Xem mẫu
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ
AXÍT BÉO TRONG DẦU HẠT MƠ (PRUNUS ARMENIACA)
BẰNG SẮC KÍ KHÍ
Vũ Bình Dương*
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng các axít béo trong dầu hạt mơ
bằng phương pháp sắc ký khí. Đối tượng: dầu hạt mơ. Phương pháp: xác định điều kiện sắc ký
để định lượng đồng thời các axít béo trong dầu hạt mơ. Thẩm định phương pháp theo hướng
dẫn của Dược điển Việt Nam IV, ICH và USP-34. Kết quả: đã xác định được điều kiện sắc ký
thích hợp định lượng đồng thời các axít béo trong dầu hạt mơ gồm: cột ZB-Wax column
(30 m × 0,25 mm, film thickness 0,25 µm) với khí mang là nitơ, tốc độ pha động 1,0 ml/phút sử
dụng detector ion hóa ngọn lửa (FID). Phương pháp được thẩm định đáp ứng các yêu cầu về
tính tương thích hệ thống, chọn lọc đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng (LOQ),
giới hạn phát hiện (LOD), độ đúng, độ chính xác. Kết luận: đã xây dựng và thẩm định được
phương pháp định lượng các axít béo trong dầu hạt mơ bằng phương pháp sắc ký khí.
Phương pháp có thể áp dụng để kiểm nghiệm chất lượng dầu hạt mơ.
* Từ khóa: Dầu hạt mơ; Sắc ký khí; Axít béo.
Simultaneous Quantification of some Fatty Acid in Prunus Armeniaca
using Gas Chromatography
Summary
Purposes: Establishment and validation of quantification of fatty acid constituents in Prunus
armeniaca kernels oil using gas chromatographic - Flame ionization detector (GC-FID).
Objectives: Prunus armeniaca kernels oil. Methods: Validation of quantitative method follows
th
Guideline of Vietnamese Pharmacopoeia edition 4 , ICH (International Conferences of
Harmonisation) and USP-34. Results: Chromatographic condition was identified including
column as ZB-Wax column (30 m × 0.25 mm, film thickness 0.25 µm), carry gas as nitrogen
with flow rate of 1.0 ml/min. The signals picks was determinated on FID detector. This method
was validated releaving that it was ensured of suitability of system, accuracy, precision (inter
and extra-day), selectibility, curve calibration, LOD and LOQ. Conclusions: A quantitative
method of fatty acids from Prunus armeniaca kernels oil was established and validated
completely. It can be applied to quality control of Prunus armeniaca kernels oil.
* Key words: Prunus armeniaca; Gas chromatography; Fatty acid.
* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com)
Ngày nhận bài: 22/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 09/02/2015
Ngày bài báo được đăng: 26/02/2015
123
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hạt mơ (Prunus armeniaca) là một loại
nguyên liệu có giá trị kinh tế cao trong
công nghệ thực phẩm và mỹ phẩm.
Những thập niên gần đây, hạt mơ còn
được sử dụng trong sản xuất nhiên liệu
sinh học (biodiesel) [3, 4]. Với thành phần
chính là các axít béo gồm oleic, linoleic,
linolenic, palmitic, arachidonic và behenic,
dầu hạt mơ có tác dụng giữ ẩm, làm mềm
da, chống viêm rất tốt cho da [3]. Vùng
Tây Bắc nước ta với khí hậu đặc thù có
khả năng phát triển thành các vùng
chuyên canh trồng mơ có tiềm năng
mang lại nguồn nguyên liệu dồi dào. Tuy
nhiên, trong nước chưa có nghiên cứu
nào về đánh giá thành phần axít béo
trong dầu hạt mơ để đưa ra các luận cứ
khoa học cho đánh giá chất lượng dầu
mơ sản xuất trong nước. Vì vậy, nghiên
cứu nhằm: Xây dựng phương pháp định
lượng axit béo trong dầu hạt mơ để ứng
dụng vào đánh giá chất lượng sản phẩm
trong quá trình sản xuất dầu hạt mơ cũng
như các sản phẩm chứa dầu hạt mơ.
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên
cứu.
