Xem mẫu
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX - PCR
PHÁT HIỆN VI KHUẨN CHLAMYDIA TRACHOMATIS
Nguyễn Ngọc Chỉnh1, Phạm Đăng Bảng2, Trần Hậu Khang2, Đặng Xuân Nghiêm1
1
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, 2Trường Đại học Y Hà Nội
Nghiên cứu được tiến hành nhằm phát triển phương pháp multiplex PCR phát hiện nhanh và chính xác vi
khuẩn Chlamydia trachomatis. Các mẫu bệnh được khảo sát là của các bệnh nhân tới khám chữa bệnh tại
bệnh viện Phụ sản Bắc Giang từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2011. Điều kiện tối ưu của phản ứng PCR nhằm
phát hiện các đoạn DNA đặc thù của Chlamydia trachomatis bằng 5 cặp mồi CtP, CtM, CtR, NO, Chlamp và
cặp mồi đối chứng dương AR, đã được khảo sát và cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu của từng cặp mồi nằm
trong khoảng từ 53oC đến 57oC. Đồng thời, điều kiện tối ưu cho phản ứng Multiplex PCR với 4 cặp mồi: CtP,
NO, Chlamp và AR đã được xác định là 56oC. Kết quả khảo sát tỷ lệ nhiễm bệnh ở các bệnh nhân đến khám
phụ khoa ở bệnh viện Phụ sản Bắc Giang cho thấy có 31 mẫu dương tính trong số 251 mẫu nghiên cứu,
chiếm 12,35%.
Từ khóa: chẩn đoán nhanh, Chlamydia trachomatis, Multiplex PCR
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh nhiễm khuẩn đường sinh dục do vi
phương pháp có độ chính xác cao. Ratti và
khuẩn Chlamydia trachomatis (C. trachomatis)
cộng sự (1991) dùng cặp mồi Chlamp để xác
định vi khuẩn C. trachomatis [2]. Năm 1993,
là bệnh phổ biến trên toàn Thế giới và có mức
độ lây nhiễm cao. Theo Tổ chức Y tế Thế giới,
Roosendaal và cộng sự đã so sánh độ nhạy
của phương pháp chuẩn đoán bằng PCR, sử
mỗi năm có khoảng 90 triệu người mắc bệnh
do nhiễm vi khuẩn này. Nhiễm C. trachomatis
dụng 4 cặp mồi AR, CtM, CtR, CtP để xác
định vi khuẩn C.trachomatis [3]. Đến năm
là nguyên nhân gây viêm vùng chậu, với
khoảng 80% nữ giới và 70% nam giới nhiễm
2006, Viroj cùng các cộng sự đã dùng cặp mồi
C. trachomatis không biểu hiện triệu chứng,
NLO để xác định các mẫu bệnh [1]. Mục tiêu
nghiên cứu nhằm khảo nghiệm, tối ưu hóa việc
đây là nguyên nhân bệnh lây bệnh ra cộng
đồng [1]. Vi khuẩn C. trachomatis là vi khuẩn
ứng dụng các cặp mồi đã công bố để phát hiện
vi khuẩn C. trachomatis bằng phương pháp
kí sinh nội bào, bệnh ít biểu hiện ra bên ngoài
nên cần có biện pháp phát hiện nhanh vi
PCR; phát triển phương pháp multiplex PCR
phát hiện vi khuẩn C. trachomatis và xác định
khuẩn để có biện pháp chữa kịp thời tránh gây
tỷ lệ nhiễm C. trachomatis tại Bắc Giang bằng
biến chứng cho các bệnh nhân. Việc sử dụng
các cặp mồi đã nghiên cứu và công bố trên
phương pháp multiplex PCR.
