Xem mẫu
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MICROSATTELITE DNA
TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ
DUCHENNE
Đinh Thuý Linh, Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh, Nguyễn Đức Hinh
Trường Đại học Y Hà Nội
Loạn dưỡng cơ Duchenne là bệnh lý di truyền thần kinh cơ hay gặp nhất trong nhóm bệnh lý loạn
dưỡng cơ do đột biến gen dystrophin trên nhiễm sắc thể X. Chẩn đoán trước sinh các bà mẹ mang thai có
nguy cơ sinh con bị bệnh giúp phát hiện các trường hợp thai mắc loạn dưỡng cơ Duchenne. Ứng dung kỹ
thuật Microsatellite DNA trong chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. 05 thai phụ mang
thai từ 17 - 22 tuần được xác định là người mang gen. Tách chiết DNA từ tế bào ối, máu ngoại vi của
bệnh nhân và thai phụ, hoàn thiện và ứng dụng kỹ thuật Microsatellite - DNA để chẩn đoán trước sinh và
so sánh kết quả với kỹ thuật phát hiện đột biến gen trực tiếp. Kỹ thuật xác định đột biến trực tiếp và kỹ
thuật Microsatellite - DNA có kết quả trùng khớp nhau cho thấy đã hoàn thiện được kỹ thuật Microsatellite
- DNA. 1/5 thai nhi được chẩn đoán mắc bệnh, thai phụ được tư vấn và đình chỉ thai nghén. 4/5 thai nhi
được chẩn đoán bình thường, tiếp tục theo dõi thai.
Từ khoá: loạn dưỡng cơ Duchenne, chẩn đoán trước sinh, Microsatellite DNA
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
cho sản phụ và gia đình, giảm tỉ lệ sinh con
Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) là
mắc bệnh. Trong các kỹ thuật di truyền phân
bệnh lý di truyền thần kinh cơ hay gặp nhất
tử hiện nay đang được áp dụng để phát hiện
trong nhóm bệnh lý loạn dưỡng cơ với tần
đột biến gen dystrophin, kỹ thuật MLPA đã
suất 1/3500 trẻ trai, nguyên nhân là đột biến
bộc lộ những ưu điểm với khả năng khảo sát
gen dystrophin trên nhiễm sắc thể giới tính X.
cả 79 exon của gen dystrophin, phát hiện
Bệnh đặc trưng bởi sự yếu cơ tiến triển, phì
được cả đột biến xóa đoạn và lặp đoạn, chiếm
đại bắp chân, tăng sinh các tổ chức trong cơ
khoảng 60 - 65%, trong thời gian 3 - 7 ngày
và chậm phát triển trí tuệ. Bệnh nhân thường
[4; 5]. Tuy nhiên, còn khoảng 35 - 40% cần
mất khả năng đi ở lứa tuổi 11 - 12 và tử vong
phải áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen 79
ở lứa tuổi 20 do các biến chứng của bệnh
exon để phát hiện đột biến điểm, kỹ thuật giải
[1 - 3].
trình tự gen thường cần nhiều thời gian và giá
Hiện nay vẫn chưa có phương pháp điều
thành cao. Việc chẩn đoán trước sinh thường
trị đặc hiệu, vì vậy sàng lọc người mang gen
được thực hiện bằng kỹ thuật phát hiện đột
bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh loạn
biến trực tiếp trên gen dystrophin dựa vào đột
dưỡng cơ Duchenne vẫn đóng một vai trò
biến chỉ điểm của bệnh nhân [6]. Tuy nhiên,
quan trọng nhằm đưa ra lời khuyên di truyền
trong một số trường hợp không phát hiện thấy
đột biến hoặc việc phát hiện đột biến gặp khó
Địa chỉ liên hệ: Đinh Thúy Linh, Trường Đại học Y Hà Nội
Email: drdinhlinhobgyn@gmail.com
khăn do cấu trúc gen lớn hoặc một số gia đình
bệnh nhân không có điều kiện kinh tế, kỹ thuật
Ngày nhận: 25/12/2017
phân tích gián tiếp có thể được áp dụng dựa
Ngày được chấp thuận: 18/3/2018
vào xác định allele đột biến (Linkage analysis)
TCNCYH 112 (3) - 2018
1
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
với giá thành rẻ hơn và thời gian nhanh chóng
hai chuỗi oligonucleotid lai đặc hiệu với 79
hơn [7] gTrong nghiên cứu này, tiến hành
exon. Kết quả điện di cho 79 đỉnh có kích
hoàn thiện kỹ thuật Microsatellite - DNA và áp
thước tương ứng 79 probe đặc hiệu với 79
dụng kỹ thuật này để chẩn đoán trước sinh
exon:
thông qua việc khuếch đại các vùng trình tự
lặp lại STR (short tandem repeat) và so sánh
với kết quả phát hiện đột biến bằng kỹ thuật
MLPA và giải trình tự gen [8 - 10]. Nghiên cứu
được tiến hành với mục tiêu ứng dụng kỹ
thuật Microsatellite DNA trong chẩn đoán
trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne cho
các thai phụ được xác định là người mang
gen bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng
- Với đột biến xoá đoạn, exon bị xoá đoạn
khi đỉnh exon không phát hiện được.