- Hạt mơ sau khi thu hái tại tỉnh Sơn
La được sơ chế, loại tạp cơ học, sấy khô
và chiết xuất dầu bằng CO2 lỏng siêu tới
hạn; các chất chuẩn axít béo gồm
palmitic, stearic, oleic, linoleic, linolenic,
arachidic và behedic do Sigma Aldrich
cung cấp (hàm lượng > 99,0%). Dung
môi gồm methanol (MeOH), axit acetic,
acetonitril (ACN), nước cất đạt tiêu chuẩn
124
HPLC. Các hóa chất dung môi khác như
n-hexan, dichloromethan (DCM) aceton,
NaCl, H2SO4… đạt tiêu chuẩn tinh khiết
phân tích (PA). Khí nitơ đạt tiêu chuẩn
sắc ký khí với độ tinh khiết > 99,9%. Các
hóa chất, dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn
phân tích.
- Hệ thống chiết siêu tới hạn SFX
System 2120 (Isco Inc., Lincoln - Mỹ); hệ
thống sắc ký khí (HP 5890 series II,
detector FID) gồm cột ZB-Wax (30 m x
0,25 mm, film thickness 0,25 µm).
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Định lượng đồng thời các axít béo
trong dầu hạt mơ:
- Chuẩn bị mẫu chuẩn: cân chính xác
10,0 mg mỗi chất chuẩn axít béo và hòa
tan trong dung dịch 14% của BF3/MeOH.
Dung dịch này được gia nhiệt ở 1000C
trong 5 phút. Sau đó, làm lạnh và thêm
1 ml nước cất và 2 ml n-hexan, trộn đều
bằng máy lắc xoáy trong 2 phút. Ly tâm
hỗn hợp 3.000 rpm x 15 phút. Bỏ pha
nước, thu lấy pha n-hexan thu được hỗn
hợp chuẩn Stock có nồng độ 5.000 ppm.
Bảo quản hỗn hợp chuẩn ở -200C. Chuẩn
nghiên cứu được pha loãng bằng
n-hexan từ chuẩn stock này.
- Chuẩn bị mẫu thử: khoảng 100,0 mg
dầu hạt mơ được thêm 4 ml n-hexan. Sau
đó, thêm 0,1 ml dung dịch KOH 2N pha
trong MeOH. Trộn đều bằng máy lắc
vortex trong 2 phút, ly tâm ở 3.000 rpm x
15 phút. Pha n-hexan được giữ lại và pha
loãng 4 lần. Lọc qua màng lọc 0,45 µm
trước khi phân tích GC.
- Mẫu trắng: tiến hành như mẫu thử,
chỉ khác không có dầu hạt mơ.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
- Điều kiện sắc ký: hệ thống sắc ký khí
(HP 5890 series II, detector FID) gồm cột
ZB-Wax (30 m x 0,25 mm, film thickness
0,25 µm). Khí mang là nitơ với tốc độ
1,0 ml/phút. Tỷ lệ chia dòng 1:20. Nhiệt
độ injector và detector đặt ở 2500C.
Buồng gia nhiệt ban đầu đặt ở 1600C
tăng lên tới 2000C với tốc độ 100C/phút.
Sau đó nhiệt độ được tăng lên 2400C với
tốc độ 50C/phút. Duy trì nhiệt độ này trong
10 phút.
* Thẩm định phương pháp định lượng
đồng thời các axít béo trong hạt mơ:
Thẩm định phương pháp định lượng
đồng thời các axít béo trong dầu hạt mơ
được thực hiện theo Hướng dẫn của Cục
Quản lý Dược Việt Nam, ICH và Dược
điển Mỹ USP-34 [1, 2, 5, 6].
- Tính tương thích hệ thống: phân tích
5 lần liên tiếp một mẫu hỗn hợp chuẩn có
nồng độ 10 µg/ml mỗi axít béo theo điều
kiện trên. RSD của thời gian lưu và diện
tích pic.
- Tính chọn lọc - đặc hiệu: phân tích
đồng thời mẫu trắng, hỗn hợp chuẩn các
axít béo, mẫu thử dầu hạt mơ trong cùng
điều kiện để đánh giá tính chọn lọc đặc
hiệu của phương pháp.