thế giới để phát triển thành kít phát hiện vi
khuẩn C. trachomatis ở các bệnh nhân là
Địa chỉ liên hệ: Đặng Xuân Nghiêm, khoa Công nghệ sinh
học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
Email: dxnghiem@hua.edu.vn
Ngày nhận: 12/01/2013
Ngày được chấp thuận: 20/6/2013
TCNCYH 83 (3) - 2013
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng
20 mẫu DNA của vi khuẩn C. trachomatis
thu thập và tách chiết tại Bệnh viện Da liễu
Trung Ương được sử dụng để tối ưu hóa
phản ứng PCR, 251 mẫu bệnh phẩm của các
bệnh nhân nữ đến khám phụ khoa tại bệnh
viện Phụ sản Bắc Giang tình nguyện tham gia
27
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
nghiên cứu từ ngày 15/03/2011 đến ngày
vortex 30 giây, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.
13/05/2011.
Sau đó, 200µl chloroform được thêm vào và
trộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong ống
2. Phương pháp
2.1. Phương pháp thu thập mẫu
eppendorf chuyển thành màu trắng đục, hỗn
hợp được ly tâm ở 4oC, 13000 vòng/phút
Mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân nữ
tham gia nghiên cứu được thu thập qua hai
trong 10 phút. Dịch nổi được chuyển vào ống
eppendorf mới có sẵn 600µl isopropanol lạnh,
dạng: nước tiểu và mẫu quệt cổ tử cung.
Mẫu được bảo quản trong ống eppendorf có
trộn đều và ủ -20oC 30 phút. DNA được thu
đệm PBS (Phosphate-buffered saline) và ly
tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút trong 4oC
bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 10
phút và rửa bằng 900µl ethanol 70%, để khô
để thu các tế bào trong mẫu bệnh. Sau đó các
ethanol ở nhiệt độ phòng và hòa tan bằng
50µl dung dịch đệm TE 10mM, pH 8. Mẫu
tế bào được rửa bằng đệm PBS và bảo quản
ở - 20oC.
DNA được bảo quản ở - 20oC [4].
Phương pháp sử dụng proteinase K và
2.2. Phương pháp tách chiết DNA
Phương pháp sử dụng Trizol: 200 µl mẫu
được trộn đều với 900 µl dung dịch Trizol pH 8,
phương pháp đun sôi được tiến hành theo
nghiên cứu của Jenab và cộng sự (2010) [5].
2.3. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR,
Multiplex PCR
Bảng 1. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu
Vị trí đoạn gen
được nhân
Tên mồi
Kích thước
(bp)
Trình tự mồi (5’ – 3’)
Chlamp - 1
CCAAAGCTATTCAAAATCGGAGCTCTAAGA
Chlamp - 4
GTCTTCTGCTTACAATGCTCTTGCATATTA
610 - 612
Nhiễm sắc thể
vi khuẩn
NLO
ATGAAAAAACTCTTGAAATCG
NRO
CTCAACTGTAACTGCGTATTT
AR1
GGCGGTGACGGAGCTGGGGCG
AR2
CGCCGCTGCACTGTGAAGCTC
CtP1
TAGTAACTGCCACTTCATCA
CtP2
TTCCCCTTGTAATTCGTTGC
CtM1
GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCCTC
1128
DNA người
153
Plasmid
Gen MOMP
trên NST
vi khuẩn
201
129
CtM2
CCAAGTGGTGCAAGGATCGCA
CtR1
GTGGATAGTCTCAACCCTAT
CtR2
CCCTAAGTGTTGGCAACTAA
Riboxôm
28
310
TCNCYH 83 (3) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Để đánh giá độ nhạy và tiềm năng xác định
2.4. Khảo sát tỷ lệ nhiễm bệnh ở Bắc Giang
mẫu bệnh phẩm có nhiễm vi khuẩn C. tracho-
Nghiên cứu tiến hành khảo sát 251 mẫu
bệnh thu thập tại bệnh viện Phụ sản Bắc
matis bằng phản ứng PCR, 5 cặp mồi nghiên
cứu và cặp mồi đối chứng dương đã được sử
dụng (bảng 1). Mỗi cặp mồi nhân các đoạn
DNA khác nhau của vi khuẩn C. trachomatis,
ngoại trừ cặp AR là đối chứng dương trong
phản ứng PCR, nhân một trình tự của HLA
người - đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên
bạch cầu HLA lớp 2 trong tế bào người. Trong
Giang. Các mẫu bệnh được tách chiết DNA và
chạy multiplex PCR. Nếu phản ứng multiplex
PCR dương tính thì mẫu bệnh có chứa vi
khuẩn C. trachomatis, nếu không phản ứng
mẫu bệnh được kết luận không chứa vi khuẩn
gây bệnh.
