Xem mẫu
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017
SO SÁNH HIỆU QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN KỊ KHÍ CỦA
BỐN PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI KHUẨN KỊ KHÍ
TẠI BỆNH VIỆN HỮU NGHỊ VIỆT ĐỨC.
Nguyễn Thị Vân*; Nguyễn Thái Sơn**; Kiều Chí Thành**
TÓM TẮT
Mục tiêu: so sánh hiệu quả phân lập vi khuẩn (VK) kị khí của 4 phương pháp nuôi cấy VK kị
khí hiện nay tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức. Phương pháp: nghiên cứu mô tả tiến cứu. Kết
quả: tỷ lệ mọc VK kị khí bằng phương pháp sử dụng hệ thống Whitley anaerobic Workstations
26,1%, phương pháp tạo khí trường bằng phản ứng hóa học 14,2%, phương pháp dùng túi
Genbag anaer 13,0% và phương pháp dùng hệ thống ANOXOMAT 12,1%. Tỷ lệ mọc VK kị khí
của phương pháp sử dụng hệ thống Whitley anaerobic Workstations cao hơn 2,14 lần phương
pháp tạo khí trường bằng phản ứng hóa học (OR: 2,14; 95%CI: 1,37 - 3,32); 2,36 lần phương
pháp dùng túi Genbag anaer (OR: 2,36; 95%CI: 1,50 - 3,72) và 2,56 lần phương pháp dùng hệ
thống ANOXOMAT (OR: 2,56; 95%CI: 1,62 - 4,07). Kết luận: hệ thống Whitley anaerobic
Workstations cho tỷ lệ phân lập VK kị khí cao hơn so với ba phương pháp còn lại.
* Từ khóa: Vi khuẩn kị khí; Phân lập; Phương pháp nuôi cấy.
Comparison of the Efficiency of Four Current Anaerobic Culture
Methods in Vietduc Hospital
Summary
Objectives: To compare the efficiency of 4 different current methods on anaerobic culture in
Vietduc Hospital. Methods: Prospective descriptive study. Results: The anaerobic growth rate of
Whitley anaerobic Workstations method was 26.1%; the method creating atmosphere by
chemical reactions was 14.2%; the method using Genbag anaer was 13.0% and the method
using ANOXOMAT system was 12.1%. The microbial growth rate of Whitley anaerobic
Workstations method was 2.14 times more than that of the chemical reaction-based method
(OR: 2.14; 95%CI: 1.37 - 3.32); 2.36 fold higher than Genbag anaer method (OR: 2.36; 95%CI:
1.50 - 3.72) and 2.56 times greater than ANOXOMAT method (OR: 2.56; 95%CI: 1.62 - 4.07).
Conclusion: Whitley anaerobic Workstations method has the highest anaerobic growth rate in
comparison with the other three methods.
* Key words: Anaerobe; Isolation; Culture method.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, việc nuôi cấy VK kị khí trong
các phòng xét nghiệm còn hạn chế do chi
phí cao, kỹ thuật phức tạp. Với tỷ lệ nhiễm
khuẩn không nhỏ do VK kị khí, hậu quả
nghiêm trọng và tình hình kháng kháng
sinh ngày càng gia tăng, nuôi cấy VK kị
khí phải là một xét nghiệm thường quy
trong phòng xét nghiệm vi sinh [3, 6].
* Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức
** Bệnh viện Quân y 103
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Vân (dchkc76v@gmail.com)
Ngày nhận bài: 10/02/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 24/04/2017
Ngày bài báo được đăng: 22/05/2017
130
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017
Hiện nay, 4 phương pháp tạo khí trường
kị khí được ứng dụng tại Bệnh viện Hữu
Nghị Việt Đức: phương pháp tạo khí
trường bằng phản ứng hóa học; phương
pháp dùng túi Genbag anaer (BioMerieux),
phương pháp tạo khí trường bằng hệ
thống ANOXOMAT (Đức) và gần đây là
phương pháp sử dụng hệ thống Whitley
anaerobic Workstations (Anh) khép kín.
Các cơ sở mới bắt đầu tìm hiểu hoặc
chuẩn bị triển khai nuôi cấy VK kị khí
thường lúng túng trong việc chọn phương
pháp và thiết bị phù hợp. Để góp phần hỗ
trợ và cung cấp thông tin cho các cơ sở
triển khai nuôi cấy VK kị khí, chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài này với mục
tiêu: So sánh hiệu quả phân lập VK kị khí
của 4 phương pháp nuôi cấy VK kị khí
đang được ứng dụng tại Bệnh viện Hữu
nghị Việt Đức.
