Xem mẫu
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
TINH SẠCH PEPTID NGƯỜI TÁI TỔ HỢP CÓ KHẢ NĂNG THẤM
QUA MÀNG, KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG PROTEIN TRỊ LIỆU
Nguyễn Văn Hạnh
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm KH - CN Việt Nam
Những khiếm khuyết của protein là nguyên nhân của phần lớn các bệnh ở người. Protein trị liệu là liệu
pháp thay thế có hiệu quả cho phần lớn các bệnh liên quan tới quá trình tổng hợp sai protein hoặc ức chế
tiến trình biệt hóa sai của tế bào ung thư. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả tổng hợp các
peptid có khả năng thấm qua màng tế bào (CPP) từ bộ gen người nhằm cung cấp công cụ mới tạo các
protein tái tổ hợp có thể xuyên màng để ứng dụng trong sinh học và y học. Hai CPP mới được chọn từ vùng
chuyển tín hiệu vào nhân của tác nhân phiên mã ở người. Chúng được thử chức năng vận chuyển vào tế
bào Hela và Jurkat trong điều kiện in vitro. Kết quả cho thấy, những protein mới có hiệu quả vận chuyển
tương tự đối TAT-EGFP mặc dù chúng có trình tự acid amin ngắn hơn. Các protein đi vào tế bào chất và
nhân, từ đó giả thiết rằng các protein liên quan nội bào có thể ứng dụng cho mục đích trị liệu.
Từ khóa: CPP, protein tái tổ hợp, protein trị liệu, TAT
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hướng quan trọng nhất của liệu pháp
protein là tạo các protein có chức năng ngăn
chặn sự kích hoạt các gen dẫn đến phát triển
tế bào ung thư. Ngoài ra, protein cũng được
định hướng để kích hoạt các gen sản xuất
các sản phẩm cần thiết như insulin hay làm
tác nhân đáp ứng trong các bệnh nhân thiếu
hụt miễn dịch [1]. Hiện đã có một số thuốc là
protein hay có nguồn gốc từ các protein đã
được thương mại hóa và có mặt trên thị
trường. Theo thông báo gần đây trong
nghiên cứu “phân tích thị trường protein trị
liệu toàn cầu”, thị trường này dự báo sẽ tăng
trung bình 13% trong giai đoạn 2012 - 2014.
Thông báo này cũng tiết lộ lĩnh vực kháng thể
đơn dòng sẽ chiếm ưu thế nhất trong các loại
thuốc. Ttuy nhiên các thuốc trong lĩnh vực
protein cũng hứa hẹn tạo ra thị trường nhiều tỉ
đô la [2].
Địa chỉ liên hệ: Nguyễn Văn Hạnh - Viện Công nghệ Sinh
học - 18 Hoàng Quốc Việt - Hà Nội.
Email: nvhanh@ibt.ac.vn
Ngày nhận: 27/11/2012
Ngày được chấp thuận: 26/4/2013
8
Các peptid có khả năng thấm qua màng tế
bào (cell permeable peptides - CPP) bao gồm
một nhóm các peptid có khả năng thấm qua
màng sinh chất của tế bào sống [3]. Các
nghiên cứu phát triển CPP được tiến hành
sau khám phá ra cơ chế truyền nhiễm của HIV
khi chúng dựa vào protein TAT để thâm nhập
vào tế bào người [4]. Dựa vào phát hiện này,
các CPP mới đã được phát triển là các peptid
có chiều dài 10 - 14 acid amin, giàu arginin và
leucin ở các loài sinh vật hay được tổng hợp
nhân tạo [5]. Đánh giá chức năng của những
CPP này thường dựa vào khả năng vận
chuyển protein từ môi trường ngoài vào trong
tế bào. Tuy nhiên, các peptid ngoài việc chúng
có chức năng vận chuyển protein qua màng,
chúng cũng là các yếu tố ngoại sinh nên
thường gây độc cho các tế bào người. Do
vây, để tăng khả năng ứng dụng trong y học
do tránh được tính độc hại của các peotein
ngoại lai, những peptid có nguồn gốc gần gũi
hoặc tổng hợp từ DNA người sẽ là công cụ tốt
để phát triển các thuốc theo định hướng
protein trị liệu [6].
