Xem mẫu
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
SÀNG LỌC HỆ VECTOR BIỂU HIỆN KHÁNG THỂ
scFv-CH2 KHÁNG CD20
Trần Minh Đạo*; Phạm Thu Thùy*; Lê Quang Huấn**
TÓM TẮT
Mục tiêu: lựa chọn được vector biểu hiện kháng thể scFv-CH2 và kháng thể tạo ra có khả
năng liên kết với kháng nguyên CD20. Phương pháp: nghiên cứu sử dụng phương pháp cắt,
gắn gen anti-CD20Fa vào 3 vector biểu hiện pET28a, pET30GB1, MPB; biến nạp, tách ADN
plasmid và phương pháp biểu hiện protein (kháng thể) được tiến hành theo Sambrook và CS
(2001), phương pháp ELISA và Western blot. Kết quả: gen anti-CD20Fa đã gắn vào 3 vector và
3 vector đều có khả năng biểu hiện scFv-CH2. Tuy nhiên, vector pET28a biểu hiện kháng thể
scFv-CH2 và kháng thể có hoạt tính liên kết với kháng thể cộng hợp cao nhất so với 2 vector
pET28a và pET30GB1. Kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng liên kết với kháng nguyên
CD20 thương mại và CD20 biểu hiện trên tế lympho B ác tính dòng Raji. Kết luận: cả 3 vector
pET28a, pET30GB1 và MPB có khả năng biểu hiện scFv-CH2. Tuy nhiên, vector pET28a được
lựa chọn làm vector biểu hiện scFv-CH2. Kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng liên kết với
kháng nguyên CD20 thương mại và CD20 biểu hiện trên tế lympho B ác tính dòng Raji.
* Tõ khãa: Sàng lọc vector; Kháng thể scFv-CH2; Kháng CD20.
Screening Vector System Expressed Anti-CD20 scFv-CH2 Antibody
Summary
Objectives: To screen vector expressing anti- CD20 scFv-CH2 antibody and this antibody can
associate with anti-CD20 the best. Methods: Using the methods of cutting, ligating anti-CD20Fa
gene to 3 expression vector pET28a, pET30GB1, MPB; transformation, plasmid DNA extraction
and protein expression methods (antibody) were carried out according to Sambrook et al (2001)
and ELISA, Western blot method. Results: The anti-CD20Fa gene attached to three vectors and
3 vectors have the ability to express scFv-CH2. However, the vector pET28a expressed scFvCH2 antibody the best compared to the 2 vector MPB and pET30GB1. scFv-CH2 antibody can
associate with trade antigen CD20 and CD20 expression on malignant B lymphocytes (Raji).
Conclusions: 3 vectors pET28a, pET30GB1 and MPB have the ability to express scFv-CH2.
However, pET28a vector is selected as the expression vector scFv-C H 2. This antibody
potentially associated with trade antigen CD20 and CD20 expression on malignant B
lymphocytes (Raji).
* Key words: Vector screening; scFv-CH2 antibody; Anti-CD20.
* Bệnh viện 19.8
** Viện Công nghệ Sinh học
Người phản hồi (Corresponding): Trần Minh Đạo (daohuy2003@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 26/12/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 13/01/2015
Ngày bài báo được đăng: 02/03/2015
150
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng thể scFv đã khắc phục được một số
nhược điểm của kháng thể đơn dòng, như
hạn chế tối đa hiện tượng HAMA (mAb có
nguồn gốc từ chuột khi vào cơ thể do không
- Lựa chọn vector biểu hiện kháng thể
scFv-CH2 kháng CD20.