- Các chất hóa học cần thiết để tạo khí
trường: 5 - 10% CO2, 5 - 10% H2, 80% N2
như: axít sulphuric, axít citric, kẽm, nước
và chất xúc tác.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
+ Vận chuyển bệnh phẩm: bệnh phẩm
sau khi lấy được chuyển ngay đến khoa
vi sinh sớm nhất có thể, trong vòng 60
phút nếu vận chuyển bệnh phẩm bằng xi
lanh, nếu vận chuyển bệnh phẩm trong
môi trường chuyên dụng như BAYK, thời
gian vận chuyển không quá 24 giờ.
1. Đối tượng nghiên cứu.
Các loại bệnh phẩm mủ lấy tại ổ áp xe
gan, não, thận... và bệnh phẩm dịch ổ
bụng do nhiễm trùng ổ bụng có biến
chứng như: viêm phúc mạc ruột thừa,
thấm mật phúc mạc.
2. Vật tư và trang thiết bị nghiên
cứu.
- Môi trường nuôi cấy: canh thang,
thạch máu, thạch Mac-conkey (Hãng
Oxoid), thạch máu Columbia, vitamin K,
hemin (Hãng BD).
- Hệ thống ANOXOMAT (Đức) và bình
nuôi cấy kị khí đồng bộ với hệ thống này.
- Hệ thống Whitley anaerobic Workstations;
model: DG250 (Anh Quốc).
- Bình khí trộn gồm: 10% CO2, 10% H2,
80% N2.
3. Phương pháp nghiên cứu.
Nghiên cứu mô tả tiến cứu.
* Kỹ thuật tiến hành:
- Lấy và vận chuyển bệnh phẩm:
+ Mẫu bệnh phẩm: mủ hoặc dịch ổ
bụng.
+ Lượng bệnh phẩm: yêu cầu lấy ít
nhất 2 ml (tốt nhất 5 - 10 ml) bệnh phẩm.
- Các bước tiến hành nuôi cấy định
danh tìm VK kị khí:
+ Nuôi cấy mẫu bệnh phẩm mủ, dịch ổ
bụng đồng thời bằng 4 phương pháp
khác nhau. Sau đó tiến hành phân lập,
định danh và thử nghiệm kháng sinh đồ
với các loại VK kị khí phân lập được:
- Các kít định danh: RAPID ID 32 A
cùng phần mềm đọc định danh VK và túi
Genbag anaer (Hãng Bio-Merieux).
. Phương pháp 1: nuôi cấy bằng bình
MART dung tích 5 lít, có nắp và gioăng
cao su để vặn chặt nắp, tạo khí trường
bằng các phản ứng hóa học [1, 2, 3, 4].
- Khoanh giấy và thanh giấy kháng
sinh (Hãng Bio-Merieux).
. Phương pháp 2: nuôi cấy dùng túi
Genbag anaer (Hãng Bio Merieux). Chất
131
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017
liệu túi là plastic, dung tích 1 lít, có ghim
chặt miệng túi, khí trường được tạo ra
bằng túi hóa chất đóng sẵn [3, 5].
của bình được tạo ra bởi các phản ứng
hóa học.
. Phương pháp 3: nuôi cấy bằng bình
MART, khí trường từ bình khí trộn (10%
CO2, 10% H2 và 80% N2) đưa vào bình
nuôi cấy qua hệ thống ANOXOMAT (Đức)
[2, 5].
- Cho ngay 1 đĩa thạch kị khí vào bình
nuôi cấy MART: khí trường kị khí của
bình được đưa vào từ bình khí trộn bởi
hệ thống ANOXOMAT.
. Phương pháp 4: nuôi cấy bằng hệ
thống Whitley anaerobic Workstations,
model: DG250 (Anh Quốc); tủ ấm kín,
dung tích 79,6 lít, có vỏ chất liệu acrylic
trong suốt, qua găng tay có thể thao tác
xử lý mẫu ngay trong tủ, khí trường được
đưa vào từ bình khí trộn (10% CO2, 10%
H2 và 80% N2) bằng hệ thống tự động. Có
bảng điện từ theo dõi nhiệt độ và nồng độ
khí trong tủ [3, 4, 5, 6].
* Các bước nuôi cấy VK kị khí:
- 1 đĩa thạch kị khí cho vào túi genbag.