TCNCYH 82 (2) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Trong nghiên cứu này, nhằm mục tiêu thử
nghiệm khả năng vận chuyển protein của các
peptid có nguồn gốc từ các đoạn gen chuyển
tín hiệu vào nhân tế bào (nuclear localling
signal) ở người thay thế cho các peptid có
nguốc gốc từ virus hay các vi sinh vật khác để
ứng dụng tạo protein trị liệu trong tương lai.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Chuẩn bị protein tái tổ hợp
Protein EGFP tái tổ hợp được tổng hợp và
tinh sạch theo phương pháp của Choi và cộng
sự [7]. Trình tự DNA của TAT và các CPP
khác được nhân lên cùng với gen EGFP (hình
1) trong vector pET28a(+), biểu hiện trong
E. coli BL21 (hình 2).
Hình 1. Sơ đồ cấu tạo thành phần các
protein trong nghiên cứu
Protein được hoạt hóa tổng hợp bằng
IPTG (500 µM), tinh sạch bằng phương pháp
sử dụng cột Niken (Qiagen) gắn kết với đuôi 6
Histidin trong vector pET28a (+). Sau khi tinh
sạch, protein được khử muối bằng cột PD10
(Qiagen), trong môi trường PBS 20% glycerol.
Protein được định lượng, chia nhỏ và bảo
quản ở -20oC cho tới khi sử dụng.
2. Đánh giá khả năng vận chuyển protein trên tế bào Jurket
Phương pháp thử nghiệm chức năng
xuyên màng của protein được thực hiện theo
Gomez và cộng sự [3]. Tế bào lympho T (tế
bào Jurkat, RIKEN) được nuôi trong môi
trường RPMI-1640 có bổ sung 10% FBS, 50
IU/ml penicillin và 50 µg/ml streptomycin. Thu
toàn bộ tế bào sau 2 ngày nuôi, ly tâm 3000
v/p, gieo tế bào theo nồng độ 1,5 triệu tế bào
vào mỗi đĩa nuôi 6 giếng. Protein thử nghiệm
được bổ sung vào các đĩa nuôi đạt nồng độ
5 mM. Nuôi tế bào trong vòng 1 giờ ở 37oC,
độ ẩm bão hòa, 5% CO2. Thu mẫu tế bào đã
xử lý, rửa 2 lần bằng PBS trước khi đo độ
phát xạ huỳnh quang bằng máy FACS
(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).
3. Đánh giá khả năng vận chuyển
protein trên tế bào Hela
Hình 2. Sơ đồ vector biểu hiện các
protein
TCNCYH 82 (2) - 2013
Phương pháp thử nghiệm chức năng
xuyên màng của protein được thực hiện theo
Choi và cộng sự [3]. Tế bào Hela được nuôi
trong môi trường D-MEM (Dulbecco’s
modified Eagle’s medium), bổ sung 10% huyết
thanh bò, trên các phiến kính tròn trong đĩa
nuôi 4 giếng. Sau 2 ngày nuôi, tế bào mọc
chiếm khoảng 60% diện tích phiến kính sẽ tiến
hành thí nghiệm. Quá trình thí nghiệm được
tiến hành theo bước sau: 1) hút toàn bộ môi
trường nuôi cũ, thay bằng 500 ml môi trường
nuôi mới chứa 5 mM protein, nuôi trong 1 giờ
trong tủ nuôi 37oC, độ ẩm bão hòa, 5% CO2.
9
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
2) hút toàn bộ môi trường, rửa 2 lần bằng 500
ml dung dịch PBS, sau đó thêm 500 ml hóa
chất nhuộm nhân Hoechst pha loãng theo tỷ lệ
1/4000 trong PBS. Tế bào được nhuộm trong
30 phút; 3) Tế bào được rửa 2 lần bằng 500
ml dung dịch PBS, sau đó cố định bằng
formaldehyd 10% trong 15 phút. 4) rửa tấm
phiến kính 2 lần bằng nước cất và đặt lên lam
kính để quan sát dưới kính hiển vi huỳnh
quang (Olympus, Nhật Bản).