- Với đột biến lặp đoạn, kết quả được tính
toán dựa vào tỉ lệ RPA (Relative Peak Area)
tương ứng với từng exon so với mẫu chứng
của người bình thường, exon lặp đoạn khi mà
tỉ lệ RPA lớn hơn 1,5.
Quy trình kỹ thuật: cho 5 µl DNA cần phân
tích vào 1 ống PCR, biến tính ở 98oC/5 phút.
Nhiệt độ được chuyển về 2oC trước khi cho 3
µl hỗn hợp chứa các đoạn oligonucleotid của
các probe. Hỗn hợp được ủ ở 60oC/16 giờ, 2
- Nhóm chứng: gồm 5 người nam và 5
đoạn lai của 2 phân tử oligonucleotid sẽ gắn
người nữ bình thường, không có tiền sử gia
với exon đích đặc hiệu ở vị trí sát nhau. Thêm
đình mắc bệnh di truyền.
32 µl hỗn hợp ligase buffer, ủ ở 54oC/15 phút,
- Nhóm nghiên cứu: 5 gia đình của 5 thai
enzym ligase nối 2 đoạn oligonucleotid của
phụ mang thai từ 17 tuần – 22 tuần, có con
probe với nhau. Phản ứng nối chấm dứt khi
trai hoặc anh, em trai mắc bệnh loạn dưỡng
tăng nhiệt độ lên 98oC/5 phút, hỗn hợp được
cơ Duchenne, 5 thai phụ này đã được phân
giữ ở 4oC. Khuếch đại sản phẩm lai: Thêm 10
tích gen và xác đinh là người mang gen
µl sản phẩm lai vào 30 µl hỗn hợp PCR buffer,
dystrophin đột biến giống con trai hoặc anh,
giữ ở 60oC, thêm 10 µl hỗn hợp PCR master,
em trai mình.
thực hiện chu trình nhiệt: [95oC/30 giây,
2. Phương pháp
60oC/30 giây, 72oC/1 phút] x 35 chu kỳ,
72oC/20 phút. Sản phẩm khuếch đại probe
2.1. Chọc hút dịch ối
được điện di mao quản huỳnh quang trên máy
Tiến hành vào tuần thứ 17 - 22 của thai kỳ
giải trình tự để phân tích kết quả.
dưới hướng dẫn của siêu âm, tại Bệnh viện
Phụ sản Trung ương hoặc Bệnh viện Phụ sản
Hà Nội.
2.3. Kỹ thuật Microsatellite DNA
Xác định các marker dị hợp tử và alen
bệnh mà người mẹ có thể truyền cho con
2.2. Xác định đột biến gen gây bệnh
bằng kỹ thuật microsatellite DNA và xác định,
loạn dưỡng cơ Duchenne bằng kỹ thuật
MLPA
kiểu gen và kiểu hình của thai nhi bằng kỹ
Nguyên lý của kỹ thuật là sử dụng 79 đoạn
DNA sử dụng các cặp mồi có gắn huỳnh
dò gen dystrophin. Mỗi DNA lai (probe) gồm
quang để khuếch đại các các vùng trình tự lặp
2
thuật microsatellite DNA. Kỹ thuật microsatellite
TCNCYH 112 (3) - 2018
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
lại này và phân tích kích thước của chúng
bí mật cá nhân trong quá trình nghiên cứu và
thông qua điện di mao quản trên máy giải trình
về kết quả nghiên cứu. Các thông tin về bệnh
tự gen (automated DNA sequencer). Đối với
nhân, người nhà bệnh nhân và kết quả chẩn
gia đình loạn dưỡng cơ Duchenne cần khuếch
đoán hoàn toàn được giữ bí mật, đặc biệt đối
đại 20 vùng trình tự lặp lại đặc hiệu để xác
với thông tin về giới tính của thai nhi.