- 1 đĩa thạch kị khí cho vào tủ cấy kị
khí Whitley anaerobic Workstations.
- Nuôi cấy VK ái khí đồng thời: ủ ấm
đĩa thạch máu thường, đĩa thạch
Macconkey trong khí trường bình thường
của tủ ấm 370C.
- Định danh VK kị khí tìm được: sau
khi đã xác định được VK kị khí, tiến hành
định danh VK đó bằng kít định danh ID 32
A (Hãng Bio Merieux).
* Phân tích và xử lý dữ liệu:
- Bệnh phẩm được cấy đồng thời 4 đĩa
thạch kị khí (trong 1 lít thạch Columbia có
50 ml máu cừu, 2,5 mg haemin và 1 mg
vitamin K) theo phương pháp phân vùng
và 1 đĩa thạch máu thường, 1 đĩa thạch
Maccokey [5].
Nhập và làm sạch dữ liệu bằng phần
mềm Epidata 3.1, sau đó xử lý trên phần
mềm STATA 12.0. Trình bày thống kê mô
tả dưới dạng tần số (n) và tỷ lệ phần trăm
(%). Phân tích hồi quy logistic đơn biến
để xác định mối tương quan giữa các
phương pháp nuôi cấy.
- Cho ngay 1 đĩa thạch kị khí vào
bình nuôi cấy MART: khí trường kị khí
Các phép kiểm định, so sánh có ý
nghĩa thống kê khi p < 0,05.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
Bảng 1: Phân bố bệnh phẩm mủ và dịch khi sử dụng 4 phương pháp nuôi cấy.
Bệnh phẩm
Phương pháp 1
Phương pháp 2
Phương pháp 3
Phương pháp 4
n
%
n
%
n
%
n
%
Mủ các loại
188
55,5
188
55,5
188
55,5
118
49,6
Dịch các loại
151
44,5
151
44,5
151
44,5
120
50,4
339
100
339
100
339
100
238
100
Tổng
Tỷ lệ mẫu bệnh phẩm mủ, dịch ở các phương pháp 1, 2, 3 (phương pháp tạo khí
trường bằng phản ứng hóa học, phương pháp sử dụng túi genbag và phương pháp sử
dụng hệ thống ANOXOMAT) như nhau. Phương pháp 4 (sử dụng hệ thống Whitley
132
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017
anaerobic Workstations), số bệnh phẩm mủ và dịch được nuôi cấy ít hơn. Sự khác
nhau này là do nghiên cứu được chia 2 giai đoạn, kinh phí không đủ để thực hiện song
song 4 phương pháp. Tuy nhiên, đối tượng nghiên cứu là VK kị khí có mặt trong các
mẫu bệnh phẩm mủ và dịch, nên không có sự thay đổi đáng kể về tính chất sinh học
của VK sau 1 năm. Nghiên cứu đánh giá hiệu quả nuôi cấy VK kị khí khi sử dụng các
phương pháp khác nhau bằng những yếu tố tỷ lệ mọc VK và tỷ lệ các loại VK kị khí
mọc được.
Bảng 2: So sánh khả năng mọc VK kị khí của 4 phương pháp.
Bệnh phẩm
Bệnh phẩm mọc VK kị khí
Bệnh phẩm không mọc VK kị khí
Số lượng
Tỷ lệ (%)
Số lượng
Tỷ lệ (%)
Phương pháp 4
62
26,1
176
73,9
Phương pháp 1
48
14,2
291
85,8
Phương pháp 4
62
26,1
176
73,9
Phương pháp 2
44
13,0
295
87,0
Phương pháp 4
62
26,1
176
73,9
Phương pháp 3
41
12,1
298
87,9
So sánh phương pháp 4 (hệ thống
Whitley anaerobic Workstations) với từng
phương pháp còn lại thấy: tỷ lệ mọc VK kị
khí ở phương pháp 4 là 26,1%. Trong đó,
tỷ lệ mọc ở phương pháp 1, 2, 3 (phương
pháp tạo khí trường bằng phản ứng hóa
học, phương pháp sử dụng túi genbag và
phương pháp sử dụng hệ thống
ANOXOMAT) lần lượt là 14,2%; 13,0% và
12,1%. So sánh tỷ lệ mọc giữa phương
pháp 4 và 3 với hai phương pháp còn lại
thấy, tỷ lệ mọc VK kị khí ở phương pháp
4 cao hơn 2,14 lần so với phương pháp 1
OR
(95%CI)
2,14
1,37 - 3,32
2,36
1,50 - 3,72
2,56
1,62 - 4,07
(OR: 2,14; 95%CI: 1,37 - 3,32). Tỷ lệ mọc
VK kị khí ở phương pháp 4 cao hơn 2,36
lần tỷ lệ mọc VK kị khí ở phương pháp 2
(OR: 2,36; 95%CI: 1,50 - 3,72); tỷ lệ mọc
VK kị khí ở phương pháp 4 cao hơn 2,56
lần tỷ lệ mọc VK kị khí ở phương pháp 3
(OR: 2,56; 95%CI: 1,62 - 4,07). Khác biệt
có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Như vậy, tổng số mẫu nuôi cấy bằng
phương pháp 4 (hệ thống Whitley
anaerobic Workstations) ít hơn phương
pháp 1, 2, 3 nhưng tỷ lệ mẫu bệnh phẩm
mọc VK kị khí lại cao hơn.