Hình 3. Hình ảnh điện di gen SDS các sản phẩm protein sau tinh sạch
Khối lượng EGFP (30,55 kDa); TAT-EGFP (30,1 kDa); CPP2-EGFP (29,85 kDa); CPP3EGFP (31,48kDa).
III. KẾT QUẢ
Kết quả tổng hợp các protein tái tổ hợp được trình bày trong hình 3. Kết quả cho thấy, các
protein có độ tinh sạch cao, kích thước từ 29,85 kDa (CPP2-EGFP) đến 31,48 kDa (CPP3EGFP). Hai CPP-EGFP mới có kích thước protein tương tự với TAT-EGFP. Kết quả hấp thụ
protein vào trong tế bào Jurkat đánh giá bằng máy flow cytometric được thể hiện trong hình 4.
a
b
Hình 4. So sánh khả năng vận chuyển protein của peptid mới với TAT
trong vận chuyển protein vào tế bào jurkat
a) với EGFP mức vận chuyển không có sự khác biệt so với đối chứng không tế bào và CPP2 EGFP có mức độ biểu hiện tương đương TAT-EGFP.
b) với EGFP mức vận chuyển không có sự khác biệt so với đối chứng không tế bào và CPP3 EGFP có mức độ biểu hiện tương đương TAT-EGFP.
10
TCNCYH 82 (2) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Với hàm lượng protein 5 mM, ủ trong vòng
1 giờ biểu hiện phát quang của lô xử lý bằng
EGFP là tương đương với lô đối chứng không
xử lý trong khi ở lô xử lý CPP2-EGFP và
CPP3-EGFP có mức độ biểu hiện tương tự
với TAT-EGFP.
Kết quả hấp thụ protein vào trong tế bào
Hela được thể hiện trong hình 5. Hình ảnh
hiển vi cho thấy, hàm lượng protein mới được
hấp thụ vào tế bào là tương đồng với TATEGFP. Các protein CPP-EGFP mới thấm vào
cả tế bào chất và nhân của tế bào. Trong hầu
hết các lô thí nghiệm xử lý 100% tế bào có
hấp thụ protein. Thời gian protein vận chuyển
vào đến nhân tế bào giao động từ 15 đến
30 phút.
Hình 5. Protein biểu hiện trong tế bào Hela
Với bước sóng ánh sáng chuyên dụng cho Hoechst tất cả các lô xử lý đều cho ánh sáng như
nhau trong khi bước sóng cho ánh sáng phù hợp EGFP chỉ có các lô tế bào xử lý CPP - EGFP có
phát quang tương tự TAT - EGFP.
IV. BÀN LUẬN
Cơ chế vận chuyển qua màng của các
peptid đã được nghiên cứu trong suốt thập kỷ
qua. Mục tiêu của hướng nghiên cứu này là
khẳng định khả năng ứng dụng trong trị liệu, vì
trong quá trình xử lý cần tránh những tổn
thương tới các tế bào khỏe mạnh. Gần đây,
những nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ các
con đường vận chuyển qua màng của các
CPP [1]. Từ những kết quả này, những CPP
có khả năng kết hợp với protein trị bệnh mà
có đặc tính phù hợp với từng loại tế bào sẽ
được nghiên cứu phát triển. Các nghiên cứu
đã cho thấy, các đoạn peptid ngắn thuộc đoạn
gen chuyển tín hiệu vào nhân tế bào (nuclear
TCNCYH 82 (2) - 2013
localization signal) trên các protein có hoạt
động dẫn truyền protein qua màng sinh chất
của tế bào sống [7]. Các protein tái tổ hợp
thường được thiết kế để có thể vận chuyển
được EGFP từ môi trường nuôi vào trong các
tế bào, với cấu trúc gắn đầu cuối N của peptid
với đầu cuối C của EGFP (hình 1) [8]. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào đánh
giá khả năng vận chuyển protein của các
peptid được khảo sát thông qua kết quả hình
ảnh thu được của đích đến protein EGFP. Kết
quả đã cho thấy các protein sau khoảng thời
gian nhất định đã khu trú tại vùng nhân của tế
bào (hình 5).