định ít nhất 2 - 3 marker dị hợp tử trên mẫu
mẹ (informatic marker). Sử dụng các cặp mồi
đã xác định marker dị hợp tử từ đó xác định
kiểu gen và kiểu hình thai nhi.
III. KẾT QUẢ
1. Kết quả xác định đột biến gen
Thành phần của phản ứng: 1X đệm PCR;
dystrophin đối với bệnh nhân loạn dưỡng
cơ Dunchenne
2,5mM dNTP; 0,2µl mồi xuôi và ngược;
Hình ảnh phân tích MLPA tại probe tương
0,5unit Taq polymerase; 20ng DNA và H2O,
ứng với các exon 14 - 43 của mẫu ối cho thấy
tổng thể tích 20µl. Chu kỳ nhiệt phản ứng
cường độ tín hiệu của đỉnh cao hơn nhiều so
với mẫu người bình thường. Sau khi phân
PCR: 94oC/5 phút; {94oC/30 giây, 59oC/60
giây, 72oC/45 giây} x 40 chu kỳ; 72oC/5 phút.
Sản phẩm khuếch đại PCR được điện di trên
hệ thống sequencing - Beckman coulter. Kết
quả
được
phân
tích
bằng
phần
mềm
GeneMapper v3.2 software.
2.4. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối
Nuôi cấy theo phương pháp hở tủ ấm 37°C
với 5% CO2 và 95% không khí cùng nguồn
tích dựa trên RPA ta có tỉ lệ RPA tại các
exon từ 14 đến 43 của bệnh nhân so với
chứng lớn hơn 1,5 trong khi của các exon
khác chỉ giao động xung quanh 1. Như vậy
cho thấy bệnh nhân có đột biến lặp đoạn các
exon từ 14 đến 43.
2. Kết quả xác định marker dị hợp tử,
alen bệnh người mẹ truyền cho con và kết
ẩm. Thời gian trung bình nuôi cấy là từ 7 - 15
quả chẩn đoán trước sinh bệnh loạn
dưỡng cơ Duchenne cho thai nhi bằng kỹ
ngày.
thuật microsatellite DNA
Các tế bào ối thai nhi thu được với số
lượng tương đối sau khi nuôi cấy được tách
DNA theo phương pháp phenol - chloroform
và phân tích gen.
Tế bào ối cũng được sử dụng để nhuộm
băng G và phân tích karyotype của thai.
3. Đạo đức trong nghiên cứu
Những gia đình có bệnh nhân được chẩn
đoán mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne sẽ
được đưa vào nghiên cứu khi đồng ý tự
nguyện tham gia. Gia đình và bệnh nhân sẽ
được tư vấn và giải thích cụ thể về ý nghĩa,
mục đích, qui trình nghiên cứu, quyền được tự
do rút khỏi nghiên cứu, quyền được đảm bảo
TCNCYH 112 (3) - 2018
Loạn dưỡng cơ Duchenne là bệnh lý di
truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X. Nếu người
mẹ là người mang gen bệnh sẽ có khả năng
truyền gen bệnh cho con trai với tỷ lệ 50%.
Để xác định alen đột biến (allele bệnh -Xb),
cần tiến hành kỹ thuật single PCR khuếch đại
20 vùng STR đặc hiệu trên mẫu máu thai phụ
và mẫu máu bệnh nhân loạn dưỡng cơ
Duchenne (là em trai hoặc con trai của thai
phụ), lựa chọn ít nhất 2 marker dị hợp tử:
- Kết quả 2 mẫu có các đỉnh có kích thước
tương đương nhau thể hiện alen đột biến (Xb).
Kết quả 2 mẫu có các đỉnh không tương
đương nhau thể hiện alen bình thường (XB).