III. KẾT QUẢ
mỗi xét nghiệm, đoạn DNA sản phẩm do cặp
mồi AR phải luôn được nhân lên để xác định
DNA được tách từ mẫu bệnh phẩm thành
công. Đồng thời, DNA khuôn tách chiết từ các
mẫu của người đã biết chắc chắn mang bệnh
và không mắc bệnh cũng được chạy cùng
như một đối chứng dương và âm tương ứng.
Cặp mồi Chlamp, NO nhân đoạn DNA trên
nhiễm sắc thể của vi khuẩn [6; 7], cặp mồi CtP
nhân đoạn DNA trên plamid 7,5 kb phổ biến,
1. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu bệnh
DNA tổng số của các mẫu bệnh được tách
chiết theo 3 phương pháp khác nhau: phương
pháp sử dụng Trizol, phương pháp sử dụng
protein K và phương pháp đun sôi. Nồng độ
và chất lượng DNA tổng số đã được kiểm tra
bằng máy đo quang phổ hấp thụ và điện di.
Kết quả của nhiều thí nghiệm lặp lại cho thấy
phương pháp sử dụng Trizol cho chất lượng
CtR nhân đoạn DNA của gen mã hóa riboxôm
và số lượng DNA tốt nhất. Ngoài ra, mẫu bệnh
phẩm là tế bào thu từ ly tâm nước tiểu cho kết
16S, cặp mồi CtM nhân đoạn DNA không biến
quả tách chiết kém hơn so với mẫu dịch tiết
đổi của gen mã hóa protein trên màng tế bào
cổ tử cung. Độ nhạy khi xét nghiệm các bệnh
phẩm bằng nước tiểu thấp hơn nhiều so với
của vi khuẩn C. trachomatis [3].
bệnh phẩm là mẫu quệt cổ tử cung.
Thành phần PCR: PCR buffer (50 mM KCl,
1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris - HCl pH = 8,3);
200 µM mỗi loại dNTP (dATP, dTTP, dGTP,
dCTP); 50 pmol cho mỗi mồi và 1 U Taq polymerase. Trong phản ứng Multiplex PCR, để
phản ứng tối ưu, mỗi phản ứng Multiplex PCR
cũng có 200 µM mỗi loại dNTP, 1,5 mM MgCl2
2. Kết quả kiểm nghiệm điều kiện tối ưu
để chạy mỗi cặp mồi
Mỗi cặp mồi nghiên cứu nhân các đoạn
DNA khác nhau có kích thước khác nhau.
Qua khảo sát với các DNA khuôn từ mẫu
bệnh đối chứng dương tách chiết bằng kít
chuẩn
IVA
pDNA Extraction Kit - Code VA.A92-
và 50 pmol cho mỗi mồi. Chu trình nhiệt: 95oC
002A, các điều kiện khác nhau về thành phần
5 phút, 95oC 1 phút, 50 - 60oC 2 phút, 72oC
Mg2+, hàm lượng dNTP, thời gian bắt cặp
o
1,5 phút, lặp lại 35 chu kỳ, kết thúc 72 C trong
của các cặp mồi cho ta thấy kết quả khác
10 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel
nhau không có ý nghĩa. Tuy nhiên, hình 1
agarose 2,5%.
cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu của mỗi cặp
mồi là khác nhau.