- Xác định khả năng liên kết của kháng thể
scFv-CH2 với CD20.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN
CỨU
tương hợp với hệ miễn dịch của người, khiến
cơ thể sinh ra kháng thể chống lại nó) và kích
1. Vật liệu nghiờn cứu.
thước nhỏ của scFv thuận lợi khi thâm nhập
- Chủng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3),
biểu
hiện
vào các mô đích [5, 6]. Tuy nhiên, scFv lại có
vector
hạn chế như khả năng liên kết với kháng
(Novagen) và vector MPB do Phòng Công
nguyên và tính nhạy yếu trong phản ứng hóa
nghệ Tế bào động vật cung cấp. Các mồi Fa
miễn dịch (ELISA) [8]. scFv có gắn thêm vùng
và CHR được thiết kế để khuếch đại đoạn gen
hằng định kháng thể Fc (CH1, CH2, CH3) đã
anti-CD20Fa mã hóa kháng thể scFv-CH2
khắc phục được hạn chế này, tăng độ bền
chứa trình tự nhận biết của enzym giới hạn
của kháng thể và Fc có vai trò quan trọng
BamHI và XhoI có trình tự cụ thể như sau:
trong việc giết chết tế bào trực tiếp thông qua
pET28a,
pET30GB1
Fa: ATGGGAGCCTGGATCCGTATTATCTC
cơ chế gây độc tế bào phụ thuộc bổ thể
BamHI
(CDC), hoạt hóa tế bào miễn dịch, giết chết tế
CHR: CAATAGGTGCCTCGAGTGCTTTATAG
XhoI
bào thông qua cơ chế ADCC và gây chết tế
bào theo chương trình [10].
CD20 là kháng nguyên xuất hiện trên 90%
tế bào lympho B ác tính và xuất hiện khoảng
85 - 90% ở bệnh nhân lympho bào nonHodgkin không dễ dàng bị đồng hóa hay biến
dạng khi gắn với kháng thể [3]. CD20 là đích
tiềm năng trong liệu pháp điều trị các bệnh liên
quan đến tế bào lympho B ác tính [2, 7].
Hiện nay có một số hệ vector biểu hiện
protein (hay kháng thể) ở E. coli như: hệ
vector pET, pDEST, pASK-IBA… Tuy nhiên, phụ
thuộc vào protein đích để lựa chọn hệ vector,
trong đó hệ pET được sử dụng phổ biến nhất
trong biểu hiện protein ở E. coli và với cùng
một gen đích thì mỗi vector cũng biểu hiện ở
mức độ khác nhau. Vì vậy, nghiên cứu này
được tiến hành nhằm:
151
Enzym BamHI, XhoI và T4-ligase (New
England Biolabs). Môi trường nuôi cấy E. coli
LB (tryptone, NaCl, cao nấm men và agar đối
với môi trường thạch) và các hóa chất khác
sử dụng trong sinh học phân tử và công nghệ
gen.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
Phương pháp cắt, gắn sản phẩm PCR vào
vector biểu hiện pET28a, pET30GB1, MPB;
biến nạp, tách ADN plasmid phương pháp
biểu hiện protein được tiến hành theo
Sambrook và CS (2001) [9]. Phản ứng
Western blot xác định hoạt tính liên kết của
kháng thể scFv-CH2 tạo ra với kháng thể cộng
hợp kháng đuôi histidine. Phản ứng ELISA
xác định hoạt tính liên kết của kháng thể
scFv-CH2 tạo ra với CD20 thương mại (SB) và
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
CD20 trên dòng tế bào lympho B ác tính dòng
Raji do Học viện Quân y cung cấp.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1. Nhân dòng các vector biểu hiện scFvCH2.
3 vector (pET28a, pET30GB1; MBP) biểu
hiện được lựa chọn để gắn gen anti-CD20Fa
mã hóa kháng thể scFv-CH2, 3 vector này đã
có sẵn 2 đoạn trình tự gen mã hóa cho 6
histidine ở hai đầu của gen đích sau khi gắn
vào, rất thuận tiện cho việc thu nhận, tinh
sạch và nhận biết kháng thể scFv-CH2.
Gen anti-CD20Fa được tinh sạch và thôi gel
theo kit (Hãng QIAGEN), sau đó cắt bằng
BamHI và XhoI. Các vector pET28a,
pET30GB1 và MBP cũng được cắt bằng
BamHI và XhoI. Tạo vector tái tổ hợp bằng
cách đem gắn gen anti-CD20Fa vào 3 vector
cùng xử lý với BamHI và XhoI. Các vector này
được biến nạp vào chủng DH5α nhân lên
lượng lớn.