Việc phát triển các CPP mới nhằm ứng
11
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
dụng cho hướng protein trị liệu đã được
nhiều phòng thí nghiêm trên thế giới theo
đuổi. Từ việc thay đổi một vài acid amin trong
trình tự của TAT để tăng tính thấm vào loại tế
bào chuyên biệt [9] hay tạo các CPP tổng hợp
có trình tự toàn arginin [10]. Đáng chú ý, việc
xác định của một nhóm protein trên đó có một
vùng khả năng đảm nhiệm chức năng vượt
qua các màng tế bào một cách thụ động đã
dẫn đến hướng nghiên cứu trong lĩnh vực
đánh giá tính chất thâm nhập vào màng tế bào
của protein [11]. Các CPP mới ngoài việc xác
định có khả năng chuyển qua màng còn phát
triển để đến những loại tế bào hay cơ quan
nhất định [12]. Trong nghiên cứu này của
chúng tôi, tuy khả năng vận chuyển của peptid
mới không cao hơn so với TAT nhưng ưu thế
của peptid mới là đều có nguồn gốc từ DNA
người nên sẽ có khả năng ứng dụng cao hơn
do hạn chế được tính độc và tính kháng miễn
dịch đối với protein lạ của cơ thể.
V. KẾT LUẬN
Nghiên cứu này đã tổng hợp được các
peptid mới có nguồn gốc từ người và có
khả năng vận chuyển qua màng tế bào.
Việc phát triển gắn các peptid này với các
protein định hướng chữa bệnh sẽ được
tiếp tục thực hiện trong các nghiên cứu
tiếp theo.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Stewart K.M., Horton K.L., Kelley S.O.,
(2008). Cell-penetrating peptides as delivery
vehicles for biology and medicine. Org.
Biomol. Chem. 6, 2242 - 2255.
2. Szlachcic A., Zakrzewska M., Otlewski
J., (2011). Longer action means better drug:
Tuning up protein therapeutics. Biotech. Adv.
29, 436 - 441.
3. Gomez J.A., Chen J., Ngo J., et al. (2010).
12
Cell-Penetrating Penta-Peptides (CPP5s):
Measurement of Cell Entry and ProteinTransduction
3594 - 3613.
Activity.
Pharmaceuticals
3,
4. Frankel A.D., Pabo C.O (1988). Cellular
uptake of the tat protein from human
immunodeficiency virus. Cell 55 (6), 1189 - 1193.
5. Torchilin V.P., (2008). Tat peptidemediated
intracellular
delivery
of
pharmaceutical nanocarriers. Adv. Drug Del.
Rev. 60, 548 – 558.
6. Torchilin V.P., (2011). Tumor delivery of
macromolecular drugs based on the EPR
effect. Adv. Drug Del. Rev. 63, 131 – 135.
7. Choi J.M., Ahn M.H., Chae W.J., et al.
(2006). Intranasal delivery of the cytoplasmic
domain of CTLA-4 using a novel protein
transduction
domain
prevents
allergic
inflammation. Nat. med. 12 (5), 574 - 579.
8. Wadia J.S., Stan R.V., Dowdy S.F.,
(2004). Transducible TAT-HA fusogenic
peptide enhances escape of TAT-fusion
proteins after lipid raft macropinocytosis. Nat.
Med. 10 (3), 310 - 315.
9. Lea N.C., Buggins A.G.S., Orr S.J., et
al. (2003). High efficiency protein transduction
of quiescent and proliferating primary
hematopoietic cells. J. Biochem. Biophys.
Methods 55, 251 - 258.
10. Fuchs S.M., Raines R.T., (2005).
Polyarginine as a multifunctional fusion tag.
Protein Sci. 14, 1538 - 1544.
11. Wadia J.S., Dowdy S.F., (2005).
Transmembrane delivery of protein and
peptide drugs by TAT-mediated transduction
in the treatment of cancer. Adv. Drug Del.
Rev. 57, 579 – 596.
12. Foerg C., Merkle H.P., (2008). On the
biomedical promise of cell penetrating
peptides: limits versus prospects. J. Pharm.
Sci. 97 (1), 144 - 162.