- Khoảng tuyến tính, giới hạn định
lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD):
chuẩn bị 3 dãy hỗn hợp các chuẩn axít
béo có nồng độ từ 0,1; 1,0; 10,0; 100,0;
1.000,0 µg/ml. Phân tích sắc ký theo điều
kiện đã xác định. Xác định mối quan hệ
tuyến tính giữa nồng độ chuẩn axít béo
và diện tích đáp ứng pic tương ứng.
LOD và LOQ được ngoại suy từ độ
lệch chuẩn của mẫu trắng so với độ dốc
đường tuyến tính. LOD = 3,3 × SD/δ;
LOQ = 10 × SD/δ. Trong đó, δ độ dốc
đường tuyến tính, SD là độ lệch chuẩn
của giao trục tung của đường tuyến tính.
- Độ đúng và độ chính xác: xác định độ
đúng và độ chính xác dựa vào phân tích
mẫu kiểm soát ở các nồng độ khác nhau
trong đường chuẩn: LQC (1,0 µg/ml),
MQC (10,0 µg/ml), HQC (1.000 µg/ml).
Chuẩn bị 3 dãy mẫu kiểm soát.
- Xử lý số liệu: phân tích thống kê trên
phần mềm Microsoft Excel Office 2010 và
Origin Pro 8.0.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Kết quả thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời các axít béo trong
dầu hạt mơ.
Bảng 1: Kết quả đánh giá tính tương thích hệ thống sắc ký (n = 5).
125
AXÍT BÉO
DIỆN TÍCH PIC
(X ± SD)
RSD DIỆN TÍCH
PIC (%)
THỜI GIAN LƯU
(X ± SD)
RSD THỜI GIAN
LƯU (%)
Axít palmitic
3.460,59 ± 5,7
0,16
6,029 ± 0,074
1,23
Axít stearic
2.820,79 ± 4,7
0,17
7,976 ± 0,087
1,09
Axít oleic
2.882,71 ± 6,4
0,22
8,194 ± 0,099
1,21
Axít linoleic
3.382,13 ± 5,2
0,15
8,700 ± 0,089
1,02
Axít linolenic
2.352,18 ± 4,1
0,17
9,433 ± 0,102
1,08
Axít arachidonic
2.598,47 ± 6,9
0,26
10,212 ± 0,088
0,86
Axít behenic
2.274,7 ± 7,4
0,33
12,645 ± 0,092
0,72
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
- Tính tương thích hệ thống:
Kết quả phân tích 5 lần liên tiếp hỗn hợp chuẩn các axít béo ở nồng độ 10 µg/ml
cho thấy: thời gian lưu và diện tích pic của các axít béo phân tích đều có RSD < 2%.
Như vậy, phương pháp phân tích hoàn toàn tương thích với hệ thống sắc ký sử dụng.
- Tính chọn lọc đặc hiệu:
a
b
c
Hình 1: Sắc ký đồ mẫu trắng (a), hỗn hợp chuẩn các axít béo (b), dầu hạt mơ (c).
Kết quả phân tích mẫu trắng, mẫu hỗn hợp chuẩn các axít béo, mẫu thử dầu hạt
mơ cho thấy: tại vị trí xuất hiện pic của các axít béo trên mẫu chuẩn, mẫu trắng không
xuất hiện các pic tương ứng. Đồng thời, sắc ký đồ của mẫu thử dầu hạt mơ cho thấy
xuất hiện các pic có thời gian lưu tương ứng với các pic của các chuẩn axít béo; các
pic này cân đối, sắc nét, tách hoàn toàn khỏi nhau. Phương pháp phân tích đáp ứng
yêu cầu về tính chọn lọc đặc hiệu.
- Khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng:
126
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
Bảng 2: Kết quả xây dựng đường tuyến tính và xác định LOD và LOQ các axít béo
trong dầu chiết siêu tới hạn hạnh nhân và hạt mơ.