Bảng 3: Các chủng VK kị khí phân lập được từ các bệnh phẩm mủ, dịch.
VK kị khí
Phương pháp 1
Phương pháp 2
Phương pháp 3
Phương pháp 4
n
%
n
%
n
%
n
%
Bacteroides spp
24
48,0
22
47,8
19
44,2
25
30,1
Prevotella spp
5
10,0
5
10,9
7
16,3
14
16,9
Clostridium
3
6,0
2
4,3
2
4,7
11
13,3
Gemella
2
4,0
2
4,3
2
4,7
3
3,6
133
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017
Fusobacterium spp
0
0
0
0
0
0
2
2,4
Propionibacterium
11
22,0
10
21,7
9
20,9
8
9,7
Actinomyces
1
2,0
1
2,2
1
2,3
3
3,6
Micromonas micros
1
2,0
1
2,2
1
2,3
9
10,8
Các loại khác
3
6,0
3
6,5
2
4,7
8
9,6
50
100
46
100
43
100
83
100
Tổng
Bacteroides spp là VK kị khí được phân lập nhiều nhất và chiếm tỷ lệ cao. Kết quả
này phù hợp với những nghiên cứu đã công bố trên thế giới [3] và trong nước [2].
Không có sự khác biệt về tỷ lệ B. fragilis mọc được bằng các phương pháp sử dụng
khác nhau, nhưng có sự khác biệt về chủng loại VK kị khí khác như: Prevotella spp,
Clostridium, Fusobacterium spp, Micromonas micros… Phương pháp 4 (hệ thống
Whitley anaerobic Workstations) là hệ thống kín nên tránh được tối đa thời gian tiếp
xúc với không khí, đảm bảo cho các loại VK khó mọc tồn tại được nên số lượng các
loại VK kị khí như Prevotella spp, Clostridium, Fusobacterium spp, Micromonas
micros... có thể mọc được trên môi trường nuôi cấy bởi hệ thống này.
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu, chúng tôi rút ra
kết luận: hệ thống Whitleyanaerobic
Workstations cho tỷ lệ phân lập VK kị khí
cao hơn so với 3 phương pháp còn lại:
phương pháp tạo khí trường bằng phản
ứng hóa học, phương pháp sử dụng túi
genbag và phương pháp sử dụng hệ
thống ANOXOMAT.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Thiều Hoa. Phương pháp nuôi cấy
và phân loại VK kị khí cho một phòng xét
nghiệm không chuyên. Luận án Tiến sỹ
Y học. Trường Đại học Huboldt. Berlin. 1988.
134
2. Lê Thiều Hoa. Kết quả nuôi cấy và phân
lập 632 bệnh phẩm tìm VK kị khí tại Khoa Vi
sinh, Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức từ 30 - 12
- 1992 đến 5 - 10 - 1995. Tạp chí Y học Thực
hành. 1996, 11, tr.17-19.
3. Sutter V.L, Citron D.M, Finegold S.M.
Wadsworth anaerobic bacteriology manual.
Ed. 3, St. Louis. Toronto. London. 1980.
4. Kenneth J Ryan C George Ray.Sherris
th
Medical microbiology. 6 edition. pp.326-349.
5. Lynne S Garcia. Clinical microbiology
procedures handbook. 2016, fourth edition,
section 2, section 4, section 5.
6.
Bailay
and
Scott’s.