TCNCYH 83 (3) - 2013
29
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Hình 1. Sản phẩm PCR của các cặp mồi nghiên cứu
Nhiệt độ tối ưu cho các cặp mồi đã được
và kích thước sản phẩm PCR, phản ứng
nghiên cứu và lựa chọn dựa theo các nghiên
cứu của Ratti cùng cộng sự (1991), Roosen-
multiplex PCR được tiến hành xây dựng để
phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn C.
daal cùng cộng sự (1993), Viroj cùng cộng sự
(2006). Trong nghiên cứu này, nhiệt độ tối ưu
trachomatis. 4 cặp mồi, AR, CtP, Chlamp và
NO, có nhiệt độ gắn mồi gần giống nhau được
đã được xác định lại riêng cho từng cặp mồi
như sau: cặp mồi AR, NO, CtR, CtM có nhiệt
chọn để chạy phản ứng multiplex PCR. Nhiệt
độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR được
độ gắn mồi tối ưu là 55oC, cặp mồi Chlamp có
khảo sát lại ở dải nhiệt độ từ 47oC tới 56oC và
nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 53oC và cặp mồi
CtP có nhiệt độ gắn mồi tốt nhất ở 57oC. Như
kết quả được thể hiện trong hình 2.
vậy, nhân tố nhiệt độ bắt cặp ảnh hưởng
mạnh tới kết quả của phản ứng PCR. Hình 1
còn cho thấy, ngoại trừ mồi AR, các cặp mồi
nghiên cứu đều rất nhạy và cho ra các sản
phẩm rõ nét, đúng kích thước. Sản phẩm PCR
của 5 cặp mồi cũng đã được khẳng định là
DNA của C. trachomatis bằng việc cắt bằng
enzyme giới hạn thích hợp và giải trình tự.
Việc khảo sát này được thực hiện nhằm tìm ra
các cặp mồi tốt nhất, có nhiệt đội gắn mồi tối
ưu gần giống nhau để dùng trong phản ứng
multiplex PCR.
3. Kết quả multiplex PCR
Dựa vào kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi
30
Hình 2. Sản phẩm phản ứng Multiplex PCR
với 4 cặp mồi: AR, CtP, Chlamp và NO
M: Thang DNA 100 bp; 1: 47oC; 2: 50oC;
3: 53oC; 4: 56oC
TCNCYH 83 (3) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Nhiệt độ gắn mồi tốt nhất cho phản ứng
o
Multiplex PCR là 56 C.
4. Kết quả khảo sát các mẫu bệnh từ
bệnh viện Phụ sản Bắc Giang
Trong nghiên cứu này, có 251 mẫu bệnh
phẩm của các bệnh nhân được thu thập. Căn
cứ vào nhóm tuổi, tình trạng hôn nhân, quê
quán và nghề nghiệp, các bệnh nhân được
phân ra nhiều các nhóm nhỏ khác khác nhau
theo đặc điểm trên.
Đáng ngạc nhiên là các phản ứng multiplex
PCR với các mẫu nghiên cứu hoặc cho sản
phẩm đầy đủ của các cặp mồi thành phần với
độ nét cao hoặc không có bất kỳ sản phẩm
nào ngoài DNA do cặp mồi AR nhân lên. Kết
quả này có sự khác biệt với công bố của
Roosendaal cùng cộng sự (1993) rằng cặp
mồi CtP có độ nhạy cao hơn các cặp mồi khác.
Kết quả phản ứng multiplex PCR phát hiện
ra 31 mẫu trong tổng số 251 mẫu bệnh phẩm
của các bệnh nhân tham gia nghiên cứu có
kết quả dương tính, chiếm 12,35%.