TCNCYH 82 (2) - 2013
nguon tai.lieu . vn
TINH SẠCH PEPTID NGƯỜI TÁI TỔ HỢP CÓ KHẢ NĂNG THẤM
QUA MÀNG, KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG PROTEIN TRỊ LIỆU
Nguyễn Văn Hạnh
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm KH - CN Việt Nam
Những khiếm khuyết của protein là nguyên nhân của phần lớn các bệnh ở người. Protein trị liệu là liệu
pháp thay thế có hiệu quả cho phần lớn các bệnh liên quan tới quá trình tổng hợp sai protein hoặc ức chế
tiến trình biệt hóa sai của tế bào ung thư. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả tổng hợp các
peptid có khả năng thấm qua màng tế bào (CPP) từ bộ gen người nhằm cung cấp công cụ mới tạo các
protein tái tổ hợp có thể xuyên màng để ứng dụng trong sinh học và y học. Hai CPP mới được chọn từ vùng
chuyển tín hiệu vào nhân của tác nhân phiên mã ở người. Chúng được thử chức năng vận chuyển vào tế
bào Hela và Jurkat trong điều kiện in vitro. Kết quả cho thấy, những protein mới có hiệu quả vận chuyển
tương tự đối TAT-EGFP mặc dù chúng có trình tự acid amin ngắn hơn. Các protein đi vào tế bào chất và
nhân, từ đó giả thiết rằng các protein liên quan nội bào có thể ứng dụng cho mục đích trị liệu.
Từ khóa: CPP, protein tái tổ hợp, protein trị liệu, TAT
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hướng quan trọng nhất của liệu pháp
protein là tạo các protein có chức năng ngăn
chặn sự kích hoạt các gen dẫn đến phát triển
tế bào ung thư. Ngoài ra, protein cũng được
định hướng để kích hoạt các gen sản xuất
các sản phẩm cần thiết như insulin hay làm
tác nhân đáp ứng trong các bệnh nhân thiếu
hụt miễn dịch [1]. Hiện đã có một số thuốc là
protein hay có nguồn gốc từ các protein đã
được thương mại hóa và có mặt trên thị
trường. Theo thông báo gần đây trong
nghiên cứu “phân tích thị trường protein trị
liệu toàn cầu”, thị trường này dự báo sẽ tăng
trung bình 13% trong giai đoạn 2012 - 2014.
Thông báo này cũng tiết lộ lĩnh vực kháng thể
đơn dòng sẽ chiếm ưu thế nhất trong các loại
thuốc. Ttuy nhiên các thuốc trong lĩnh vực
protein cũng hứa hẹn tạo ra thị trường nhiều tỉ
đô la [2].
Địa chỉ liên hệ: Nguyễn Văn Hạnh - Viện Công nghệ Sinh
học - 18 Hoàng Quốc Việt - Hà Nội.
Email: nvhanh@ibt.ac.vn
Ngày nhận: 27/11/2012
Ngày được chấp thuận: 26/4/2013
8
Các peptid có khả năng thấm qua màng tế
bào (cell permeable peptides - CPP) bao gồm
một nhóm các peptid có khả năng thấm qua
màng sinh chất của tế bào sống [3]. Các
nghiên cứu phát triển CPP được tiến hành
sau khám phá ra cơ chế truyền nhiễm của HIV
khi chúng dựa vào protein TAT để thâm nhập
vào tế bào người [4]. Dựa vào phát hiện này,
các CPP mới đã được phát triển là các peptid
có chiều dài 10 - 14 acid amin, giàu arginin và
leucin ở các loài sinh vật hay được tổng hợp
nhân tạo [5]. Đánh giá chức năng của những
CPP này thường dựa vào khả năng vận
chuyển protein từ môi trường ngoài vào trong
tế bào. Tuy nhiên, các peptid ngoài việc chúng
có chức năng vận chuyển protein qua màng,
chúng cũng là các yếu tố ngoại sinh nên
thường gây độc cho các tế bào người. Do
vây, để tăng khả năng ứng dụng trong y học
do tránh được tính độc hại của các peotein
ngoại lai, những peptid có nguồn gốc gần gũi
hoặc tổng hợp từ DNA người sẽ là công cụ tốt
để phát triển các thuốc theo định hướng
protein trị liệu [6].