Diagnostic
Microbiology. Chapter 22: anaerobes of clinical
th
important. 2015, 13 edition. pp.495-528.
nguon tai.lieu . vn
SO SÁNH HIỆU QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN KỊ KHÍ CỦA
BỐN PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI KHUẨN KỊ KHÍ
TẠI BỆNH VIỆN HỮU NGHỊ VIỆT ĐỨC.
Nguyễn Thị Vân*; Nguyễn Thái Sơn**; Kiều Chí Thành**
TÓM TẮT
Mục tiêu: so sánh hiệu quả phân lập vi khuẩn (VK) kị khí của 4 phương pháp nuôi cấy VK kị
khí hiện nay tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức. Phương pháp: nghiên cứu mô tả tiến cứu. Kết
quả: tỷ lệ mọc VK kị khí bằng phương pháp sử dụng hệ thống Whitley anaerobic Workstations
26,1%, phương pháp tạo khí trường bằng phản ứng hóa học 14,2%, phương pháp dùng túi
Genbag anaer 13,0% và phương pháp dùng hệ thống ANOXOMAT 12,1%. Tỷ lệ mọc VK kị khí
của phương pháp sử dụng hệ thống Whitley anaerobic Workstations cao hơn 2,14 lần phương
pháp tạo khí trường bằng phản ứng hóa học (OR: 2,14; 95%CI: 1,37 - 3,32); 2,36 lần phương
pháp dùng túi Genbag anaer (OR: 2,36; 95%CI: 1,50 - 3,72) và 2,56 lần phương pháp dùng hệ
thống ANOXOMAT (OR: 2,56; 95%CI: 1,62 - 4,07). Kết luận: hệ thống Whitley anaerobic
Workstations cho tỷ lệ phân lập VK kị khí cao hơn so với ba phương pháp còn lại.
* Từ khóa: Vi khuẩn kị khí; Phân lập; Phương pháp nuôi cấy.
Comparison of the Efficiency of Four Current Anaerobic Culture
Methods in Vietduc Hospital
Summary
Objectives: To compare the efficiency of 4 different current methods on anaerobic culture in
Vietduc Hospital. Methods: Prospective descriptive study. Results: The anaerobic growth rate of
Whitley anaerobic Workstations method was 26.1%; the method creating atmosphere by
chemical reactions was 14.2%; the method using Genbag anaer was 13.0% and the method
using ANOXOMAT system was 12.1%. The microbial growth rate of Whitley anaerobic
Workstations method was 2.14 times more than that of the chemical reaction-based method
(OR: 2.14; 95%CI: 1.37 - 3.32); 2.36 fold higher than Genbag anaer method (OR: 2.36; 95%CI:
1.50 - 3.72) and 2.56 times greater than ANOXOMAT method (OR: 2.56; 95%CI: 1.62 - 4.07).
Conclusion: Whitley anaerobic Workstations method has the highest anaerobic growth rate in
comparison with the other three methods.
* Key words: Anaerobe; Isolation; Culture method.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, việc nuôi cấy VK kị khí trong
các phòng xét nghiệm còn hạn chế do chi
phí cao, kỹ thuật phức tạp. Với tỷ lệ nhiễm
khuẩn không nhỏ do VK kị khí, hậu quả
nghiêm trọng và tình hình kháng kháng
sinh ngày càng gia tăng, nuôi cấy VK kị
khí phải là một xét nghiệm thường quy
trong phòng xét nghiệm vi sinh [3, 6].
* Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức
** Bệnh viện Quân y 103
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Vân (dchkc76v@gmail.com)
Ngày nhận bài: 10/02/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 24/04/2017
Ngày bài báo được đăng: 22/05/2017
130
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017
Hiện nay, 4 phương pháp tạo khí trường
kị khí được ứng dụng tại Bệnh viện Hữu
Nghị Việt Đức: phương pháp tạo khí
trường bằng phản ứng hóa học; phương
pháp dùng túi Genbag anaer (BioMerieux),
phương pháp tạo khí trường bằng hệ
thống ANOXOMAT (Đức) và gần đây là
phương pháp sử dụng hệ thống Whitley
anaerobic Workstations (Anh) khép kín.
Các cơ sở mới bắt đầu tìm hiểu hoặc
chuẩn bị triển khai nuôi cấy VK kị khí
thường lúng túng trong việc chọn phương
pháp và thiết bị phù hợp. Để góp phần hỗ
trợ và cung cấp thông tin cho các cơ sở
triển khai nuôi cấy VK kị khí, chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài này với mục
tiêu: So sánh hiệu quả phân lập VK kị khí
của 4 phương pháp nuôi cấy VK kị khí
đang được ứng dụng tại Bệnh viện Hữu
nghị Việt Đức.