3
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Hình 1. Hình ảnh MLPA (A) và kết quả tính toán (Relative Peak Area) bằng phần mềm
coffalyser (B) của mẫu người bình thường và mẫu ối của thai bị bệnh
Hình 2. Kỹ thuật Microsatellite trong chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
Hình 2 là hình ảnh kết quả kỹ thuật Microsatellite ở gia đình bệnh nhân loạn dưỡng cơ
Duchenne 1. 2 marker dị hợp tử được tìm thấy là DSTR 44 và DSTR49.
4
TCNCYH 112 (3) - 2018
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Với marker DSTR 44, ở thai phụ xuất hiện
Với marker DDTR49, đỉnh mang kích
2 đỉnh có kích thước 181bp và 185bp (hình B),
thước 172bp là đỉnh trùng khớp ở mẹ thai
tương ứng với 2 alen nằm trên 2 nhiễm sắc
phụ, thai phụ và em trai thai phụ (bệnh nhân
thể X (XBXb). Ở mẹ thai phụ chỉ xuất hiện 1
loạn dưỡng cơ Duchenne), cho thấy đây cũng
đỉnh có kích thước 180bp cho thấy đây là alen
là đỉnh alen bệnh.
đồng hợp tử. Ở em trai của thai phụ (là bệnh
Phân tích kết quả mẫu ối của thai nhi:
nhân loạn dưỡng cơ Duchenne) cũng chỉ có 1
Marker DSTR44 chỉ xuất hiện 1 đỉnh có kích
đỉnh kích thước 180bp tương ứng với 1 alen
thước 180bp là alen bệnh, marker DSTR49
trên nhiễm sắc thể X (XbY), trùng khớp với
chỉ xuất hiện 1 đỉnh có kích thước 180bp là
kích thước 1 đỉnh ở mẫu mẹ thai phụ và thai
alen bệnh. Kết quả này có thể khẳng định đây
phụ. Từ kết quả hình ảnh của mẹ thai phụ,
là trường hợp thai nam bị bệnh loạn dưỡng
thai phụ và em trai thai phụ cho thấy đỉnh kích
cơ Duchenne. Kết quả nghiên cứu trên 5 gia
thước 180bp là đỉnh alen bệnh.
đình loạn dưỡng cơ Duchenne:
Bảng 1. Kết quả chẩn đoán trước sinh
STT
Mã số
Dạng đột biến
Kết quả chẩn đoán trước sinh
1
DMD10
Xóa đoạn exon 46 - 50
Bình thường
2
DMD11
Xóa đoạn exon 49 - 50
Bình thường
3
DMD13
c.3022A > T (p.Cys1008Stop)
4
DMD15
Xóa đoạn exon 35 - 43
Bình thường
5
DMD 18
Lặp đoạn 19 - 43
Bệnh lý
Bình thường
Kết quả chẩn đoán trước sinh: 1/5 thai nhi được chẩn đoán là thai nhi bệnh lý, 4/5 thai nhi
được chẩn đoán là bình thường. Kết quả này tương đồng với kết quả của kỹ thuật phân tích xác
định đột biến trực tiếp.
Trường hợp thai được chẩn đoán là mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne sau khi được tư vấn
kết quả, bệnh nhân quyết định đình chỉ thai nghén. 4 trường hợp thai bình thường được tư vấn
giữ thai.
IV. BÀN LUẬN
mang gen bệnh, kỹ thuật MLPA ra đời vào
Loạn dưỡng cơ Duchenne là một bệnh có
năm 2002 đã bộc lộ những ưu điểm vượt trội
tỉ lệ mắc cao nhất trong các bệnh lý di truyền
so với kỹ thuật di truyền khác với độ chính xác
thần kinh cơ với bệnh cảnh lâm sàng nặng nề.