TCNCYH 82 (2) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Trong nghiên cứu này, nhằm mục tiêu thử
nghiệm khả năng vận chuyển protein của các
peptid có nguồn gốc từ các đoạn gen chuyển
tín hiệu vào nhân tế bào (nuclear localling
signal) ở người thay thế cho các peptid có
nguốc gốc từ virus hay các vi sinh vật khác để
ứng dụng tạo protein trị liệu trong tương lai.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Chuẩn bị protein tái tổ hợp
Protein EGFP tái tổ hợp được tổng hợp và
tinh sạch theo phương pháp của Choi và cộng
sự [7]. Trình tự DNA của TAT và các CPP
khác được nhân lên cùng với gen EGFP (hình
1) trong vector pET28a(+), biểu hiện trong
E. coli BL21 (hình 2).
Hình 1. Sơ đồ cấu tạo thành phần các
protein trong nghiên cứu
Protein được hoạt hóa tổng hợp bằng
IPTG (500 µM), tinh sạch bằng phương pháp
sử dụng cột Niken (Qiagen) gắn kết với đuôi 6
Histidin trong vector pET28a (+). Sau khi tinh
sạch, protein được khử muối bằng cột PD10
(Qiagen), trong môi trường PBS 20% glycerol.
Protein được định lượng, chia nhỏ và bảo
quản ở -20oC cho tới khi sử dụng.
2. Đánh giá khả năng vận chuyển protein trên tế bào Jurket
Phương pháp thử nghiệm chức năng
xuyên màng của protein được thực hiện theo
Gomez và cộng sự [3]. Tế bào lympho T (tế
bào Jurkat, RIKEN) được nuôi trong môi
trường RPMI-1640 có bổ sung 10% FBS, 50
IU/ml penicillin và 50 µg/ml streptomycin. Thu
toàn bộ tế bào sau 2 ngày nuôi, ly tâm 3000
v/p, gieo tế bào theo nồng độ 1,5 triệu tế bào
vào mỗi đĩa nuôi 6 giếng. Protein thử nghiệm
được bổ sung vào các đĩa nuôi đạt nồng độ
5 mM. Nuôi tế bào trong vòng 1 giờ ở 37oC,
độ ẩm bão hòa, 5% CO2. Thu mẫu tế bào đã
xử lý, rửa 2 lần bằng PBS trước khi đo độ
phát xạ huỳnh quang bằng máy FACS
(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).
3. Đánh giá khả năng vận chuyển
protein trên tế bào Hela
Hình 2. Sơ đồ vector biểu hiện các
protein
TCNCYH 82 (2) - 2013
Phương pháp thử nghiệm chức năng
xuyên màng của protein được thực hiện theo
Choi và cộng sự [3]. Tế bào Hela được nuôi
trong môi trường D-MEM (Dulbecco’s
modified Eagle’s medium), bổ sung 10% huyết
thanh bò, trên các phiến kính tròn trong đĩa
nuôi 4 giếng. Sau 2 ngày nuôi, tế bào mọc
chiếm khoảng 60% diện tích phiến kính sẽ tiến
hành thí nghiệm. Quá trình thí nghiệm được
tiến hành theo bước sau: 1) hút toàn bộ môi
trường nuôi cũ, thay bằng 500 ml môi trường
nuôi mới chứa 5 mM protein, nuôi trong 1 giờ
trong tủ nuôi 37oC, độ ẩm bão hòa, 5% CO2.
9
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
2) hút toàn bộ môi trường, rửa 2 lần bằng 500
ml dung dịch PBS, sau đó thêm 500 ml hóa
chất nhuộm nhân Hoechst pha loãng theo tỷ lệ
1/4000 trong PBS. Tế bào được nhuộm trong
30 phút; 3) Tế bào được rửa 2 lần bằng 500
ml dung dịch PBS, sau đó cố định bằng
formaldehyd 10% trong 15 phút. 4) rửa tấm
phiến kính 2 lần bằng nước cất và đặt lên lam
kính để quan sát dưới kính hiển vi huỳnh
quang (Olympus, Nhật Bản).