Sử dụng PCR để chọn dòng từ các khuẩn
lạc, chọn 6 khuẩn lạc (mỗi vector tái tổ hợp
lấy 2 khuẩn lạc) để PCR với các cặp mồi
tương ứng (pET28a: T7F/R; pET30GB1:
T7F/R; MBP: Fa/C H R). Khuẩn lạc nào chứa
plasmid tái tổ hợp (pET28a/anti-CD20Fa) và
pET30GB1/anti-CD20Fa), sản phẩm PCR từ
khuẩn lạc đó cho kích thước gần 200 bp của
mồi T7 cộng với kích thước gen anti-CD20Fa
khoảng 1.000 bp xấp xỉ 1.200 bp. Khuẩn lạc
chứa plasmid tái tổ hợp (MBP/anti-CD20Fa),
sản phẩm PCR từ khuẩn lạc đó cho kích
thước bằng với kích thước gen anti-CD20Fa
khoảng 1.000 bp.
152
Hình 1: Ảnh điện di sản phẩm PCR gen
anti-CD20Fa gắn vào các vector biểu hiện
M: marker ADN; 1, 2: 2 khuẩn lạc chứa
vector MBP; 3, 4: 2 khuẩn lạc chứa vector
pET30GB1; 5, 6: 2 khuẩn lạc chứa vector
pET28a.
Hai khuẩn lạc chứa vector MBP (đường
chạy số 1, 2) có băng kích thước khoảng
1.000 bp, 2 khuẩn lạc chứa vector pET30GB1
(đường chạy số 3, 4) và 2 khuẩn lạc chứa
vector pET28a (đường chạy số 5, 6) cùng có
băng kích thước ~ 1.200 bp. Kết quả này phù
hợp với tính toán trên lý thuyết. Như vậy, gen
anti-CD20Fa đã gắn vào các vector biểu hiện
(pET28a, pET30GB1 và MBP).
2. Biểu hiện kháng thể scFv-CH2 trong hệ
vector.
3 plasmid tái tổ hợp (pET28a/antiCD20Fa,
pET30GB1/anti-CD20Fa
và
MBP/anti-CD20Fa) được biến nạp vào tế
bào E. coli BL21, nuôi biểu hiện ở 37oC trong
4 giờ có bổ sung Ka (50 µg/ml) và chất cảm
ứng IPTG (0,5 mM).
Các mẫu cảm ứng IPTG (đường chạy số 2;
4; 6) xuất hiện một băng protein mới có kích
thước tương ứng (pET28a: ~ 43 kDa;
pET30GB1: ~ 50 kDa; MBP: ~ 85 kDa), còn ở
mẫu không cảm ứng (đường chạy số 1; 3; 5)
không thấy xuất hiện
các băng này. Các
băng protein xuất hiện mới này khả năng là
protein tái tổ hợp đích cần biểu hiện. Như vậy,
các vector tái tổ hợp đều có khả năng biểu
hiện kháng thể tái tổ hợp đích.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
Theo thiết kế, scFv-CH2 tái tổ hợp gắn
thêm 6 histidine ở 2 đầu. Dựa vào đặc điểm
này, có thể xác định hoạt tính liên kết của
kháng thể scFv-CH2 tạo ra với kháng thể cộng
hợp kháng đuôi histidie.
Vector pET28a (đường số 1) và vector
pET30GB1 (đường số 2) xuất hiện băng kích
thước nằm trong khoảng 40 - 55 kDa. Tuy
nhiên, kích thước protein của đường số 1 (~
43 kDa) thấp hơn và xuất hiện đậm hơn
đường số 2 (~ 50 kDa), vector MBP (đường
số 3, 4) không xuất hiện băng kích thước ~ 85
kDa theo tính toán lý thuyết.
Hình 2: Ảnh điện di biểu hiện gen mã hóa
scFv-CH2 trong 3 vector.
M: marker; pET28a (1: Trước cảm ứng; 2:
Sau cảm ứng) pET30GB1 (3: Trước cảm ứng;
4: Sau cảm ứng) MBP (5: Trước cảm ứng; 6:
Sau cảm ứng).
2. Chọn vector biểu hiện scFv-CH2.
Các vector đều có khả năng biểu hiện
protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, để lựa chọn
vector biểu hiện kháng thể scFv-CH2 có hàm
lượng cao nhất, cần tiến hành phản ứng
Western blot.
Như vậy, kháng thể tái tổ hợp từ vector
pET28a có hoạt tính liên kết với kháng thể
cộng hợp cao nhất so với 2 vector MBP,
pET30GB1. Mặt khác, kháng thể tạo ra từ
pET28a không gắn đoạn protein dung hợp
nên sau khi tinh sạch protein này không phải
loại bỏ phần protein dung hợp mà vẫn tiến
hành ngay nghiên cứu về chẩn đoán bệnh.