AXÍT BÉO
ĐƯỜNG CHUẨN
R
Axít palmitic
Y = 234,20X + 1118,26
Axít stearic
2
LOD (ng/ml)
LOQ (ng/ml)
0,9999
6,23
20,77
Y = 230,70X + 514,98
0,9999
11,15
36,60
Axít oleic
Y = 221,79X + 669,04
0,9998
3,77
11,90
Axít linoleic
Y = 216,47X + 1217,77
0,9998
7,05
21,71
Axít linolenic
Y = 204,41X + 310,87
0,9999
5,58
16,21
Axít
arachidonic
Y = 220,02X + 397,45
0,9999
4,99
15,62
Axít behenic
Y = 209,89X + 175,75
0,9998
9,84
29,34
Phân tích liên tiếp 3 dãy đường chuẩn hỗn hợp các axít béo có nồng độ từ 0,1
µg/ml đến 1.000,0 µg/ml. Đánh giá mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic các
axít béo cho thấy: đường hồi quy là đường thẳng với hệ số tương quan R 2 đều ≈ 1 (>
0,98), đáp ứng yêu cầu của đường chuẩn trong phân tích định lượng. Căn cứ vào độ
lệch chuẩn giao trục tung (intercept) và độ dốc đường tuyến tính, chúng tôi xác định
được LOD và LOQ của các axít béo theo điều kiện sắc ký này.
Diện tích pic (AU)
2.5x10
2.0x10
1.5x10
1.0x10
5.0x10
acid palmitic
acid stearic
acid oleic
acid linoleic
acid linolenic
acid arachidonic
acid behenic
5
5
5
5
4
0.0
0
200
400
600
800
1000
Nồng độ (µg/ml)
Hình 2: Đường chuẩn thể hiện mối liên hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
của các axít béo.
Độ đúng và độ chính xác được thực hiện dựa vào phân tích 3 mẫu kiểm soát chuẩn
axít béo với các nồng độ khác nhau: LQC (1,0 µg/ml), MQC (10,0 µg/ml); HQC (100,0
µg/ml). Xác định độ đúng là tỷ lệ % giữa nồng độ ngoại suy từ đường chuẩn so với
nồng độ thực tế. Độ chính xác được xác định là độ lệch chuẩn của nồng độ các axít
béo ngoại suy từ đường tuyến tính.
127
nguon tai.lieu . vn
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ
AXÍT BÉO TRONG DẦU HẠT MƠ (PRUNUS ARMENIACA)
BẰNG SẮC KÍ KHÍ
Vũ Bình Dương*
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng các axít béo trong dầu hạt mơ
bằng phương pháp sắc ký khí. Đối tượng: dầu hạt mơ. Phương pháp: xác định điều kiện sắc ký
để định lượng đồng thời các axít béo trong dầu hạt mơ. Thẩm định phương pháp theo hướng
dẫn của Dược điển Việt Nam IV, ICH và USP-34. Kết quả: đã xác định được điều kiện sắc ký
thích hợp định lượng đồng thời các axít béo trong dầu hạt mơ gồm: cột ZB-Wax column
(30 m × 0,25 mm, film thickness 0,25 µm) với khí mang là nitơ, tốc độ pha động 1,0 ml/phút sử
dụng detector ion hóa ngọn lửa (FID). Phương pháp được thẩm định đáp ứng các yêu cầu về
tính tương thích hệ thống, chọn lọc đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng (LOQ),
giới hạn phát hiện (LOD), độ đúng, độ chính xác. Kết luận: đã xây dựng và thẩm định được
phương pháp định lượng các axít béo trong dầu hạt mơ bằng phương pháp sắc ký khí.
Phương pháp có thể áp dụng để kiểm nghiệm chất lượng dầu hạt mơ.
* Từ khóa: Dầu hạt mơ; Sắc ký khí; Axít béo.
Simultaneous Quantification of some Fatty Acid in Prunus Armeniaca
using Gas Chromatography
Summary
Purposes: Establishment and validation of quantification of fatty acid constituents in Prunus
armeniaca kernels oil using gas chromatographic - Flame ionization detector (GC-FID).