Hình 3. Tỷ lệ các bệnh nhân dương tính với phản ứng Multiplex PCR
theo lứa tuổi, nơi sống, tình trạng hôn nhân và nghề nghiệp
TCNCYH 83 (3) - 2013
31
nguon tai.lieu . vn
PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX - PCR
PHÁT HIỆN VI KHUẨN CHLAMYDIA TRACHOMATIS
Nguyễn Ngọc Chỉnh1, Phạm Đăng Bảng2, Trần Hậu Khang2, Đặng Xuân Nghiêm1
1
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, 2Trường Đại học Y Hà Nội
Nghiên cứu được tiến hành nhằm phát triển phương pháp multiplex PCR phát hiện nhanh và chính xác vi
khuẩn Chlamydia trachomatis. Các mẫu bệnh được khảo sát là của các bệnh nhân tới khám chữa bệnh tại
bệnh viện Phụ sản Bắc Giang từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2011. Điều kiện tối ưu của phản ứng PCR nhằm
phát hiện các đoạn DNA đặc thù của Chlamydia trachomatis bằng 5 cặp mồi CtP, CtM, CtR, NO, Chlamp và
cặp mồi đối chứng dương AR, đã được khảo sát và cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu của từng cặp mồi nằm
trong khoảng từ 53oC đến 57oC. Đồng thời, điều kiện tối ưu cho phản ứng Multiplex PCR với 4 cặp mồi: CtP,
NO, Chlamp và AR đã được xác định là 56oC. Kết quả khảo sát tỷ lệ nhiễm bệnh ở các bệnh nhân đến khám
phụ khoa ở bệnh viện Phụ sản Bắc Giang cho thấy có 31 mẫu dương tính trong số 251 mẫu nghiên cứu,
chiếm 12,35%.
Từ khóa: chẩn đoán nhanh, Chlamydia trachomatis, Multiplex PCR
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh nhiễm khuẩn đường sinh dục do vi
phương pháp có độ chính xác cao. Ratti và
khuẩn Chlamydia trachomatis (C. trachomatis)
cộng sự (1991) dùng cặp mồi Chlamp để xác
định vi khuẩn C. trachomatis [2]. Năm 1993,
là bệnh phổ biến trên toàn Thế giới và có mức
độ lây nhiễm cao. Theo Tổ chức Y tế Thế giới,
Roosendaal và cộng sự đã so sánh độ nhạy
của phương pháp chuẩn đoán bằng PCR, sử
mỗi năm có khoảng 90 triệu người mắc bệnh
do nhiễm vi khuẩn này. Nhiễm C. trachomatis
dụng 4 cặp mồi AR, CtM, CtR, CtP để xác
định vi khuẩn C.trachomatis [3]. Đến năm
là nguyên nhân gây viêm vùng chậu, với
khoảng 80% nữ giới và 70% nam giới nhiễm
2006, Viroj cùng các cộng sự đã dùng cặp mồi
C. trachomatis không biểu hiện triệu chứng,
NLO để xác định các mẫu bệnh [1]. Mục tiêu
nghiên cứu nhằm khảo nghiệm, tối ưu hóa việc
đây là nguyên nhân bệnh lây bệnh ra cộng
đồng [1]. Vi khuẩn C. trachomatis là vi khuẩn
ứng dụng các cặp mồi đã công bố để phát hiện
vi khuẩn C. trachomatis bằng phương pháp
kí sinh nội bào, bệnh ít biểu hiện ra bên ngoài
nên cần có biện pháp phát hiện nhanh vi
PCR; phát triển phương pháp multiplex PCR
phát hiện vi khuẩn C. trachomatis và xác định
khuẩn để có biện pháp chữa kịp thời tránh gây
tỷ lệ nhiễm C. trachomatis tại Bắc Giang bằng
biến chứng cho các bệnh nhân. Việc sử dụng
các cặp mồi đã nghiên cứu và công bố trên
phương pháp multiplex PCR.