Sau khi sơ bộ kiểm tra khả năng biểu hiện
và xác định hoạt tính của kháng thể bằng
phản ứng Western blot, chúng tôi thấy vector
tái tổ hợp pET28a/anti-CD20Fa biểu hiện tốt
và có hoạt tính liên kết với kháng thể cộng
hợp cao nhất so với 2 vector pET30GB1/antiCD20Fa và MBP/anti-CD20Fa. Vì vậy,
pET28a được lựa chọn làm vector biểu hiện
gen anti-CD20Fa.
* Xác định khả năng liên kết của scFv-CH2
với CD20:
Hình 3: Hình ảnh Western blot của
kháng thể scFv-CH2 ở 3 vector biểu hiện.
M: Marker protein; 1: pET28a;
pET30GB1; 3, 4: MBP.
153
2:
Một số nhà khoa học đã sử dụng phương
pháp ELISA để xác định khả năng liên kết của
kháng thể kháng CD20 tạo ra với CD20 trên
tế bào lympho B
ác tính dòng Raji hay
dòng Daudi như Anna [1], Geng [4] và Fang
[2].
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
Tương tự, chúng tôi xác định khả năng liên
kết của kháng thể scFv-CH2 tạo ra với CD20
bằng ELISA cạnh tranh. Phản ứng ELISA
gồm scFv-C H 2, kháng nguyên CD20 tái tổ
hợp thương mại (SB) và tế bào ung thư máu
dòng lympho B có biểu hiện CD20 (Raji) do
Học viện Quân y cung cấp.
A
Giá trị OD
B
Hình 4: Hình ảnh các tế bào lympho B và kết
quả ELISA xác định khả năng liên kết của
kháng thể scFv-CH2 với CD20.
A: Hình ảnh các tế bào lympho B biểu hiện
CD20 ác tính dưới kính hiển vi điện tử (độ
phóng đại 400 lần).
B: Biểu đồ kết quả ELISA xác định khả
năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 với
154
kháng nguyên CD20 thương mại và CD20 trên
tế bào lympho B (Raji). TN1 - TN6: Thí
nghiệm 1 - thí nghiệm 6.
Kết quả ELISA cạnh tranh cho thấy, thí
nghiệm 2 và 6 không có kháng thể scFv-CH2
xuất hiện màu và có giá trị OD450nm tương ứng là
0,185 và 0,165. Các thí nghiệm 1, 5 (TN1, TN5)
có kháng thể scFv-CH2 không xuất hiện màu
(OD450nm tương ứng là 0,059 và 0,06) và 2 thí
nghiệm đối chứng (TN3 và TN4) cũng không
xuất hiện màu (OD450nm tương ứng là 0,056 và
0,061) thấp hơn nhiều thí nghiệm 2 và 6. Như
vậy, qua phản ứng ELISA có thể khẳng định
kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng liên kết
đặc hiệu với kháng nguyên CD20 thương
mại và CD20 trên tế bào lympho B ác tính dòng
Raji.
Kết quả của chúng tôi tương tự nghiên cứu
của Anna, Geng và Fang đã tạo được kháng
thể tái tổ hợp dạng scFv-Fc và scFv-LDP
kháng CD20, kháng thể này có hoạt tính liên
kết với CD20. Tuy nhiên, ở nghiên cứu này,
gen mã hóa scFv được tách dòng từ ARN của
tủy gà đã gây miễn dịch với CD20, gen mã
hóa scFv-CH2 được gắn vào vector biểu hiện
pET28a. ScFv-CH2 có khối lượng ~ 43 kDa
được biểu hiện ở E. coli (BL21), tinh sạch trên
cột sắc ký ái lực Ni2+, có khả năng liên kết với
CD20 thương mại (SB) và CD20 trên dòng tế
bào Raji.
