., and Bossier, P., 2008. Exposure of gnotobiotic
Vibrio infection in relation with the moult cycle.
Artemia franciscana larvae to abiotic stress
Fish & Shellfish Immunology 16: 151–161
promotes heat shock protein 70 synthesis
Liu, C.H., Yeh, S.P., Kuo, C.M., Cheng, W., Chou, and enhances resistance to pathogenic Vibrio
C.H., 2006. The effect of sodium alginate on campbellii. Cell Stress Chaperones 13(1): 59-66.
the immune response of tiger shrimp via dietary
Yeong, Y.S, Ashame, M.S., Chen, S., MacRae, T.H.,
administration: activity and gene transcription.
Sorgeloos, P. and Bossier, P., 2009. Feeding
Fish & Shellfish Immunology 21:442-253.
Artemia franciscana (Kellogg) larvae with
Pockley, A. G., 2003. Heat shock proteins as regulators bacterial heat shock protein, protects from Vibrio
of the immune response. The Lancet 362: 469- campbellii infection. Journal of Fish Diseases 32
476. (8): 675-685.
Pockley, A.G., 2005. Heat shock proteins as regulators
of the immune response. The Lancet 362: 469–476.
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016 35
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
EFFECT OF DIFFERENT DOSE OF HEAT SHOCK PROTEINS ON IMMUNE
PARAMETERS OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon)
Le Hong Phuoc1*, Nguyen Hong Loc1, Nguyen Thi Hien1, Vo Hong Phuong1
ABSTRACT
This study was conducted to evaluate the effect of different doses of bacterial heat shock protein
(DnaK) on immune response of black tiger shrimp (Penaeus monodon). Shrimp’s immune
response was tested by carrying out phenoloxidase reaction in cuvet, then measuring OD492nm
by photospectrometer and quantification of mRNA by Real-time PCR. DnaK was extracted from
E. coli strain overexpressing DnaK with a hexahistidine-tag. After extraction DnaK was purified
by Dynabead manegtic beads. The concentration of purified recombinant DnaK was determined
by Bradford assay. DnaK sample was then combined with loading buffer and electrophoresed in
10% SDS-PAGE gels. Gels were either stained with Bio-safe Coomassie stain (SDS-PAGE) or
transferred to polyvinylidene fluoride membranes for antibody probing (Western Blot). The juvenile
P. monodon shrimp (mean body weight = 10-12g) were injected with DnaK at a dose of 2, 4, 6, 8, 10
or 15 µg shrimp-1. Haemolymph were collected at 2, 4, 7, and 10 hours post DnaK injection. The
expression of prophenoloxidases gene was monitored via quantitative RT-PCR. Shrimps injected
with 8 or 10 µg DnaK resulted in significantly increase in PO at 2 and 4 hours post injection
compared to other treatments (p < 0.05). This result suggests that DnaK is able to modulate immune
responses in P. monodon.
Keywords: DnaK, shrimp, prophenoloxidase, HSP70.
Người phản biện: TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh
Ngày nhận bài: 18/11/2015
Ngày thông qua phản biện: 18/12/2015
Ngày duyệt đăng: 25/12/2015
1. Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2.
* Email: lehongphuoc@yahoo.com
36 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
nguon tai.lieu . vn