thế giới để phát triển thành kít phát hiện vi
khuẩn C. trachomatis ở các bệnh nhân là
Địa chỉ liên hệ: Đặng Xuân Nghiêm, khoa Công nghệ sinh
học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
Email: dxnghiem@hua.edu.vn
Ngày nhận: 12/01/2013
Ngày được chấp thuận: 20/6/2013
TCNCYH 83 (3) - 2013
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng
20 mẫu DNA của vi khuẩn C. trachomatis
thu thập và tách chiết tại Bệnh viện Da liễu
Trung Ương được sử dụng để tối ưu hóa
phản ứng PCR, 251 mẫu bệnh phẩm của các
bệnh nhân nữ đến khám phụ khoa tại bệnh
viện Phụ sản Bắc Giang tình nguyện tham gia
27
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
nghiên cứu từ ngày 15/03/2011 đến ngày
vortex 30 giây, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.
13/05/2011.
Sau đó, 200µl chloroform được thêm vào và
trộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong ống
2. Phương pháp
2.1. Phương pháp thu thập mẫu
eppendorf chuyển thành màu trắng đục, hỗn
hợp được ly tâm ở 4oC, 13000 vòng/phút
Mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân nữ
tham gia nghiên cứu được thu thập qua hai
trong 10 phút. Dịch nổi được chuyển vào ống
eppendorf mới có sẵn 600µl isopropanol lạnh,
dạng: nước tiểu và mẫu quệt cổ tử cung.
Mẫu được bảo quản trong ống eppendorf có
trộn đều và ủ -20oC 30 phút. DNA được thu
đệm PBS (Phosphate-buffered saline) và ly
tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút trong 4oC
bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 10
phút và rửa bằng 900µl ethanol 70%, để khô
để thu các tế bào trong mẫu bệnh. Sau đó các
ethanol ở nhiệt độ phòng và hòa tan bằng
50µl dung dịch đệm TE 10mM, pH 8. Mẫu
tế bào được rửa bằng đệm PBS và bảo quản
ở - 20oC.
DNA được bảo quản ở - 20oC [4].
Phương pháp sử dụng proteinase K và
2.2. Phương pháp tách chiết DNA
Phương pháp sử dụng Trizol: 200 µl mẫu
được trộn đều với 900 µl dung dịch Trizol pH 8,
phương pháp đun sôi được tiến hành theo
nghiên cứu của Jenab và cộng sự (2010) [5].
2.3. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR,
Multiplex PCR
Bảng 1. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu
Vị trí đoạn gen
được nhân
Tên mồi
Kích thước
(bp)
Trình tự mồi (5’ – 3’)
Chlamp - 1
CCAAAGCTATTCAAAATCGGAGCTCTAAGA
Chlamp - 4
GTCTTCTGCTTACAATGCTCTTGCATATTA
610 - 612
Nhiễm sắc thể
vi khuẩn
NLO
ATGAAAAAACTCTTGAAATCG
NRO
CTCAACTGTAACTGCGTATTT
AR1
GGCGGTGACGGAGCTGGGGCG
AR2
CGCCGCTGCACTGTGAAGCTC
CtP1
TAGTAACTGCCACTTCATCA
CtP2
TTCCCCTTGTAATTCGTTGC
CtM1
GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCCTC
1128
DNA người
153
Plasmid
Gen MOMP
trên NST
vi khuẩn
201
129
CtM2
CCAAGTGGTGCAAGGATCGCA
CtR1
GTGGATAGTCTCAACCCTAT
CtR2
CCCTAAGTGTTGGCAACTAA
Riboxôm
28
310
TCNCYH 83 (3) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Để đánh giá độ nhạy và tiềm năng xác định
2.4. Khảo sát tỷ lệ nhiễm bệnh ở Bắc Giang
mẫu bệnh phẩm có nhiễm vi khuẩn C. tracho-
Nghiên cứu tiến hành khảo sát 251 mẫu
bệnh thu thập tại bệnh viện Phụ sản Bắc
matis bằng phản ứng PCR, 5 cặp mồi nghiên
cứu và cặp mồi đối chứng dương đã được sử
dụng (bảng 1). Mỗi cặp mồi nhân các đoạn
DNA khác nhau của vi khuẩn C. trachomatis,
ngoại trừ cặp AR là đối chứng dương trong
phản ứng PCR, nhân một trình tự của HLA
người - đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên
bạch cầu HLA lớp 2 trong tế bào người. Trong
Giang. Các mẫu bệnh được tách chiết DNA và
chạy multiplex PCR. Nếu phản ứng multiplex
PCR dương tính thì mẫu bệnh có chứa vi
khuẩn C. trachomatis, nếu không phản ứng
mẫu bệnh được kết luận không chứa vi khuẩn
gây bệnh.