KẾT LUẬN
Gen anti-CD20Fa mã hóa cho kháng thể
scFv-CH2 đã gắn vào 3 vector biểu hiện. Cả
3 vector biểu hiện pET28a, pET30GB1 và
MBP có khả năng biểu hiện kháng thể scFvCH2. Vector pET28a được lựa chọn làm vector
biểu hiện scFv-CH2.
nguon tai.lieu . vn
SÀNG LỌC HỆ VECTOR BIỂU HIỆN KHÁNG THỂ
scFv-CH2 KHÁNG CD20
Trần Minh Đạo*; Phạm Thu Thùy*; Lê Quang Huấn**
TÓM TẮT
Mục tiêu: lựa chọn được vector biểu hiện kháng thể scFv-CH2 và kháng thể tạo ra có khả
năng liên kết với kháng nguyên CD20. Phương pháp: nghiên cứu sử dụng phương pháp cắt,
gắn gen anti-CD20Fa vào 3 vector biểu hiện pET28a, pET30GB1, MPB; biến nạp, tách ADN
plasmid và phương pháp biểu hiện protein (kháng thể) được tiến hành theo Sambrook và CS
(2001), phương pháp ELISA và Western blot. Kết quả: gen anti-CD20Fa đã gắn vào 3 vector và
3 vector đều có khả năng biểu hiện scFv-CH2. Tuy nhiên, vector pET28a biểu hiện kháng thể
scFv-CH2 và kháng thể có hoạt tính liên kết với kháng thể cộng hợp cao nhất so với 2 vector
pET28a và pET30GB1. Kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng liên kết với kháng nguyên
CD20 thương mại và CD20 biểu hiện trên tế lympho B ác tính dòng Raji. Kết luận: cả 3 vector
pET28a, pET30GB1 và MPB có khả năng biểu hiện scFv-CH2. Tuy nhiên, vector pET28a được
lựa chọn làm vector biểu hiện scFv-CH2. Kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng liên kết với
kháng nguyên CD20 thương mại và CD20 biểu hiện trên tế lympho B ác tính dòng Raji.
* Tõ khãa: Sàng lọc vector; Kháng thể scFv-CH2; Kháng CD20.
Screening Vector System Expressed Anti-CD20 scFv-CH2 Antibody
Summary
Objectives: To screen vector expressing anti- CD20 scFv-CH2 antibody and this antibody can
associate with anti-CD20 the best. Methods: Using the methods of cutting, ligating anti-CD20Fa
gene to 3 expression vector pET28a, pET30GB1, MPB; transformation, plasmid DNA extraction
and protein expression methods (antibody) were carried out according to Sambrook et al (2001)
and ELISA, Western blot method. Results: The anti-CD20Fa gene attached to three vectors and
3 vectors have the ability to express scFv-CH2. However, the vector pET28a expressed scFvCH2 antibody the best compared to the 2 vector MPB and pET30GB1. scFv-CH2 antibody can
associate with trade antigen CD20 and CD20 expression on malignant B lymphocytes (Raji).
Conclusions: 3 vectors pET28a, pET30GB1 and MPB have the ability to express scFv-CH2.
However, pET28a vector is selected as the expression vector scFv-C H 2. This antibody
potentially associated with trade antigen CD20 and CD20 expression on malignant B
lymphocytes (Raji).
* Key words: Vector screening; scFv-CH2 antibody; Anti-CD20.
* Bệnh viện 19.8
** Viện Công nghệ Sinh học
Người phản hồi (Corresponding): Trần Minh Đạo (daohuy2003@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 26/12/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 13/01/2015
Ngày bài báo được đăng: 02/03/2015
150
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng thể scFv đã khắc phục được một số
nhược điểm của kháng thể đơn dòng, như
hạn chế tối đa hiện tượng HAMA (mAb có
nguồn gốc từ chuột khi vào cơ thể do không
- Lựa chọn vector biểu hiện kháng thể
scFv-CH2 kháng CD20.