Hình 3. Hình ảnh điện di gen SDS các sản phẩm protein sau tinh sạch
Khối lượng EGFP (30,55 kDa); TAT-EGFP (30,1 kDa); CPP2-EGFP (29,85 kDa); CPP3EGFP (31,48kDa).
III. KẾT QUẢ
Kết quả tổng hợp các protein tái tổ hợp được trình bày trong hình 3. Kết quả cho thấy, các
protein có độ tinh sạch cao, kích thước từ 29,85 kDa (CPP2-EGFP) đến 31,48 kDa (CPP3EGFP). Hai CPP-EGFP mới có kích thước protein tương tự với TAT-EGFP. Kết quả hấp thụ
protein vào trong tế bào Jurkat đánh giá bằng máy flow cytometric được thể hiện trong hình 4.
a
b
Hình 4. So sánh khả năng vận chuyển protein của peptid mới với TAT
trong vận chuyển protein vào tế bào jurkat
a) với EGFP mức vận chuyển không có sự khác biệt so với đối chứng không tế bào và CPP2 EGFP có mức độ biểu hiện tương đương TAT-EGFP.
b) với EGFP mức vận chuyển không có sự khác biệt so với đối chứng không tế bào và CPP3 EGFP có mức độ biểu hiện tương đương TAT-EGFP.
10
TCNCYH 82 (2) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Với hàm lượng protein 5 mM, ủ trong vòng
1 giờ biểu hiện phát quang của lô xử lý bằng
EGFP là tương đương với lô đối chứng không
xử lý trong khi ở lô xử lý CPP2-EGFP và
CPP3-EGFP có mức độ biểu hiện tương tự
với TAT-EGFP.
Kết quả hấp thụ protein vào trong tế bào
Hela được thể hiện trong hình 5. Hình ảnh
hiển vi cho thấy, hàm lượng protein mới được
hấp thụ vào tế bào là tương đồng với TATEGFP. Các protein CPP-EGFP mới thấm vào
cả tế bào chất và nhân của tế bào. Trong hầu
hết các lô thí nghiệm xử lý 100% tế bào có
hấp thụ protein. Thời gian protein vận chuyển
vào đến nhân tế bào giao động từ 15 đến
30 phút.
Hình 5. Protein biểu hiện trong tế bào Hela
Với bước sóng ánh sáng chuyên dụng cho Hoechst tất cả các lô xử lý đều cho ánh sáng như
nhau trong khi bước sóng cho ánh sáng phù hợp EGFP chỉ có các lô tế bào xử lý CPP - EGFP có
phát quang tương tự TAT - EGFP.
IV. BÀN LUẬN
Cơ chế vận chuyển qua màng của các
peptid đã được nghiên cứu trong suốt thập kỷ
qua. Mục tiêu của hướng nghiên cứu này là
khẳng định khả năng ứng dụng trong trị liệu, vì
trong quá trình xử lý cần tránh những tổn
thương tới các tế bào khỏe mạnh. Gần đây,
những nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ các
con đường vận chuyển qua màng của các
CPP [1]. Từ những kết quả này, những CPP
có khả năng kết hợp với protein trị bệnh mà
có đặc tính phù hợp với từng loại tế bào sẽ
được nghiên cứu phát triển. Các nghiên cứu
đã cho thấy, các đoạn peptid ngắn thuộc đoạn
gen chuyển tín hiệu vào nhân tế bào (nuclear
TCNCYH 82 (2) - 2013
localization signal) trên các protein có hoạt
động dẫn truyền protein qua màng sinh chất
của tế bào sống [7]. Các protein tái tổ hợp
thường được thiết kế để có thể vận chuyển
được EGFP từ môi trường nuôi vào trong các
tế bào, với cấu trúc gắn đầu cuối N của peptid
với đầu cuối C của EGFP (hình 1) [8]. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào đánh
giá khả năng vận chuyển protein của các
peptid được khảo sát thông qua kết quả hình
ảnh thu được của đích đến protein EGFP. Kết
quả đã cho thấy các protein sau khoảng thời
gian nhất định đã khu trú tại vùng nhân của tế
bào (hình 5).