- Các chất hóa học cần thiết để tạo khí
trường: 5 - 10% CO2, 5 - 10% H2, 80% N2
như: axít sulphuric, axít citric, kẽm, nước
và chất xúc tác.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
+ Vận chuyển bệnh phẩm: bệnh phẩm
sau khi lấy được chuyển ngay đến khoa
vi sinh sớm nhất có thể, trong vòng 60
phút nếu vận chuyển bệnh phẩm bằng xi
lanh, nếu vận chuyển bệnh phẩm trong
môi trường chuyên dụng như BAYK, thời
gian vận chuyển không quá 24 giờ.
1. Đối tượng nghiên cứu.
Các loại bệnh phẩm mủ lấy tại ổ áp xe
gan, não, thận... và bệnh phẩm dịch ổ
bụng do nhiễm trùng ổ bụng có biến
chứng như: viêm phúc mạc ruột thừa,
thấm mật phúc mạc.
2. Vật tư và trang thiết bị nghiên
cứu.
- Môi trường nuôi cấy: canh thang,
thạch máu, thạch Mac-conkey (Hãng
Oxoid), thạch máu Columbia, vitamin K,
hemin (Hãng BD).
- Hệ thống ANOXOMAT (Đức) và bình
nuôi cấy kị khí đồng bộ với hệ thống này.
- Hệ thống Whitley anaerobic Workstations;
model: DG250 (Anh Quốc).
- Bình khí trộn gồm: 10% CO2, 10% H2,
80% N2.
3. Phương pháp nghiên cứu.
Nghiên cứu mô tả tiến cứu.
* Kỹ thuật tiến hành:
- Lấy và vận chuyển bệnh phẩm:
+ Mẫu bệnh phẩm: mủ hoặc dịch ổ
bụng.
+ Lượng bệnh phẩm: yêu cầu lấy ít
nhất 2 ml (tốt nhất 5 - 10 ml) bệnh phẩm.
- Các bước tiến hành nuôi cấy định
danh tìm VK kị khí:
+ Nuôi cấy mẫu bệnh phẩm mủ, dịch ổ
bụng đồng thời bằng 4 phương pháp
khác nhau. Sau đó tiến hành phân lập,
định danh và thử nghiệm kháng sinh đồ
với các loại VK kị khí phân lập được:
- Các kít định danh: RAPID ID 32 A
cùng phần mềm đọc định danh VK và túi
Genbag anaer (Hãng Bio-Merieux).
. Phương pháp 1: nuôi cấy bằng bình
MART dung tích 5 lít, có nắp và gioăng
cao su để vặn chặt nắp, tạo khí trường
bằng các phản ứng hóa học [1, 2, 3, 4].
- Khoanh giấy và thanh giấy kháng
sinh (Hãng Bio-Merieux).
. Phương pháp 2: nuôi cấy dùng túi
Genbag anaer (Hãng Bio Merieux). Chất
131
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017
liệu túi là plastic, dung tích 1 lít, có ghim
chặt miệng túi, khí trường được tạo ra
bằng túi hóa chất đóng sẵn [3, 5].
của bình được tạo ra bởi các phản ứng
hóa học.
. Phương pháp 3: nuôi cấy bằng bình
MART, khí trường từ bình khí trộn (10%
CO2, 10% H2 và 80% N2) đưa vào bình
nuôi cấy qua hệ thống ANOXOMAT (Đức)
[2, 5].
- Cho ngay 1 đĩa thạch kị khí vào bình
nuôi cấy MART: khí trường kị khí của
bình được đưa vào từ bình khí trộn bởi
hệ thống ANOXOMAT.
. Phương pháp 4: nuôi cấy bằng hệ
thống Whitley anaerobic Workstations,
model: DG250 (Anh Quốc); tủ ấm kín,
dung tích 79,6 lít, có vỏ chất liệu acrylic
trong suốt, qua găng tay có thể thao tác
xử lý mẫu ngay trong tủ, khí trường được
đưa vào từ bình khí trộn (10% CO2, 10%
H2 và 80% N2) bằng hệ thống tự động. Có
bảng điện từ theo dõi nhiệt độ và nồng độ
khí trong tủ [3, 4, 5, 6].
* Các bước nuôi cấy VK kị khí:
- 1 đĩa thạch kị khí cho vào túi genbag.