- Xác định khả năng liên kết của kháng thể
scFv-CH2 với CD20.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN
CỨU
tương hợp với hệ miễn dịch của người, khiến
cơ thể sinh ra kháng thể chống lại nó) và kích
1. Vật liệu nghiờn cứu.
thước nhỏ của scFv thuận lợi khi thâm nhập
- Chủng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3),
biểu
hiện
vào các mô đích [5, 6]. Tuy nhiên, scFv lại có
vector
hạn chế như khả năng liên kết với kháng
(Novagen) và vector MPB do Phòng Công
nguyên và tính nhạy yếu trong phản ứng hóa
nghệ Tế bào động vật cung cấp. Các mồi Fa
miễn dịch (ELISA) [8]. scFv có gắn thêm vùng
và CHR được thiết kế để khuếch đại đoạn gen
hằng định kháng thể Fc (CH1, CH2, CH3) đã
anti-CD20Fa mã hóa kháng thể scFv-CH2
khắc phục được hạn chế này, tăng độ bền
chứa trình tự nhận biết của enzym giới hạn
của kháng thể và Fc có vai trò quan trọng
BamHI và XhoI có trình tự cụ thể như sau:
trong việc giết chết tế bào trực tiếp thông qua
pET28a,
pET30GB1
Fa: ATGGGAGCCTGGATCCGTATTATCTC
cơ chế gây độc tế bào phụ thuộc bổ thể
BamHI
(CDC), hoạt hóa tế bào miễn dịch, giết chết tế
CHR: CAATAGGTGCCTCGAGTGCTTTATAG
XhoI
bào thông qua cơ chế ADCC và gây chết tế
bào theo chương trình [10].
CD20 là kháng nguyên xuất hiện trên 90%
tế bào lympho B ác tính và xuất hiện khoảng
85 - 90% ở bệnh nhân lympho bào nonHodgkin không dễ dàng bị đồng hóa hay biến
dạng khi gắn với kháng thể [3]. CD20 là đích
tiềm năng trong liệu pháp điều trị các bệnh liên
quan đến tế bào lympho B ác tính [2, 7].
Hiện nay có một số hệ vector biểu hiện
protein (hay kháng thể) ở E. coli như: hệ
vector pET, pDEST, pASK-IBA… Tuy nhiên, phụ
thuộc vào protein đích để lựa chọn hệ vector,
trong đó hệ pET được sử dụng phổ biến nhất
trong biểu hiện protein ở E. coli và với cùng
một gen đích thì mỗi vector cũng biểu hiện ở
mức độ khác nhau. Vì vậy, nghiên cứu này
được tiến hành nhằm:
151
Enzym BamHI, XhoI và T4-ligase (New
England Biolabs). Môi trường nuôi cấy E. coli
LB (tryptone, NaCl, cao nấm men và agar đối
với môi trường thạch) và các hóa chất khác
sử dụng trong sinh học phân tử và công nghệ
gen.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
Phương pháp cắt, gắn sản phẩm PCR vào
vector biểu hiện pET28a, pET30GB1, MPB;
biến nạp, tách ADN plasmid phương pháp
biểu hiện protein được tiến hành theo
Sambrook và CS (2001) [9]. Phản ứng
Western blot xác định hoạt tính liên kết của
kháng thể scFv-CH2 tạo ra với kháng thể cộng
hợp kháng đuôi histidine. Phản ứng ELISA
xác định hoạt tính liên kết của kháng thể
scFv-CH2 tạo ra với CD20 thương mại (SB) và
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
CD20 trên dòng tế bào lympho B ác tính dòng
Raji do Học viện Quân y cung cấp.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1. Nhân dòng các vector biểu hiện scFvCH2.
3 vector (pET28a, pET30GB1; MBP) biểu
hiện được lựa chọn để gắn gen anti-CD20Fa
mã hóa kháng thể scFv-CH2, 3 vector này đã
có sẵn 2 đoạn trình tự gen mã hóa cho 6
histidine ở hai đầu của gen đích sau khi gắn
vào, rất thuận tiện cho việc thu nhận, tinh
sạch và nhận biết kháng thể scFv-CH2.
Gen anti-CD20Fa được tinh sạch và thôi gel
theo kit (Hãng QIAGEN), sau đó cắt bằng
BamHI và XhoI. Các vector pET28a,
pET30GB1 và MBP cũng được cắt bằng
BamHI và XhoI. Tạo vector tái tổ hợp bằng
cách đem gắn gen anti-CD20Fa vào 3 vector
cùng xử lý với BamHI và XhoI. Các vector này
được biến nạp vào chủng DH5α nhân lên
lượng lớn.