Việc phát triển các CPP mới nhằm ứng
11
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
dụng cho hướng protein trị liệu đã được
nhiều phòng thí nghiêm trên thế giới theo
đuổi. Từ việc thay đổi một vài acid amin trong
trình tự của TAT để tăng tính thấm vào loại tế
bào chuyên biệt [9] hay tạo các CPP tổng hợp
có trình tự toàn arginin [10]. Đáng chú ý, việc
xác định của một nhóm protein trên đó có một
vùng khả năng đảm nhiệm chức năng vượt
qua các màng tế bào một cách thụ động đã
dẫn đến hướng nghiên cứu trong lĩnh vực
đánh giá tính chất thâm nhập vào màng tế bào
của protein [11]. Các CPP mới ngoài việc xác
định có khả năng chuyển qua màng còn phát
triển để đến những loại tế bào hay cơ quan
nhất định [12]. Trong nghiên cứu này của
chúng tôi, tuy khả năng vận chuyển của peptid
mới không cao hơn so với TAT nhưng ưu thế
của peptid mới là đều có nguồn gốc từ DNA
người nên sẽ có khả năng ứng dụng cao hơn
do hạn chế được tính độc và tính kháng miễn
dịch đối với protein lạ của cơ thể.
V. KẾT LUẬN
Nghiên cứu này đã tổng hợp được các
peptid mới có nguồn gốc từ người và có
khả năng vận chuyển qua màng tế bào.
Việc phát triển gắn các peptid này với các
protein định hướng chữa bệnh sẽ được
tiếp tục thực hiện trong các nghiên cứu
tiếp theo.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Stewart K.M., Horton K.L., Kelley S.O.,
(2008). Cell-penetrating peptides as delivery
vehicles for biology and medicine. Org.
Biomol. Chem. 6, 2242 - 2255.
2. Szlachcic A., Zakrzewska M., Otlewski
J., (2011). Longer action means better drug:
Tuning up protein therapeutics. Biotech. Adv.
29, 436 - 441.
3. Gomez J.A., Chen J., Ngo J., et al. (2010).
12
Cell-Penetrating Penta-Peptides (CPP5s):
Measurement of Cell Entry and ProteinTransduction
3594 - 3613.
Activity.
Pharmaceuticals
3,
4. Frankel A.D., Pabo C.O (1988). Cellular
uptake of the tat protein from human
immunodeficiency virus. Cell 55 (6), 1189 - 1193.
5. Torchilin V.P., (2008). Tat peptidemediated
intracellular
delivery
of
pharmaceutical nanocarriers. Adv. Drug Del.
Rev. 60, 548 – 558.
6. Torchilin V.P., (2011). Tumor delivery of
macromolecular drugs based on the EPR
effect. Adv. Drug Del. Rev. 63, 131 – 135.
7. Choi J.M., Ahn M.H., Chae W.J., et al.
(2006). Intranasal delivery of the cytoplasmic
domain of CTLA-4 using a novel protein
transduction
domain
prevents
allergic
inflammation. Nat. med. 12 (5), 574 - 579.
8. Wadia J.S., Stan R.V., Dowdy S.F.,
(2004). Transducible TAT-HA fusogenic
peptide enhances escape of TAT-fusion
proteins after lipid raft macropinocytosis. Nat.
Med. 10 (3), 310 - 315.
9. Lea N.C., Buggins A.G.S., Orr S.J., et
al. (2003). High efficiency protein transduction
of quiescent and proliferating primary
hematopoietic cells. J. Biochem. Biophys.
Methods 55, 251 - 258.
10. Fuchs S.M., Raines R.T., (2005).
Polyarginine as a multifunctional fusion tag.
Protein Sci. 14, 1538 - 1544.
11. Wadia J.S., Dowdy S.F., (2005).
Transmembrane delivery of protein and
peptide drugs by TAT-mediated transduction
in the treatment of cancer. Adv. Drug Del.
Rev. 57, 579 – 596.
12. Foerg C., Merkle H.P., (2008). On the
biomedical promise of cell penetrating
peptides: limits versus prospects. J. Pharm.
Sci. 97 (1), 144 - 162.
TCNCYH 82 (2) - 2013