- 1 đĩa thạch kị khí cho vào tủ cấy kị
khí Whitley anaerobic Workstations.
- Nuôi cấy VK ái khí đồng thời: ủ ấm
đĩa thạch máu thường, đĩa thạch
Macconkey trong khí trường bình thường
của tủ ấm 370C.
- Định danh VK kị khí tìm được: sau
khi đã xác định được VK kị khí, tiến hành
định danh VK đó bằng kít định danh ID 32
A (Hãng Bio Merieux).
* Phân tích và xử lý dữ liệu:
- Bệnh phẩm được cấy đồng thời 4 đĩa
thạch kị khí (trong 1 lít thạch Columbia có
50 ml máu cừu, 2,5 mg haemin và 1 mg
vitamin K) theo phương pháp phân vùng
và 1 đĩa thạch máu thường, 1 đĩa thạch
Maccokey [5].
Nhập và làm sạch dữ liệu bằng phần
mềm Epidata 3.1, sau đó xử lý trên phần
mềm STATA 12.0. Trình bày thống kê mô
tả dưới dạng tần số (n) và tỷ lệ phần trăm
(%). Phân tích hồi quy logistic đơn biến
để xác định mối tương quan giữa các
phương pháp nuôi cấy.
- Cho ngay 1 đĩa thạch kị khí vào
bình nuôi cấy MART: khí trường kị khí
Các phép kiểm định, so sánh có ý
nghĩa thống kê khi p < 0,05.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
Bảng 1: Phân bố bệnh phẩm mủ và dịch khi sử dụng 4 phương pháp nuôi cấy.
Bệnh phẩm
Phương pháp 1
Phương pháp 2
Phương pháp 3
Phương pháp 4
n
%
n
%
n
%
n
%
Mủ các loại
188
55,5
188
55,5
188
55,5
118
49,6
Dịch các loại
151
44,5
151
44,5
151
44,5
120
50,4
339
100
339
100
339
100
238
100
Tổng
Tỷ lệ mẫu bệnh phẩm mủ, dịch ở các phương pháp 1, 2, 3 (phương pháp tạo khí
trường bằng phản ứng hóa học, phương pháp sử dụng túi genbag và phương pháp sử
dụng hệ thống ANOXOMAT) như nhau. Phương pháp 4 (sử dụng hệ thống Whitley
132
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017
anaerobic Workstations), số bệnh phẩm mủ và dịch được nuôi cấy ít hơn. Sự khác
nhau này là do nghiên cứu được chia 2 giai đoạn, kinh phí không đủ để thực hiện song
song 4 phương pháp. Tuy nhiên, đối tượng nghiên cứu là VK kị khí có mặt trong các
mẫu bệnh phẩm mủ và dịch, nên không có sự thay đổi đáng kể về tính chất sinh học
của VK sau 1 năm. Nghiên cứu đánh giá hiệu quả nuôi cấy VK kị khí khi sử dụng các
phương pháp khác nhau bằng những yếu tố tỷ lệ mọc VK và tỷ lệ các loại VK kị khí
mọc được.
Bảng 2: So sánh khả năng mọc VK kị khí của 4 phương pháp.
Bệnh phẩm
Bệnh phẩm mọc VK kị khí
Bệnh phẩm không mọc VK kị khí
Số lượng
Tỷ lệ (%)
Số lượng
Tỷ lệ (%)
Phương pháp 4
62
26,1
176
73,9
Phương pháp 1
48
14,2
291
85,8
Phương pháp 4
62
26,1
176
73,9
Phương pháp 2
44
13,0
295
87,0
Phương pháp 4
62
26,1
176
73,9
Phương pháp 3
41
12,1
298
87,9
So sánh phương pháp 4 (hệ thống
Whitley anaerobic Workstations) với từng
phương pháp còn lại thấy: tỷ lệ mọc VK kị
khí ở phương pháp 4 là 26,1%. Trong đó,
tỷ lệ mọc ở phương pháp 1, 2, 3 (phương
pháp tạo khí trường bằng phản ứng hóa
học, phương pháp sử dụng túi genbag và
phương pháp sử dụng hệ thống
ANOXOMAT) lần lượt là 14,2%; 13,0% và
12,1%. So sánh tỷ lệ mọc giữa phương
pháp 4 và 3 với hai phương pháp còn lại
thấy, tỷ lệ mọc VK kị khí ở phương pháp
4 cao hơn 2,14 lần so với phương pháp 1
OR
(95%CI)
2,14
1,37 - 3,32
2,36
1,50 - 3,72
2,56
1,62 - 4,07
(OR: 2,14; 95%CI: 1,37 - 3,32). Tỷ lệ mọc
VK kị khí ở phương pháp 4 cao hơn 2,36
lần tỷ lệ mọc VK kị khí ở phương pháp 2
(OR: 2,36; 95%CI: 1,50 - 3,72); tỷ lệ mọc
VK kị khí ở phương pháp 4 cao hơn 2,56
lần tỷ lệ mọc VK kị khí ở phương pháp 3
(OR: 2,56; 95%CI: 1,62 - 4,07). Khác biệt
có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Như vậy, tổng số mẫu nuôi cấy bằng
phương pháp 4 (hệ thống Whitley
anaerobic Workstations) ít hơn phương
pháp 1, 2, 3 nhưng tỷ lệ mẫu bệnh phẩm
mọc VK kị khí lại cao hơn.