cao khi chỉ cần dùng một cặp primer duy nhất
Hiện nay có rất nhiều kỹ thuật sinh học phân
(so với kỹ thuật Multiplex PCR đòi hỏi nhiều
tử được áp dụng để phát hiện các đột biến
cặp primer, dễ thất bại khi điều kiện phản ứng
gen dystrophin. Trong phát hiện người lành
bị thay đổi dù rất nhỏ); khả năng khảo sát cả
TCNCYH 112 (3) - 2018
5
nguon tai.lieu . vn
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MICROSATTELITE DNA
TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ
DUCHENNE
Đinh Thuý Linh, Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh, Nguyễn Đức Hinh
Trường Đại học Y Hà Nội
Loạn dưỡng cơ Duchenne là bệnh lý di truyền thần kinh cơ hay gặp nhất trong nhóm bệnh lý loạn
dưỡng cơ do đột biến gen dystrophin trên nhiễm sắc thể X. Chẩn đoán trước sinh các bà mẹ mang thai có
nguy cơ sinh con bị bệnh giúp phát hiện các trường hợp thai mắc loạn dưỡng cơ Duchenne. Ứng dung kỹ
thuật Microsatellite DNA trong chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. 05 thai phụ mang
thai từ 17 - 22 tuần được xác định là người mang gen. Tách chiết DNA từ tế bào ối, máu ngoại vi của
bệnh nhân và thai phụ, hoàn thiện và ứng dụng kỹ thuật Microsatellite - DNA để chẩn đoán trước sinh và
so sánh kết quả với kỹ thuật phát hiện đột biến gen trực tiếp. Kỹ thuật xác định đột biến trực tiếp và kỹ
thuật Microsatellite - DNA có kết quả trùng khớp nhau cho thấy đã hoàn thiện được kỹ thuật Microsatellite
- DNA. 1/5 thai nhi được chẩn đoán mắc bệnh, thai phụ được tư vấn và đình chỉ thai nghén. 4/5 thai nhi
được chẩn đoán bình thường, tiếp tục theo dõi thai.
Từ khoá: loạn dưỡng cơ Duchenne, chẩn đoán trước sinh, Microsatellite DNA
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
cho sản phụ và gia đình, giảm tỉ lệ sinh con
Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) là
mắc bệnh. Trong các kỹ thuật di truyền phân
bệnh lý di truyền thần kinh cơ hay gặp nhất
tử hiện nay đang được áp dụng để phát hiện
trong nhóm bệnh lý loạn dưỡng cơ với tần
đột biến gen dystrophin, kỹ thuật MLPA đã
suất 1/3500 trẻ trai, nguyên nhân là đột biến
bộc lộ những ưu điểm với khả năng khảo sát
gen dystrophin trên nhiễm sắc thể giới tính X.
cả 79 exon của gen dystrophin, phát hiện
Bệnh đặc trưng bởi sự yếu cơ tiến triển, phì
được cả đột biến xóa đoạn và lặp đoạn, chiếm
đại bắp chân, tăng sinh các tổ chức trong cơ
khoảng 60 - 65%, trong thời gian 3 - 7 ngày
và chậm phát triển trí tuệ. Bệnh nhân thường
[4; 5]. Tuy nhiên, còn khoảng 35 - 40% cần
mất khả năng đi ở lứa tuổi 11 - 12 và tử vong
phải áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen 79
ở lứa tuổi 20 do các biến chứng của bệnh
exon để phát hiện đột biến điểm, kỹ thuật giải
[1 - 3].
trình tự gen thường cần nhiều thời gian và giá
Hiện nay vẫn chưa có phương pháp điều
thành cao. Việc chẩn đoán trước sinh thường
trị đặc hiệu, vì vậy sàng lọc người mang gen
được thực hiện bằng kỹ thuật phát hiện đột
bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh loạn
biến trực tiếp trên gen dystrophin dựa vào đột
dưỡng cơ Duchenne vẫn đóng một vai trò
biến chỉ điểm của bệnh nhân [6]. Tuy nhiên,
quan trọng nhằm đưa ra lời khuyên di truyền
trong một số trường hợp không phát hiện thấy
đột biến hoặc việc phát hiện đột biến gặp khó
Địa chỉ liên hệ: Đinh Thúy Linh, Trường Đại học Y Hà Nội
Email: drdinhlinhobgyn@gmail.com
khăn do cấu trúc gen lớn hoặc một số gia đình
bệnh nhân không có điều kiện kinh tế, kỹ thuật
Ngày nhận: 25/12/2017
phân tích gián tiếp có thể được áp dụng dựa
Ngày được chấp thuận: 18/3/2018
vào xác định allele đột biến (Linkage analysis)
TCNCYH 112 (3) - 2018
1
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
với giá thành rẻ hơn và thời gian nhanh chóng
hai chuỗi oligonucleotid lai đặc hiệu với 79
hơn [7] gTrong nghiên cứu này, tiến hành
exon. Kết quả điện di cho 79 đỉnh có kích
hoàn thiện kỹ thuật Microsatellite - DNA và áp
thước tương ứng 79 probe đặc hiệu với 79
dụng kỹ thuật này để chẩn đoán trước sinh
exon:
thông qua việc khuếch đại các vùng trình tự
lặp lại STR (short tandem repeat) và so sánh
với kết quả phát hiện đột biến bằng kỹ thuật
MLPA và giải trình tự gen [8 - 10]. Nghiên cứu
được tiến hành với mục tiêu ứng dụng kỹ
thuật Microsatellite DNA trong chẩn đoán
trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne cho
các thai phụ được xác định là người mang
gen bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng
- Với đột biến xoá đoạn, exon bị xoá đoạn
khi đỉnh exon không phát hiện được.