Objectives: Prunus armeniaca kernels oil. Methods: Validation of quantitative method follows
th
Guideline of Vietnamese Pharmacopoeia edition 4 , ICH (International Conferences of
Harmonisation) and USP-34. Results: Chromatographic condition was identified including
column as ZB-Wax column (30 m × 0.25 mm, film thickness 0.25 µm), carry gas as nitrogen
with flow rate of 1.0 ml/min. The signals picks was determinated on FID detector. This method
was validated releaving that it was ensured of suitability of system, accuracy, precision (inter
and extra-day), selectibility, curve calibration, LOD and LOQ. Conclusions: A quantitative
method of fatty acids from Prunus armeniaca kernels oil was established and validated
completely. It can be applied to quality control of Prunus armeniaca kernels oil.
* Key words: Prunus armeniaca; Gas chromatography; Fatty acid.
* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com)
Ngày nhận bài: 22/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 09/02/2015
Ngày bài báo được đăng: 26/02/2015
123
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hạt mơ (Prunus armeniaca) là một loại
nguyên liệu có giá trị kinh tế cao trong
công nghệ thực phẩm và mỹ phẩm.
Những thập niên gần đây, hạt mơ còn
được sử dụng trong sản xuất nhiên liệu
sinh học (biodiesel) [3, 4]. Với thành phần
chính là các axít béo gồm oleic, linoleic,
linolenic, palmitic, arachidonic và behenic,
dầu hạt mơ có tác dụng giữ ẩm, làm mềm
da, chống viêm rất tốt cho da [3]. Vùng
Tây Bắc nước ta với khí hậu đặc thù có
khả năng phát triển thành các vùng
chuyên canh trồng mơ có tiềm năng
mang lại nguồn nguyên liệu dồi dào. Tuy
nhiên, trong nước chưa có nghiên cứu
nào về đánh giá thành phần axít béo
trong dầu hạt mơ để đưa ra các luận cứ
khoa học cho đánh giá chất lượng dầu
mơ sản xuất trong nước. Vì vậy, nghiên
cứu nhằm: Xây dựng phương pháp định
lượng axit béo trong dầu hạt mơ để ứng
dụng vào đánh giá chất lượng sản phẩm
trong quá trình sản xuất dầu hạt mơ cũng
như các sản phẩm chứa dầu hạt mơ.
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên
cứu.
- Hạt mơ sau khi thu hái tại tỉnh Sơn
La được sơ chế, loại tạp cơ học, sấy khô
và chiết xuất dầu bằng CO2 lỏng siêu tới
hạn; các chất chuẩn axít béo gồm
palmitic, stearic, oleic, linoleic, linolenic,
arachidic và behedic do Sigma Aldrich
cung cấp (hàm lượng > 99,0%). Dung
môi gồm methanol (MeOH), axit acetic,
acetonitril (ACN), nước cất đạt tiêu chuẩn
124
HPLC. Các hóa chất dung môi khác như
n-hexan, dichloromethan (DCM) aceton,
NaCl, H2SO4… đạt tiêu chuẩn tinh khiết
phân tích (PA). Khí nitơ đạt tiêu chuẩn
sắc ký khí với độ tinh khiết > 99,9%. Các
hóa chất, dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn
phân tích.
- Hệ thống chiết siêu tới hạn SFX
System 2120 (Isco Inc., Lincoln - Mỹ); hệ
thống sắc ký khí (HP 5890 series II,
detector FID) gồm cột ZB-Wax (30 m x
0,25 mm, film thickness 0,25 µm).
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Định lượng đồng thời các axít béo
trong dầu hạt mơ:
- Chuẩn bị mẫu chuẩn: cân chính xác
10,0 mg mỗi chất chuẩn axít béo và hòa
tan trong dung dịch 14% của BF3/MeOH.
Dung dịch này được gia nhiệt ở 1000C
trong 5 phút. Sau đó, làm lạnh và thêm
1 ml nước cất và 2 ml n-hexan, trộn đều
bằng máy lắc xoáy trong 2 phút. Ly tâm
hỗn hợp 3.000 rpm x 15 phút. Bỏ pha
nước, thu lấy pha n-hexan thu được hỗn
hợp chuẩn Stock có nồng độ 5.000 ppm.
Bảo quản hỗn hợp chuẩn ở -200C. Chuẩn
nghiên cứu được pha loãng bằng
n-hexan từ chuẩn stock này.