III. KẾT QUẢ
mỗi xét nghiệm, đoạn DNA sản phẩm do cặp
mồi AR phải luôn được nhân lên để xác định
DNA được tách từ mẫu bệnh phẩm thành
công. Đồng thời, DNA khuôn tách chiết từ các
mẫu của người đã biết chắc chắn mang bệnh
và không mắc bệnh cũng được chạy cùng
như một đối chứng dương và âm tương ứng.
Cặp mồi Chlamp, NO nhân đoạn DNA trên
nhiễm sắc thể của vi khuẩn [6; 7], cặp mồi CtP
nhân đoạn DNA trên plamid 7,5 kb phổ biến,
1. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu bệnh
DNA tổng số của các mẫu bệnh được tách
chiết theo 3 phương pháp khác nhau: phương
pháp sử dụng Trizol, phương pháp sử dụng
protein K và phương pháp đun sôi. Nồng độ
và chất lượng DNA tổng số đã được kiểm tra
bằng máy đo quang phổ hấp thụ và điện di.
Kết quả của nhiều thí nghiệm lặp lại cho thấy
phương pháp sử dụng Trizol cho chất lượng
CtR nhân đoạn DNA của gen mã hóa riboxôm
và số lượng DNA tốt nhất. Ngoài ra, mẫu bệnh
phẩm là tế bào thu từ ly tâm nước tiểu cho kết
16S, cặp mồi CtM nhân đoạn DNA không biến
quả tách chiết kém hơn so với mẫu dịch tiết
đổi của gen mã hóa protein trên màng tế bào
cổ tử cung. Độ nhạy khi xét nghiệm các bệnh
phẩm bằng nước tiểu thấp hơn nhiều so với
của vi khuẩn C. trachomatis [3].
bệnh phẩm là mẫu quệt cổ tử cung.
Thành phần PCR: PCR buffer (50 mM KCl,
1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris - HCl pH = 8,3);
200 µM mỗi loại dNTP (dATP, dTTP, dGTP,
dCTP); 50 pmol cho mỗi mồi và 1 U Taq polymerase. Trong phản ứng Multiplex PCR, để
phản ứng tối ưu, mỗi phản ứng Multiplex PCR
cũng có 200 µM mỗi loại dNTP, 1,5 mM MgCl2
2. Kết quả kiểm nghiệm điều kiện tối ưu
để chạy mỗi cặp mồi
Mỗi cặp mồi nghiên cứu nhân các đoạn
DNA khác nhau có kích thước khác nhau.
Qua khảo sát với các DNA khuôn từ mẫu
bệnh đối chứng dương tách chiết bằng kít
chuẩn
IVA
pDNA Extraction Kit - Code VA.A92-
và 50 pmol cho mỗi mồi. Chu trình nhiệt: 95oC
002A, các điều kiện khác nhau về thành phần
5 phút, 95oC 1 phút, 50 - 60oC 2 phút, 72oC
Mg2+, hàm lượng dNTP, thời gian bắt cặp
o
1,5 phút, lặp lại 35 chu kỳ, kết thúc 72 C trong
của các cặp mồi cho ta thấy kết quả khác
10 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel
nhau không có ý nghĩa. Tuy nhiên, hình 1
agarose 2,5%.
cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu của mỗi cặp
mồi là khác nhau.