- Với đột biến lặp đoạn, kết quả được tính
toán dựa vào tỉ lệ RPA (Relative Peak Area)
tương ứng với từng exon so với mẫu chứng
của người bình thường, exon lặp đoạn khi mà
tỉ lệ RPA lớn hơn 1,5.
Quy trình kỹ thuật: cho 5 µl DNA cần phân
tích vào 1 ống PCR, biến tính ở 98oC/5 phút.
Nhiệt độ được chuyển về 2oC trước khi cho 3
µl hỗn hợp chứa các đoạn oligonucleotid của
các probe. Hỗn hợp được ủ ở 60oC/16 giờ, 2
- Nhóm chứng: gồm 5 người nam và 5
đoạn lai của 2 phân tử oligonucleotid sẽ gắn
người nữ bình thường, không có tiền sử gia
với exon đích đặc hiệu ở vị trí sát nhau. Thêm
đình mắc bệnh di truyền.
32 µl hỗn hợp ligase buffer, ủ ở 54oC/15 phút,
- Nhóm nghiên cứu: 5 gia đình của 5 thai
enzym ligase nối 2 đoạn oligonucleotid của
phụ mang thai từ 17 tuần – 22 tuần, có con
probe với nhau. Phản ứng nối chấm dứt khi
trai hoặc anh, em trai mắc bệnh loạn dưỡng
tăng nhiệt độ lên 98oC/5 phút, hỗn hợp được
cơ Duchenne, 5 thai phụ này đã được phân
giữ ở 4oC. Khuếch đại sản phẩm lai: Thêm 10
tích gen và xác đinh là người mang gen
µl sản phẩm lai vào 30 µl hỗn hợp PCR buffer,
dystrophin đột biến giống con trai hoặc anh,
giữ ở 60oC, thêm 10 µl hỗn hợp PCR master,
em trai mình.
thực hiện chu trình nhiệt: [95oC/30 giây,
2. Phương pháp
60oC/30 giây, 72oC/1 phút] x 35 chu kỳ,
72oC/20 phút. Sản phẩm khuếch đại probe
2.1. Chọc hút dịch ối
được điện di mao quản huỳnh quang trên máy
Tiến hành vào tuần thứ 17 - 22 của thai kỳ
giải trình tự để phân tích kết quả.
dưới hướng dẫn của siêu âm, tại Bệnh viện
Phụ sản Trung ương hoặc Bệnh viện Phụ sản
Hà Nội.
2.3. Kỹ thuật Microsatellite DNA
Xác định các marker dị hợp tử và alen
bệnh mà người mẹ có thể truyền cho con
2.2. Xác định đột biến gen gây bệnh
bằng kỹ thuật microsatellite DNA và xác định,
loạn dưỡng cơ Duchenne bằng kỹ thuật
MLPA
kiểu gen và kiểu hình của thai nhi bằng kỹ
Nguyên lý của kỹ thuật là sử dụng 79 đoạn
DNA sử dụng các cặp mồi có gắn huỳnh
dò gen dystrophin. Mỗi DNA lai (probe) gồm
quang để khuếch đại các các vùng trình tự lặp
2
thuật microsatellite DNA. Kỹ thuật microsatellite
TCNCYH 112 (3) - 2018
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
lại này và phân tích kích thước của chúng
bí mật cá nhân trong quá trình nghiên cứu và
thông qua điện di mao quản trên máy giải trình
về kết quả nghiên cứu. Các thông tin về bệnh
tự gen (automated DNA sequencer). Đối với
nhân, người nhà bệnh nhân và kết quả chẩn
gia đình loạn dưỡng cơ Duchenne cần khuếch
đoán hoàn toàn được giữ bí mật, đặc biệt đối
đại 20 vùng trình tự lặp lại đặc hiệu để xác
với thông tin về giới tính của thai nhi.