- Chuẩn bị mẫu thử: khoảng 100,0 mg
dầu hạt mơ được thêm 4 ml n-hexan. Sau
đó, thêm 0,1 ml dung dịch KOH 2N pha
trong MeOH. Trộn đều bằng máy lắc
vortex trong 2 phút, ly tâm ở 3.000 rpm x
15 phút. Pha n-hexan được giữ lại và pha
loãng 4 lần. Lọc qua màng lọc 0,45 µm
trước khi phân tích GC.
- Mẫu trắng: tiến hành như mẫu thử,
chỉ khác không có dầu hạt mơ.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
- Điều kiện sắc ký: hệ thống sắc ký khí
(HP 5890 series II, detector FID) gồm cột
ZB-Wax (30 m x 0,25 mm, film thickness
0,25 µm). Khí mang là nitơ với tốc độ
1,0 ml/phút. Tỷ lệ chia dòng 1:20. Nhiệt
độ injector và detector đặt ở 2500C.
Buồng gia nhiệt ban đầu đặt ở 1600C
tăng lên tới 2000C với tốc độ 100C/phút.
Sau đó nhiệt độ được tăng lên 2400C với
tốc độ 50C/phút. Duy trì nhiệt độ này trong
10 phút.
* Thẩm định phương pháp định lượng
đồng thời các axít béo trong hạt mơ:
Thẩm định phương pháp định lượng
đồng thời các axít béo trong dầu hạt mơ
được thực hiện theo Hướng dẫn của Cục
Quản lý Dược Việt Nam, ICH và Dược
điển Mỹ USP-34 [1, 2, 5, 6].
- Tính tương thích hệ thống: phân tích
5 lần liên tiếp một mẫu hỗn hợp chuẩn có
nồng độ 10 µg/ml mỗi axít béo theo điều
kiện trên. RSD của thời gian lưu và diện
tích pic.
- Tính chọn lọc - đặc hiệu: phân tích
đồng thời mẫu trắng, hỗn hợp chuẩn các
axít béo, mẫu thử dầu hạt mơ trong cùng
điều kiện để đánh giá tính chọn lọc đặc
hiệu của phương pháp.
- Khoảng tuyến tính, giới hạn định
lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD):
chuẩn bị 3 dãy hỗn hợp các chuẩn axít
béo có nồng độ từ 0,1; 1,0; 10,0; 100,0;
1.000,0 µg/ml. Phân tích sắc ký theo điều
kiện đã xác định. Xác định mối quan hệ
tuyến tính giữa nồng độ chuẩn axít béo
và diện tích đáp ứng pic tương ứng.
LOD và LOQ được ngoại suy từ độ
lệch chuẩn của mẫu trắng so với độ dốc
đường tuyến tính. LOD = 3,3 × SD/δ;
LOQ = 10 × SD/δ. Trong đó, δ độ dốc
đường tuyến tính, SD là độ lệch chuẩn
của giao trục tung của đường tuyến tính.
- Độ đúng và độ chính xác: xác định độ
đúng và độ chính xác dựa vào phân tích
mẫu kiểm soát ở các nồng độ khác nhau
trong đường chuẩn: LQC (1,0 µg/ml),
MQC (10,0 µg/ml), HQC (1.000 µg/ml).
Chuẩn bị 3 dãy mẫu kiểm soát.
- Xử lý số liệu: phân tích thống kê trên
phần mềm Microsoft Excel Office 2010 và
Origin Pro 8.0.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Kết quả thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời các axít béo trong
dầu hạt mơ.
Bảng 1: Kết quả đánh giá tính tương thích hệ thống sắc ký (n = 5).