TCNCYH 83 (3) - 2013
29
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Hình 1. Sản phẩm PCR của các cặp mồi nghiên cứu
Nhiệt độ tối ưu cho các cặp mồi đã được
và kích thước sản phẩm PCR, phản ứng
nghiên cứu và lựa chọn dựa theo các nghiên
cứu của Ratti cùng cộng sự (1991), Roosen-
multiplex PCR được tiến hành xây dựng để
phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn C.
daal cùng cộng sự (1993), Viroj cùng cộng sự
(2006). Trong nghiên cứu này, nhiệt độ tối ưu
trachomatis. 4 cặp mồi, AR, CtP, Chlamp và
NO, có nhiệt độ gắn mồi gần giống nhau được
đã được xác định lại riêng cho từng cặp mồi
như sau: cặp mồi AR, NO, CtR, CtM có nhiệt
chọn để chạy phản ứng multiplex PCR. Nhiệt
độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR được
độ gắn mồi tối ưu là 55oC, cặp mồi Chlamp có
khảo sát lại ở dải nhiệt độ từ 47oC tới 56oC và
nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 53oC và cặp mồi
CtP có nhiệt độ gắn mồi tốt nhất ở 57oC. Như
kết quả được thể hiện trong hình 2.
vậy, nhân tố nhiệt độ bắt cặp ảnh hưởng
mạnh tới kết quả của phản ứng PCR. Hình 1
còn cho thấy, ngoại trừ mồi AR, các cặp mồi
nghiên cứu đều rất nhạy và cho ra các sản
phẩm rõ nét, đúng kích thước. Sản phẩm PCR
của 5 cặp mồi cũng đã được khẳng định là
DNA của C. trachomatis bằng việc cắt bằng
enzyme giới hạn thích hợp và giải trình tự.
Việc khảo sát này được thực hiện nhằm tìm ra
các cặp mồi tốt nhất, có nhiệt đội gắn mồi tối
ưu gần giống nhau để dùng trong phản ứng
multiplex PCR.
3. Kết quả multiplex PCR
Dựa vào kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi
30
Hình 2. Sản phẩm phản ứng Multiplex PCR
với 4 cặp mồi: AR, CtP, Chlamp và NO
M: Thang DNA 100 bp; 1: 47oC; 2: 50oC;
3: 53oC; 4: 56oC
TCNCYH 83 (3) - 2013
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Nhiệt độ gắn mồi tốt nhất cho phản ứng
o
Multiplex PCR là 56 C.
4. Kết quả khảo sát các mẫu bệnh từ
bệnh viện Phụ sản Bắc Giang
Trong nghiên cứu này, có 251 mẫu bệnh
phẩm của các bệnh nhân được thu thập. Căn
cứ vào nhóm tuổi, tình trạng hôn nhân, quê
quán và nghề nghiệp, các bệnh nhân được
phân ra nhiều các nhóm nhỏ khác khác nhau
theo đặc điểm trên.
Đáng ngạc nhiên là các phản ứng multiplex
PCR với các mẫu nghiên cứu hoặc cho sản
phẩm đầy đủ của các cặp mồi thành phần với
độ nét cao hoặc không có bất kỳ sản phẩm
nào ngoài DNA do cặp mồi AR nhân lên. Kết
quả này có sự khác biệt với công bố của
Roosendaal cùng cộng sự (1993) rằng cặp
mồi CtP có độ nhạy cao hơn các cặp mồi khác.
Kết quả phản ứng multiplex PCR phát hiện
ra 31 mẫu trong tổng số 251 mẫu bệnh phẩm
của các bệnh nhân tham gia nghiên cứu có
kết quả dương tính, chiếm 12,35%.
Hình 3. Tỷ lệ các bệnh nhân dương tính với phản ứng Multiplex PCR
theo lứa tuổi, nơi sống, tình trạng hôn nhân và nghề nghiệp
TCNCYH 83 (3) - 2013
31