định ít nhất 2 - 3 marker dị hợp tử trên mẫu
mẹ (informatic marker). Sử dụng các cặp mồi
đã xác định marker dị hợp tử từ đó xác định
kiểu gen và kiểu hình thai nhi.
III. KẾT QUẢ
1. Kết quả xác định đột biến gen
Thành phần của phản ứng: 1X đệm PCR;
dystrophin đối với bệnh nhân loạn dưỡng
cơ Dunchenne
2,5mM dNTP; 0,2µl mồi xuôi và ngược;
Hình ảnh phân tích MLPA tại probe tương
0,5unit Taq polymerase; 20ng DNA và H2O,
ứng với các exon 14 - 43 của mẫu ối cho thấy
tổng thể tích 20µl. Chu kỳ nhiệt phản ứng
cường độ tín hiệu của đỉnh cao hơn nhiều so
với mẫu người bình thường. Sau khi phân
PCR: 94oC/5 phút; {94oC/30 giây, 59oC/60
giây, 72oC/45 giây} x 40 chu kỳ; 72oC/5 phút.
Sản phẩm khuếch đại PCR được điện di trên
hệ thống sequencing - Beckman coulter. Kết
quả
được
phân
tích
bằng
phần
mềm
GeneMapper v3.2 software.
2.4. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối
Nuôi cấy theo phương pháp hở tủ ấm 37°C
với 5% CO2 và 95% không khí cùng nguồn
tích dựa trên RPA ta có tỉ lệ RPA tại các
exon từ 14 đến 43 của bệnh nhân so với
chứng lớn hơn 1,5 trong khi của các exon
khác chỉ giao động xung quanh 1. Như vậy
cho thấy bệnh nhân có đột biến lặp đoạn các
exon từ 14 đến 43.
2. Kết quả xác định marker dị hợp tử,
alen bệnh người mẹ truyền cho con và kết
ẩm. Thời gian trung bình nuôi cấy là từ 7 - 15
quả chẩn đoán trước sinh bệnh loạn
dưỡng cơ Duchenne cho thai nhi bằng kỹ
ngày.
thuật microsatellite DNA
Các tế bào ối thai nhi thu được với số
lượng tương đối sau khi nuôi cấy được tách
DNA theo phương pháp phenol - chloroform
và phân tích gen.
Tế bào ối cũng được sử dụng để nhuộm
băng G và phân tích karyotype của thai.
3. Đạo đức trong nghiên cứu
Những gia đình có bệnh nhân được chẩn
đoán mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne sẽ
được đưa vào nghiên cứu khi đồng ý tự
nguyện tham gia. Gia đình và bệnh nhân sẽ
được tư vấn và giải thích cụ thể về ý nghĩa,
mục đích, qui trình nghiên cứu, quyền được tự
do rút khỏi nghiên cứu, quyền được đảm bảo
TCNCYH 112 (3) - 2018
Loạn dưỡng cơ Duchenne là bệnh lý di
truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X. Nếu người
mẹ là người mang gen bệnh sẽ có khả năng
truyền gen bệnh cho con trai với tỷ lệ 50%.
Để xác định alen đột biến (allele bệnh -Xb),
cần tiến hành kỹ thuật single PCR khuếch đại
20 vùng STR đặc hiệu trên mẫu máu thai phụ
và mẫu máu bệnh nhân loạn dưỡng cơ
Duchenne (là em trai hoặc con trai của thai
phụ), lựa chọn ít nhất 2 marker dị hợp tử:
- Kết quả 2 mẫu có các đỉnh có kích thước
tương đương nhau thể hiện alen đột biến (Xb).
Kết quả 2 mẫu có các đỉnh không tương
đương nhau thể hiện alen bình thường (XB).