Sử dụng PCR để chọn dòng từ các khuẩn
lạc, chọn 6 khuẩn lạc (mỗi vector tái tổ hợp
lấy 2 khuẩn lạc) để PCR với các cặp mồi
tương ứng (pET28a: T7F/R; pET30GB1:
T7F/R; MBP: Fa/C H R). Khuẩn lạc nào chứa
plasmid tái tổ hợp (pET28a/anti-CD20Fa) và
pET30GB1/anti-CD20Fa), sản phẩm PCR từ
khuẩn lạc đó cho kích thước gần 200 bp của
mồi T7 cộng với kích thước gen anti-CD20Fa
khoảng 1.000 bp xấp xỉ 1.200 bp. Khuẩn lạc
chứa plasmid tái tổ hợp (MBP/anti-CD20Fa),
sản phẩm PCR từ khuẩn lạc đó cho kích
thước bằng với kích thước gen anti-CD20Fa
khoảng 1.000 bp.
152
Hình 1: Ảnh điện di sản phẩm PCR gen
anti-CD20Fa gắn vào các vector biểu hiện
M: marker ADN; 1, 2: 2 khuẩn lạc chứa
vector MBP; 3, 4: 2 khuẩn lạc chứa vector
pET30GB1; 5, 6: 2 khuẩn lạc chứa vector
pET28a.
Hai khuẩn lạc chứa vector MBP (đường
chạy số 1, 2) có băng kích thước khoảng
1.000 bp, 2 khuẩn lạc chứa vector pET30GB1
(đường chạy số 3, 4) và 2 khuẩn lạc chứa
vector pET28a (đường chạy số 5, 6) cùng có
băng kích thước ~ 1.200 bp. Kết quả này phù
hợp với tính toán trên lý thuyết. Như vậy, gen
anti-CD20Fa đã gắn vào các vector biểu hiện
(pET28a, pET30GB1 và MBP).
2. Biểu hiện kháng thể scFv-CH2 trong hệ
vector.
3 plasmid tái tổ hợp (pET28a/antiCD20Fa,
pET30GB1/anti-CD20Fa
và
MBP/anti-CD20Fa) được biến nạp vào tế
bào E. coli BL21, nuôi biểu hiện ở 37oC trong
4 giờ có bổ sung Ka (50 µg/ml) và chất cảm
ứng IPTG (0,5 mM).
Các mẫu cảm ứng IPTG (đường chạy số 2;
4; 6) xuất hiện một băng protein mới có kích
thước tương ứng (pET28a: ~ 43 kDa;
pET30GB1: ~ 50 kDa; MBP: ~ 85 kDa), còn ở
mẫu không cảm ứng (đường chạy số 1; 3; 5)
không thấy xuất hiện
các băng này. Các
băng protein xuất hiện mới này khả năng là
protein tái tổ hợp đích cần biểu hiện. Như vậy,
các vector tái tổ hợp đều có khả năng biểu
hiện kháng thể tái tổ hợp đích.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
Theo thiết kế, scFv-CH2 tái tổ hợp gắn
thêm 6 histidine ở 2 đầu. Dựa vào đặc điểm
này, có thể xác định hoạt tính liên kết của
kháng thể scFv-CH2 tạo ra với kháng thể cộng
hợp kháng đuôi histidie.
Vector pET28a (đường số 1) và vector
pET30GB1 (đường số 2) xuất hiện băng kích
thước nằm trong khoảng 40 - 55 kDa. Tuy
nhiên, kích thước protein của đường số 1 (~
43 kDa) thấp hơn và xuất hiện đậm hơn
đường số 2 (~ 50 kDa), vector MBP (đường
số 3, 4) không xuất hiện băng kích thước ~ 85
kDa theo tính toán lý thuyết.
Hình 2: Ảnh điện di biểu hiện gen mã hóa
scFv-CH2 trong 3 vector.
M: marker; pET28a (1: Trước cảm ứng; 2:
Sau cảm ứng) pET30GB1 (3: Trước cảm ứng;
4: Sau cảm ứng) MBP (5: Trước cảm ứng; 6:
Sau cảm ứng).
2. Chọn vector biểu hiện scFv-CH2.
Các vector đều có khả năng biểu hiện
protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, để lựa chọn
vector biểu hiện kháng thể scFv-CH2 có hàm
lượng cao nhất, cần tiến hành phản ứng
Western blot.
Như vậy, kháng thể tái tổ hợp từ vector
pET28a có hoạt tính liên kết với kháng thể
cộng hợp cao nhất so với 2 vector MBP,
pET30GB1. Mặt khác, kháng thể tạo ra từ
pET28a không gắn đoạn protein dung hợp
nên sau khi tinh sạch protein này không phải
loại bỏ phần protein dung hợp mà vẫn tiến
hành ngay nghiên cứu về chẩn đoán bệnh.