Bảng 3: Các chủng VK kị khí phân lập được từ các bệnh phẩm mủ, dịch.
VK kị khí
Phương pháp 1
Phương pháp 2
Phương pháp 3
Phương pháp 4
n
%
n
%
n
%
n
%
Bacteroides spp
24
48,0
22
47,8
19
44,2
25
30,1
Prevotella spp
5
10,0
5
10,9
7
16,3
14
16,9
Clostridium
3
6,0
2
4,3
2
4,7
11
13,3
Gemella
2
4,0
2
4,3
2
4,7
3
3,6
133
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2017
Fusobacterium spp
0
0
0
0
0
0
2
2,4
Propionibacterium
11
22,0
10
21,7
9
20,9
8
9,7
Actinomyces
1
2,0
1
2,2
1
2,3
3
3,6
Micromonas micros
1
2,0
1
2,2
1
2,3
9
10,8
Các loại khác
3
6,0
3
6,5
2
4,7
8
9,6
50
100
46
100
43
100
83
100
Tổng
Bacteroides spp là VK kị khí được phân lập nhiều nhất và chiếm tỷ lệ cao. Kết quả
này phù hợp với những nghiên cứu đã công bố trên thế giới [3] và trong nước [2].
Không có sự khác biệt về tỷ lệ B. fragilis mọc được bằng các phương pháp sử dụng
khác nhau, nhưng có sự khác biệt về chủng loại VK kị khí khác như: Prevotella spp,
Clostridium, Fusobacterium spp, Micromonas micros… Phương pháp 4 (hệ thống
Whitley anaerobic Workstations) là hệ thống kín nên tránh được tối đa thời gian tiếp
xúc với không khí, đảm bảo cho các loại VK khó mọc tồn tại được nên số lượng các
loại VK kị khí như Prevotella spp, Clostridium, Fusobacterium spp, Micromonas
micros... có thể mọc được trên môi trường nuôi cấy bởi hệ thống này.
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu, chúng tôi rút ra
kết luận: hệ thống Whitleyanaerobic
Workstations cho tỷ lệ phân lập VK kị khí
cao hơn so với 3 phương pháp còn lại:
phương pháp tạo khí trường bằng phản
ứng hóa học, phương pháp sử dụng túi
genbag và phương pháp sử dụng hệ
thống ANOXOMAT.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Thiều Hoa. Phương pháp nuôi cấy
và phân loại VK kị khí cho một phòng xét
nghiệm không chuyên. Luận án Tiến sỹ
Y học. Trường Đại học Huboldt. Berlin. 1988.
134
2. Lê Thiều Hoa. Kết quả nuôi cấy và phân
lập 632 bệnh phẩm tìm VK kị khí tại Khoa Vi
sinh, Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức từ 30 - 12
- 1992 đến 5 - 10 - 1995. Tạp chí Y học Thực
hành. 1996, 11, tr.17-19.
3. Sutter V.L, Citron D.M, Finegold S.M.
Wadsworth anaerobic bacteriology manual.
Ed. 3, St. Louis. Toronto. London. 1980.
4. Kenneth J Ryan C George Ray.Sherris
th
Medical microbiology. 6 edition. pp.326-349.
5. Lynne S Garcia. Clinical microbiology
procedures handbook. 2016, fourth edition,
section 2, section 4, section 5.
6.
Bailay
and
Scott’s.
Diagnostic
Microbiology. Chapter 22: anaerobes of clinical
th
important. 2015, 13 edition. pp.495-528.