125
AXÍT BÉO
DIỆN TÍCH PIC
(X ± SD)
RSD DIỆN TÍCH
PIC (%)
THỜI GIAN LƯU
(X ± SD)
RSD THỜI GIAN
LƯU (%)
Axít palmitic
3.460,59 ± 5,7
0,16
6,029 ± 0,074
1,23
Axít stearic
2.820,79 ± 4,7
0,17
7,976 ± 0,087
1,09
Axít oleic
2.882,71 ± 6,4
0,22
8,194 ± 0,099
1,21
Axít linoleic
3.382,13 ± 5,2
0,15
8,700 ± 0,089
1,02
Axít linolenic
2.352,18 ± 4,1
0,17
9,433 ± 0,102
1,08
Axít arachidonic
2.598,47 ± 6,9
0,26
10,212 ± 0,088
0,86
Axít behenic
2.274,7 ± 7,4
0,33
12,645 ± 0,092
0,72
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
- Tính tương thích hệ thống:
Kết quả phân tích 5 lần liên tiếp hỗn hợp chuẩn các axít béo ở nồng độ 10 µg/ml
cho thấy: thời gian lưu và diện tích pic của các axít béo phân tích đều có RSD < 2%.
Như vậy, phương pháp phân tích hoàn toàn tương thích với hệ thống sắc ký sử dụng.
- Tính chọn lọc đặc hiệu:
a
b
c
Hình 1: Sắc ký đồ mẫu trắng (a), hỗn hợp chuẩn các axít béo (b), dầu hạt mơ (c).
Kết quả phân tích mẫu trắng, mẫu hỗn hợp chuẩn các axít béo, mẫu thử dầu hạt
mơ cho thấy: tại vị trí xuất hiện pic của các axít béo trên mẫu chuẩn, mẫu trắng không
xuất hiện các pic tương ứng. Đồng thời, sắc ký đồ của mẫu thử dầu hạt mơ cho thấy
xuất hiện các pic có thời gian lưu tương ứng với các pic của các chuẩn axít béo; các
pic này cân đối, sắc nét, tách hoàn toàn khỏi nhau. Phương pháp phân tích đáp ứng
yêu cầu về tính chọn lọc đặc hiệu.
- Khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng:
126
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
Bảng 2: Kết quả xây dựng đường tuyến tính và xác định LOD và LOQ các axít béo
trong dầu chiết siêu tới hạn hạnh nhân và hạt mơ.
AXÍT BÉO
ĐƯỜNG CHUẨN
R
Axít palmitic
Y = 234,20X + 1118,26
Axít stearic
2
LOD (ng/ml)
LOQ (ng/ml)
0,9999
6,23
20,77
Y = 230,70X + 514,98
0,9999
11,15
36,60
Axít oleic
Y = 221,79X + 669,04
0,9998
3,77
11,90
Axít linoleic
Y = 216,47X + 1217,77
0,9998
7,05
21,71
Axít linolenic
Y = 204,41X + 310,87
0,9999
5,58
16,21
Axít
arachidonic
Y = 220,02X + 397,45
0,9999
4,99
15,62
Axít behenic
Y = 209,89X + 175,75
0,9998
9,84
29,34
Phân tích liên tiếp 3 dãy đường chuẩn hỗn hợp các axít béo có nồng độ từ 0,1
µg/ml đến 1.000,0 µg/ml. Đánh giá mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic các
axít béo cho thấy: đường hồi quy là đường thẳng với hệ số tương quan R 2 đều ≈ 1 (>
0,98), đáp ứng yêu cầu của đường chuẩn trong phân tích định lượng. Căn cứ vào độ
lệch chuẩn giao trục tung (intercept) và độ dốc đường tuyến tính, chúng tôi xác định
được LOD và LOQ của các axít béo theo điều kiện sắc ký này.
Diện tích pic (AU)
2.5x10
2.0x10
1.5x10
1.0x10
5.0x10
acid palmitic
acid stearic
acid oleic
acid linoleic
acid linolenic
acid arachidonic
acid behenic
5
5
5
5
4
0.0
0
200
400
600
800
1000
Nồng độ (µg/ml)
Hình 2: Đường chuẩn thể hiện mối liên hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
của các axít béo.
Độ đúng và độ chính xác được thực hiện dựa vào phân tích 3 mẫu kiểm soát chuẩn
axít béo với các nồng độ khác nhau: LQC (1,0 µg/ml), MQC (10,0 µg/ml); HQC (100,0
µg/ml). Xác định độ đúng là tỷ lệ % giữa nồng độ ngoại suy từ đường chuẩn so với
nồng độ thực tế. Độ chính xác được xác định là độ lệch chuẩn của nồng độ các axít
béo ngoại suy từ đường tuyến tính.
127