Sau khi sơ bộ kiểm tra khả năng biểu hiện
và xác định hoạt tính của kháng thể bằng
phản ứng Western blot, chúng tôi thấy vector
tái tổ hợp pET28a/anti-CD20Fa biểu hiện tốt
và có hoạt tính liên kết với kháng thể cộng
hợp cao nhất so với 2 vector pET30GB1/antiCD20Fa và MBP/anti-CD20Fa. Vì vậy,
pET28a được lựa chọn làm vector biểu hiện
gen anti-CD20Fa.
* Xác định khả năng liên kết của scFv-CH2
với CD20:
Hình 3: Hình ảnh Western blot của
kháng thể scFv-CH2 ở 3 vector biểu hiện.
M: Marker protein; 1: pET28a;
pET30GB1; 3, 4: MBP.
153
2:
Một số nhà khoa học đã sử dụng phương
pháp ELISA để xác định khả năng liên kết của
kháng thể kháng CD20 tạo ra với CD20 trên
tế bào lympho B
ác tính dòng Raji hay
dòng Daudi như Anna [1], Geng [4] và Fang
[2].
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015
Tương tự, chúng tôi xác định khả năng liên
kết của kháng thể scFv-CH2 tạo ra với CD20
bằng ELISA cạnh tranh. Phản ứng ELISA
gồm scFv-C H 2, kháng nguyên CD20 tái tổ
hợp thương mại (SB) và tế bào ung thư máu
dòng lympho B có biểu hiện CD20 (Raji) do
Học viện Quân y cung cấp.
A
Giá trị OD
B
Hình 4: Hình ảnh các tế bào lympho B và kết
quả ELISA xác định khả năng liên kết của
kháng thể scFv-CH2 với CD20.
A: Hình ảnh các tế bào lympho B biểu hiện
CD20 ác tính dưới kính hiển vi điện tử (độ
phóng đại 400 lần).
B: Biểu đồ kết quả ELISA xác định khả
năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 với
154
kháng nguyên CD20 thương mại và CD20 trên
tế bào lympho B (Raji). TN1 - TN6: Thí
nghiệm 1 - thí nghiệm 6.
Kết quả ELISA cạnh tranh cho thấy, thí
nghiệm 2 và 6 không có kháng thể scFv-CH2
xuất hiện màu và có giá trị OD450nm tương ứng là
0,185 và 0,165. Các thí nghiệm 1, 5 (TN1, TN5)
có kháng thể scFv-CH2 không xuất hiện màu
(OD450nm tương ứng là 0,059 và 0,06) và 2 thí
nghiệm đối chứng (TN3 và TN4) cũng không
xuất hiện màu (OD450nm tương ứng là 0,056 và
0,061) thấp hơn nhiều thí nghiệm 2 và 6. Như
vậy, qua phản ứng ELISA có thể khẳng định
kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng liên kết
đặc hiệu với kháng nguyên CD20 thương
mại và CD20 trên tế bào lympho B ác tính dòng
Raji.
Kết quả của chúng tôi tương tự nghiên cứu
của Anna, Geng và Fang đã tạo được kháng
thể tái tổ hợp dạng scFv-Fc và scFv-LDP
kháng CD20, kháng thể này có hoạt tính liên
kết với CD20. Tuy nhiên, ở nghiên cứu này,
gen mã hóa scFv được tách dòng từ ARN của
tủy gà đã gây miễn dịch với CD20, gen mã
hóa scFv-CH2 được gắn vào vector biểu hiện
pET28a. ScFv-CH2 có khối lượng ~ 43 kDa
được biểu hiện ở E. coli (BL21), tinh sạch trên
cột sắc ký ái lực Ni2+, có khả năng liên kết với
CD20 thương mại (SB) và CD20 trên dòng tế
bào Raji.
KẾT LUẬN
Gen anti-CD20Fa mã hóa cho kháng thể
scFv-CH2 đã gắn vào 3 vector biểu hiện. Cả
3 vector biểu hiện pET28a, pET30GB1 và
MBP có khả năng biểu hiện kháng thể scFvCH2. Vector pET28a được lựa chọn làm vector
biểu hiện scFv-CH2.