3
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Hình 1. Hình ảnh MLPA (A) và kết quả tính toán (Relative Peak Area) bằng phần mềm
coffalyser (B) của mẫu người bình thường và mẫu ối của thai bị bệnh
Hình 2. Kỹ thuật Microsatellite trong chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
Hình 2 là hình ảnh kết quả kỹ thuật Microsatellite ở gia đình bệnh nhân loạn dưỡng cơ
Duchenne 1. 2 marker dị hợp tử được tìm thấy là DSTR 44 và DSTR49.
4
TCNCYH 112 (3) - 2018
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Với marker DSTR 44, ở thai phụ xuất hiện
Với marker DDTR49, đỉnh mang kích
2 đỉnh có kích thước 181bp và 185bp (hình B),
thước 172bp là đỉnh trùng khớp ở mẹ thai
tương ứng với 2 alen nằm trên 2 nhiễm sắc
phụ, thai phụ và em trai thai phụ (bệnh nhân
thể X (XBXb). Ở mẹ thai phụ chỉ xuất hiện 1
loạn dưỡng cơ Duchenne), cho thấy đây cũng
đỉnh có kích thước 180bp cho thấy đây là alen
là đỉnh alen bệnh.
đồng hợp tử. Ở em trai của thai phụ (là bệnh
Phân tích kết quả mẫu ối của thai nhi:
nhân loạn dưỡng cơ Duchenne) cũng chỉ có 1
Marker DSTR44 chỉ xuất hiện 1 đỉnh có kích
đỉnh kích thước 180bp tương ứng với 1 alen
thước 180bp là alen bệnh, marker DSTR49
trên nhiễm sắc thể X (XbY), trùng khớp với
chỉ xuất hiện 1 đỉnh có kích thước 180bp là
kích thước 1 đỉnh ở mẫu mẹ thai phụ và thai
alen bệnh. Kết quả này có thể khẳng định đây
phụ. Từ kết quả hình ảnh của mẹ thai phụ,
là trường hợp thai nam bị bệnh loạn dưỡng
thai phụ và em trai thai phụ cho thấy đỉnh kích
cơ Duchenne. Kết quả nghiên cứu trên 5 gia
thước 180bp là đỉnh alen bệnh.
đình loạn dưỡng cơ Duchenne:
Bảng 1. Kết quả chẩn đoán trước sinh
STT
Mã số
Dạng đột biến
Kết quả chẩn đoán trước sinh
1
DMD10
Xóa đoạn exon 46 - 50
Bình thường
2
DMD11
Xóa đoạn exon 49 - 50
Bình thường
3
DMD13
c.3022A > T (p.Cys1008Stop)
4
DMD15
Xóa đoạn exon 35 - 43
Bình thường
5
DMD 18
Lặp đoạn 19 - 43
Bệnh lý
Bình thường
Kết quả chẩn đoán trước sinh: 1/5 thai nhi được chẩn đoán là thai nhi bệnh lý, 4/5 thai nhi
được chẩn đoán là bình thường. Kết quả này tương đồng với kết quả của kỹ thuật phân tích xác
định đột biến trực tiếp.
Trường hợp thai được chẩn đoán là mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne sau khi được tư vấn
kết quả, bệnh nhân quyết định đình chỉ thai nghén. 4 trường hợp thai bình thường được tư vấn
giữ thai.
IV. BÀN LUẬN
mang gen bệnh, kỹ thuật MLPA ra đời vào
Loạn dưỡng cơ Duchenne là một bệnh có
năm 2002 đã bộc lộ những ưu điểm vượt trội
tỉ lệ mắc cao nhất trong các bệnh lý di truyền
so với kỹ thuật di truyền khác với độ chính xác
thần kinh cơ với bệnh cảnh lâm sàng nặng nề.
cao khi chỉ cần dùng một cặp primer duy nhất
Hiện nay có rất nhiều kỹ thuật sinh học phân
(so với kỹ thuật Multiplex PCR đòi hỏi nhiều
tử được áp dụng để phát hiện các đột biến
cặp primer, dễ thất bại khi điều kiện phản ứng
gen dystrophin. Trong phát hiện người lành
bị thay đổi dù rất nhỏ); khả năng khảo sát cả
TCNCYH 112 (3) - 2018
5